KR101192724B1 - 마이크로알엔에이의 발현을 조절하여 ｎｋ 세포를 활성화시키는 방법 - Google Patents

마이크로알엔에이의 발현을 조절하여 ｎｋ 세포를 활성화시키는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 NK 세포(natural killer cell; NK cell) 활성화용 조성물 또는 상기 조성물을 이용하여 NK 세포를 활성화시키는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 NK 세포에서 miR-27a*이 Prf1 및 GzmB 단백질 발현 결합 부위 서열 특이적으로 조절하여 NK 세포의 표적 세포 살상능을 음성적으로 조절하는 것을 확인하였으므로, miR-27a*의 발현 또는 활성을 억제하는 조성물을 NK 세포의 세포 살상능 증진용 조성물로 유용하게 사용할 수 있으며, 상기 조성물을 이용하여 활성화된 NK 세포는 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

마이크로알엔에이의 발현을 조절하여 ＮＫ 세포를 활성화시키는 방법{Activation method for Natural killer cell via regulating microRNA expression}
본 발명은 단백질 발현을 조절하는 항암제에 관한 것이다.
면역체계를 구성하는 세포들 중 특히, NK 세포(natural killer cell, 이하 NK 세포라 약칭함)는 비특이적으로 암세포를 살상할 수 있는 능력이 밝혀지면서 많은 연구가 진행되었으며, NK 세포의 분화와 활성의 결함은 유방암(Breast Cancer Res . Treat ., 66: 255-263, 2003), 흑색종암(Melanoma Res., 13: 349-356, 2003), 폐암(Lung Cancer, 35: 23-18,2002) 등 다양한 질병들과 관련 되어 있음이 밝혀졌다. 이러한 연구들을 바탕으로 암 치료에 NK 세포를 이용하는 NK 세포 치료법이 대두되고 있다. 현재까지는 주로 프라이밍(priming), 활성화(activation), 면역 시냅스 형성(immune synapse formation), 트래피킹(trafficking)과 같은 다양한 과정에서의 신호전달 기작의 이해와 이를 조절하는 기술을 개발하는 데 초점이 맞추어졌다. NK 세포를 이용한 효율적인 면역세포치료는 기존의 기술뿐만이 아니라, NK 세포 세포독성을 조절하는 새로운 메카니즘을 규명하고, 이를 조절하는 새로운 분자들을 탐색하는 것이 절실한 상황이다.
NK 세포는 숙주에 감염된 병원균 또는 암에 대항하기 위한 선천성 면역 반응(Innate immune response)과 사이토카인 분비를 통한 후천성 면역 반응(Adaptive immune response)에 중요한 역할을 한다(Nat Immunol ., 9: 495-502, 2008; Nat Immunol., 9: 486-494, 2008; Annu Rev Immunol., 22: 405-429, 2004; Immunity 26: 798-811, 2007). NK 세포가 표적 세포를 살상하는데 사용하는 주된 메커니즘은 퍼포린(perforin) 및 그랜자임 B(granzyme B)와 같은 세포 용해성 과립(lytic granule)을 면역 시냅스(immune synapse)를 통하여 표적 세포에 분비하는 것이다(Immunity 26: 798-811, 2007). 분비된 퍼포린은 표적 세포벽에 구멍을 만들고, 구멍을 통하여 표적 세포 내로 들어간 그랜자임은 표적 세포의 아폽토시스(apoptosis)를 일으키게 된다(I Voskoboinik et al ., Nat Rev Immunol ., 6:940-952, 2006). 또한, NK 세포는 IFN-γ를 생성하여 분비하는 능력을 갖고 있다. IFN-γ는 대식세포를 활성화시키는 중요한 역할을 담당하고, 선천성 면역반응에서 후천성 면역반응으로의 연결 역할을 담당하며, 암세포와 바이러스에 감염된 세포의 증식을 억제시키는 사이토카인이다(CA Biron et al ., Annu Rev Immunol ., 17:189-220, 1999). NK 세포가 이러한 능력을 갖추기 위해서는 표적 세포를 만나기 전 분화 자극(priming)이 필요하다. 그렇기 때문에 마우스와 사람에게서 분리해낸 초대배양 NK 세포는 암세포 살상 능력과 IFN-γ 생성능력이 현저히 감소되어 있다. 이러한 NK 세포의 능력을 극대화시켜줄 수 있는 분화 자극 사이토카인으로 IL-2와 IL-15이 있으며, 그 중에서 IL-15이 NK 세포의 활성에 있어서 필수적인 사이토카인으로 보고되어 있다(M Lucas et al ., Immunity, 26:503-517, 2007). 그러므로, NK cell의 세포독성(Cytotoxicity)에 필수적인 이펙터(effector) 분자인 Prf1 및 Gzms의 발현을 조절하는 분자를 탐색하는 것은 중요하다.
마이크로알엔에이(MicroRNA)는 세포질 내 Dicer1과 핵 내 Drosha라고 불리는 두 종류의 리보뉴클레아제(ribonuclease)의해 만들어지는 프라이머리(primary) miRNA로서 작은 비번역 RNA(19-22 nt)이다. 동물세포에서 성숙된 miRNA는 특이적인 표적 mRNA의 3' 비번역부위(UTR)에 RNA-유도 사일런싱 복합체를 만들어 표적 mRNA 분해 또는 표적단백질의 번역 억제(translational suppression)로 인해 유전자 발현을 감소시킨다(Nat Rev Immunol ., 8: 120-130, 2008; Cell 136: 26-36, 2009; J Exp Med ., 205: 585-594, 2008).
조혈줄기세포로부터 유래된 면역반응과 면역세포분화에서 miRNA와의 관련성은 Argonaute(Genes Dev ., 21: 1999-2004, 2007), Drosha(Exp Med., 205: 2005-2017, 2008), Dicer(J Exp Med., 203: 2519-2527, 2006 ; J Exp Med ., 202: 261-269, 2005;J Exp Med., 205: 1993-2004, 2008)과 같은 miRNA 합성에 관련된 분자의 결핍 또는 특이적 miRNA 수준의 조절을 통해 널리 확인되었다. 상기 결과는 miRNA가 면역세포 분화 및 기능에 중요한 역할을 하고 있음을 뒷받침하고 있다(Nat Rev Immunol ., 8: 120-130, 2008; Cell 136: 26-36, 2009; NatImmunol., 9: 839 145, 2008). 하지만, NK 세포에서 miRNA의 생물학적 중요성은 명확하게 밝혀지지 않았다. NK 세포를 이용한 치료법을 적용함에 있어 NK 세포의 세포독성(cytotoxicity)을 조절하는 새로운 표적분자의 발견이 대두되어 오고 있다(Nat Immunol., 9: 486-494, 2008; Nat Rev Immunol., 7: 329-339, 2007).
이에, 본 발명자들은 in vitro에서 인간의 miR-27a*가 NK 세포의 세포독성(cytotoxicity)과 밀접한 Prf1 및 GzmB의 3'UTR 염기서열에 특이적으로 결합하여 표적 단백질 발현량을 감소시키고, 실제적으로 in vivo에서 인간의 암을 인위적으로 유도한 이종이식 모델 마우스에서 miR-27a*의 발현을 증가 또는 억제시킨 NK 세포의 주입으로 인해 암의 크기가 급격히 증가 또는 감소됨을 각각 확인함으로써, miR-27a* 억제제를 통해 NK 세포를 활성화 시키고, 이를 이용해 암을 치료할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 MicroRNA-27a*의 표적 단백질인 Prf1 및 GzmB의 발현조절을 통한 NK 세포의 세포독성 조절 메카니즘을 규명함으로써, microRNA를 항암 면역세포치료법의 새로운 표적 분자로 적용하고자 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 17로 기재되는 염기서열을 갖는 miR-27a*의 억제제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현벡터를 시험관 내 조건에서 NK 세포에 형질도입하는 단계를 포함하는, 세포독성이 증가된 NK 세포 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 miR-27a*가 결합하는 부위에 돌연변이를 포함하는 서열번호 37 또는 서열번호 40으로 기재되는 핵산 서열을 포함하는 발현벡터를 시험관 내 조건에서 NK 세포에 형질도입하는 단계를 포함하는, 세포독성이 증가된 NK 세포 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) miR-27a*을 발현하는 세포에 피검화합물을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 처리된 세포에서 miR-27a*상의 발현량을 측정하는 단계; 및,
3) 대조군과 비교하여 상기 단계 2)에서 miR-27a* 의 발현량이 감소된 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 항암제의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 활성화시킨 NK 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 NK 세포를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 서열번호 17로 기재되는 염기서열을 갖는 miR-27a*의 억제제를 유효성분으로 함유하는 NK 세포 활성화용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서는 NK 세포에서 miR-27a*에 의해 Prf1 및 GzmB 단백질의 발현이 조절되는 것을 확인하였고, miR-27a*의 발현을 억제하였을 때 Prf1 및 GzmB 단백질의 발현이 증가하여 in vitro 뿐만 아니라 in vivo에서도 자연 살해 살해 세포의 활성이 증가되는 것을 확인하였으므로, miR-27a* 억제제를 NK 세포 활성화용 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있으며, 상기 조성물로 활성화된 NK 세포는 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1a은 인간의 mNK 세포에 IL-15(30 ng/㎖)을 처리한 다음, Prf1 및 GzmB 단백질 발현량을 면역블롯을 통해 도식화하고, 도식화된 비율을 막대그래프로 나타낸 것이고,
도 1b는 인간의 mNK 세포에 IL-15(30 ng/㎖)을 처리한 다음, 세포를 회수하여 Cr 방출 분석를 통해 세포독성을 측정하여 그래프로 나타낸 것이고,
도 1c는 인간의 mNK 세포에 IL-15(30 ng/㎖)을 처리한 다음, Prf1 및 GzmB mRNA 발현량을 실시간 qPCR을 통해 그래프로 나타낸 것이고,
도 1d는 인간의 mNK 세포에 IL-15(30 ng/㎖)을 처리한 다음, IFN-γ의 mRNA 발현량을 실시간 qPCR을 통해 흰색 막대그래프로 나타내고, 세포로부터 방출되는 IFN-γ 단백질 양을 ELISA를 통해 검은색막대그래프로 나타낸 것이고,
도 1e는 세포독성이 없는 NK 세포에 Agilent Human whole genome 4×44K gene-expression microarray를 이용하여 Microarray signal intensity(mean ± SD)를 통해 Prf1, GzmB, GzmA, GAPDH 및 IFN-γ의 mRNA 발현량을 표기한 것이고,
도 1f는 인간의 mNK 세포에 IL-15(30 ng/㎖)을 24시간 동안 처리한 다음, 반-정량적 PCR을 통해 Prf1, GzmB, GzmA 및 GAPDH의 mRNA 발현량과(상단), 면역블롯을 통해 Prf1, GzmB, GzmA 및 GAPDH의 단백질 발현량을 나타낸 것이고(하단),
도 2a는 인간의 mNK 세포에 IL-15(30 ng/㎖)을 24시간 동안 처리한 다음, 대조군 siRNA(Consi) 또는 Dicer1 siRNA을 형질도입하여 면역블롯을 통해 Dicer1, Prf1, GzmB, GzmA 및 GAPDH의 단백질 발현량을 나타낸 것이고,
도 2b는 인간의 mNK 세포에 IL-15(30 ng/㎖)을 처리한 다음, 대조군 siRNA 또는 Dicer1 siRNA을 형질도입하여 24시간 동안 배양한 후 실시간 qPCR을 통해 Dicer1, Prf1, GzmB, GzmA 및 GAPDH의 mRNA 발현량을 막대그래프로 나타낸 것이고,
도 2c는 인간의 mNK 세포에 IL-15(30 ng/㎖)을 처리한 다음, 대조군 siRNA 또는 Dicer1 siRNA을 형질도입하여 24시간 동안 배양한 후 세포를 회수하여 Cr 방출 분석를 통해 세포독성을 측정하여 꺽은선 그래프로 나타낸 것이고,
도 3a는 인간의 mNK 세포에 IL-15(30 ng/㎖)을 처리하여 실시간 qPCR을 통해 시간에 따른 miRNAs(miR-15a, miR-204, miR-27a*)의 발현량을 꺽은선 그래프로 나타낸 것이고,
도 3b는 miRNAs(miR-15a, miR-204, miR-27a*)가 표적단백질인 Prf1 및 GzmB의 3'UTR 부분에 결합할 것으로 예상되는 부분을 나타낸 것이고,
도 3c는 인간의 mNK 세포에 형질도입된 miRNAs(miR-15a, miR-204, miR-27a*)가 표적단백질인 Prf1 및 GzmB 단백질 발현을 조절함을 보기 위해 면역블롯을 통해 Prf1, GzmB, GAPDH의 단백질 발현량을 나타낸 것이고(상단), 세포를 회수하여 Cr 방출 분석를 통해 세포독성을 측정하여 막대 그래프로 나타낸 것이고(하단),
도 3d는 인간의 mNK 세포에 miRNAs(miR-27a*)을 형질도입하여 표적단백질인 Prf1 및 GzmB 단백질 발현을 보기 위해 면역블롯을 통해 Prf1, GzmB, GAPDH의 단백질 발현량을 나타낸 것이고(상단), 인간의 mNK 세포에 miRNAs(miR-27a*) 억제제를 형질도입하여 표적단백질인 Prf1 및 GzmB 단백질 발현을 보기 위해 면역블롯을 통해 Prf1, GzmB, GAPDH의 단백질 발현량을 나타낸 것이고(하단),
도 3e는 인간의 mNK 세포에 형질도입된 miRNAs(miR-27a*), miRNAs(miR-27a*) 억제제, 대조군 miRNA(Ctrl-miR)가 NK 세포의 세포독성에 영향이 없이 NK 세포 표적 단백질인 Prf1 및 GzmB 단백질 발현을 조절함을 보기 위해 면역블롯을 통해 Prf1, GzmB, p-ERK, ERK 및 GAPDH의 단백질 발현량을 나타낸 것이고(상단), IFN-γ의 단백질 발현을 ELISA를 통해 막대그래프로 나타낸 것이고(중간), 세포를 회수하여 Cr 방출 분석를 통해 세포독성을 측정하여 막대 그래프로 나타낸 것이고(하단),
도 4a는 miRNAs(miR-27a*)의 표적단백질인 Prf1 및 GzmB의 3'UTR 부분에 결합하는 miR-27a*의 염기서열과 돌연변이(M)된 염기서열을 나타낸 것이고(상단), miR-27a*의 표적단백질인 Prf1 및 GzmB의 의 3'UTR 부분에 miR-27a*가 안정하게 결합하는 부위(WT), 결합하는 부분이 결실된 부위(D1와D2), 결합하는 부분이 돌연변이된 부위(M)를 나타낸 것이고(하단),
도 4b는 pcAANAT 리포터 벡터에 miR-27a*의 표적 단백질인 Prf1 및 GzmB의 3'-UTR 부분에 miR-27a*가 안정하게 결합하는 부위(WT), 3'-UTR의 순차적인 결실(D1 와 D2), 결합하는 부분이 돌연변이된 부위(M)가 클로닝된 형태를 나타낸 것이고,
도 4c는 HEK293T 세포에 pcAANAT 리포터 벡터에 결합된 Prf1 및 GzmB의 3'-UTR 부분에 miR-27a* 가 안정하게 결합하는 부위(WT)와 miR-27a* 또는 miR-27a* 억제제가 동시에 형질도입 시킨다음, 리포터 유전자인 AANAT의 발현량을 보기 위해 면역블롯을 통해 AANAT와 GAPDH 단백질 발현량을 나타낸 것이고(상단), 실시간 qPCR을 통해 AANAT mRNA 발현량을 막대그래프로 나타낸 것이고(하단),
도 4d는 HEK293T 세포에 pcAANAT 리포터 벡터에 결합된 Prf1 및 GzmB의 3'-UTR 부분에 miR-27a* 가 안정하게 결합하는 부위(WT) 또는 결합하는 부분이 결실된 부위(D1 와 D2)와 miR-27a*를 동시에 형질도입 시킨 다음, 리포터 유전자인 AANAT의 발현량을 보기 위해 면역블롯을 통해 AANAT와 GAPDH 단백질 발현량을 나타낸 것이고(상단), 이러한 발현량을 막대그래프로 나타낸 것이고(중간), 실시간 qPCR을 통해 AANAT mRNA 발현량을 막대그래프로 나타낸 것이고(하단),
도 4e는 HEK293T 세포에 pcAANAT 리포터 벡터에 결합된 Prf1 및 GzmB의 3'-UTR 부분에 miR-27a*가 안정하게 결합하는 부분이 돌연변이된 부위(M)와 miR-27a* 또는 miR-27a*돌연변이을 동시에 형질도입시킨 다음, 리포터 유전자인 AANAT의 발현량을 보기 위해 면역블롯을 통해 AANAT와 GAPDH 단백질 발현량을 나타낸 것이고,
도 5a는 IL-15이 처리되지 않은 상태에서 NK 세포에 대조군 miRNA(Ctrl-miR), miR-27a* 또는 miR-27a* 억제제(inhi)를 처리하여 Prf1 및 GzmB의 단백질 발현량을 보기 위해 면역블롯을 통해 Prf1, GzmB, GAPDH의 단백질 발현량을 나타낸 것이고(상단), 세포를 회수하여 Cr 방출 분석를 통해 세포독성을 측정하여 막대 그래프로 나타낸 것이고(하단),
도 5b는 인간의 mNK 세포에 IL-15를 농도별(0, 30, 60 ng/㎖)로 6 시간 동안 처리한 다음, miR-27a* 의 발현량을 miRNA　PCR을 통해 막대그래프로 나타낸 것이고(상단), 실시간 qPCR을 통해 Prf1 및 GzmB의 mRNA 발현량을 막대그래프로 나타낸 것이고(하단),
도 5c는 인간의 mNK 세포에 IL-15를 농도별(0, 30, 60 ng/㎖)로 6 시간 동안 처리한 다음, Prf1 및 GzmB의 단백질 발현량을 면역블롯을 통해 Prf1, GzmB 및 GAPDH의 단백질 발현량을 나타낸 것이고(상단), 세포를 회수하여 Cr 방출 분석를 통해 세포독성을 측정하여 막대 그래프로 나타낸 것이고(하단),
도 5d는 인간의 mNK 및 NK92 세포에 IL-15(30 ng/㎖)로 6 시간 동안 처리한 다음, Prf1 및 GzmB의 단백질 발현량을 면역블롯을 통해 Prf1, GzmB, GAPDH의 단백질 발현량을 나타낸 것이고(상단), 반-정량적 PCR을 통해 Prf1, GzmB 및 GAPDH의 mRNA 발현량을 나타낸 것이고(중간), miR-27a* 의 발현량을 miRNA　PCR을 통해 막대그래프로 나타낸 것이고(하단),
도 6a는 인간의 탯줄로부터 유래된 제대혈(umbilical cord blood, UCB)로부터 추출된 초대 NK 세포를 형광세포분석기(Flow Cytometer, FACS)을 통해 전체 세포수에 대한　NK 세포의 표지마커인 CD56 및 CD16을 동시에 가진 세포수를 %로 나타낸 모식도이고,
도 6b는 초대 NK 세포에 형질도입된 miR-27a* 자체가 Prf1 및 GzmB의 단백질 발현을 조절함을 보기 위해, 면역블롯을 통해 Prf1, GzmB, ERK 및 GAPDH의 단백질 발현량을 나타낸 것이고(상단), 세포를 회수하여 Cr 방출 분석를 통해 세포독성을 측정하여 막대 그래프로 나타낸 것이고(하단),
도 7a는 miR-27a*이 표적단백질인 Prf1 및 GzmB의 단백질 발현을 음성적으로(negatively) 조절한다는 것을 도식화것이고,
도 7b는 인위적으로 인간의 대장암세포인 SW620을 피하에 주입한 인간 암 이종이식 마우스(human tumor xenografts mice)(n=5)에 정맥주사로 mNK 세포에 형질도입된 대조군 miRNA(Ctrl-miR), miR-27a* 또는 miR-27a* 억제제(miR-27a*inhi)을 주입하여, 음성적 대조군(PBS), 양성적 대조군(Doxorubicin)에 비교하여 종양 크기변화를 비교한 것을 나타낸 모식도이고,
도 7c는 도 7b과 같이 처리한 기간이 22일이 될 때까지 날짜별(Day)로 마우스의 종양 크기변화를 꺽은선 그래프를 모식화 것이고,
도 7d는 도 7b과 같이 처리한지 22일째, 각각 5마리의 마우스에서 종양 크기변화의 평균을 나타낸 것이고,
도 7e는 도 7b와 같이 처리한 다음 시간에 따라 음성대조군인 PBS에 비해 mNK 세포에 형질도입된 대조군 miRNA(Ctrl-miR), miR-27a* 또는 miR-27a* 억제제(miR-27a*inhi)가 주입된 마우스에서의 종양 크기의 억제 비율(inhibition rate)을 % 로 나타낸 꺽은선 그래프를 모식화한 것이고,
도 7f는 도 7b와 같이 처리한 다음 시간에 따라 체중을 비교한 것을 나타낸 꺽은선 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 17로 기재되는 염기서열을 갖는 miR-27a*의 억제제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현벡터를 시험관 내 조건에서 NK 세포에 형질도입하는 단계를 포함하는, 세포독성이 증가된 NK 세포의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 miR-27a*가 결합하는 부위에 돌연변이를 포함하는 서열번호 37 또는 서열번호 40으로 기재되는 핵산 서열을 포함하는 발현벡터를 시험관 내 조건에서 NK 세포에 형질도입하는 단계를 포함하는, 세포독성이 증가된 NK 세포 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서 본 발명자들은 휴지기 및 활성화된 mNK 세포에서 세포내 내재된 Prf1 및 GzmB의 조절 메카니즘을 밝히기 위하여 GzmA, GzmB, Prf1의 발현을 확인해 보았다. 휴지기와 활성화된 mNK 세포 모두에서 많은 양이 존재하는 GzmA와 대조적으로 Prf1 및 GzmB은 IL-15를 처리 한지 24시간에서 단백질 발현양이 매우 증가하였으며(도 1a 및 도 1f 참조), NK 세포의 살상능력(killing ability)도 증가하였다(도 1b 참조). 놀랍게도, Prf1 및 GzmB의 mRNA 의 발현양은 IL-15 처리 한지 6시간에서 증가함으로써 단백질 발현과 시간적 차이를 보였다(도 1c 참조). 이러한 실험결과로 본 발명자들은 Prf1 및 GzmB의 mRNA 발현 증가와 단백질 발현 증가사이에 시간적인 간격(lag)이 있음을 확인했다(도 1a 및 도 1c 참조). 하지만 이펙터 단백질인 Prf1 및 GzmB가 유도되는 시간간격과 대조적으로 인터페론-감마(IFN-γ) 단백질은 mRNA 발현 증가 시간과 유사하게 mNK 세포와 NK92세포에서 IL-15처리 한지 6시간에서 증가하였다(도 1d 참조). 다음으로 본 발명자들은 Agilent Human whole genome 4×44K gene-expression microarray의 신호 세기를 이용하여 휴지기 NK 세포에서 Prf1 및 GzmB가 억제됨을 확인하게 되었다. 흥미롭게도, 휴지기 NK 세포에서 Prf1 및 GzmB mRNA의 발현양이 GzmA 및 GAPDH 발현양보다 높았다(도 1e 참조). 반-정량적 RT-PCR은 휴지기 NK 세포에서 Prf1 및 GzmB 단백질 발현양이 거의 없음에도 불구하고 mRNA 발현이 높게 나타난다는 것을 보여줌으로써 마이크로어레이를 확인시켜주었다(도 1f 참조). 상기 실험 결과를 토대로, 본 발명자들은 Prf1 및 GzmB 단백질 발현이 휴지기와 활성화 시기 모두에서 잘 알려지지 않은 전사 후 조절(post-transcriptional regulation) 메카니즘에 의해 억제되고 있음을 제안하게 되었다.
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서 본 발명자들은 Prf1 및 GzmB 단백질의 발현이 억제되는 이유가 번역(translation)의 억제 메카니즘의 하나인 miRNA에 의해 일어나는 유전자 사일런싱(gene silencing) 때문이라는 가설을 증명하고자, mNK 세포에서 miRNA의 생성에 필수적인 효소인 Dicer의 발현을 억제시켰다. Dicer1 siRNA가 형질도입된 mNK 세포는 mRNA 발현양이 차이가 없음에도 불구하고 Prf1 및 GzmB 단백질 발현양이 증가함을 확인하였다(도 2a 및 도 2b 참조). 놀랍게도, NK 세포의 세포독성의 증가와도 일치하였다(도 2c 참조). 하지만, GzmA mRNA와 단백질 발현은 miRNA 생성을 억제함에도 불구하고 변화가 없었다(도 2a 참조). NK 세포에서 Dicer1을 억제함으로써 Prf1 및 GzmB 단백질 발현증가와 세포의 세포독성이 증가되는 효과는 NK92 세포에서도 나타났다. 게다가, Prf1 및 GzmB의 단백질 발현증가는 Dicer를 억제시킨 휴지기 mNK 세포에서도 확인됨으로써, 휴지기 또는 활성시기 모두에서 세포내 miRNA가 Prf1 및 GzmB의 발현양을 조절한다는 것을 제안하였다. 그러나 본 발명자들은 모든 miRNA 생성을 방해하는 Dicer1을 억제시킨 것임으로 Prf1 및 GzmB의 발현을 증가시키는 결과가 일반적인 스트레스 때문 일 수 있다는 가능성에서 벗어나고자, 본 발명자들은 Prf1 및 GzmB 단백질 발현이 세포내 miRNA에 의해 조절된다는 것을 확인하기로 하였다.
Prf1 및 GzmB의 발현을 억제하는 miRNA를 탐색하기 위해서, 본 발명자들은 활성화된 NK 세포로부터 miRNA를 분석을 위한 마이크로어레이 기술을 이용하였다. Prf1 및 GzmB의 키네틱(kinetic) 분석을 토대로(도 1 참조), 본 발명자들은 Prf1 및 GzmB 발현 억제에 관련된 후보 miRNA의 경우, 휴지기 상태에서는 높게 발현되다가 NK 세포가 활성화되면, 그들의 표적 mRNA와 유사하거나 또는 감소된 발현을 보일 것이라고 가정했다. 초기 스크리닝으로 IL-15와 반응하여 발현양이 증가 또는 감소되는 ~25개 miRNAs가 확인되었다. Prf1 및 GzmB에 억제에 영향을 주는 miRNA가 무엇인지 확인하기 위하여, 본 발명자들은 miRNA 표적 예측 알고리즘을 사용하여 중요한 seed 염기서열을 중점으로 Prf1 및 GzmB mRNA에 대한 miRNA의 in silico 서열 상보성 분석을 수행하였다. 이러한 실험결과 IL-15에 의해 유도된 miR-15a, miR-204 및 miR-27a*의 miRNA를 선별하였고, qPCR을 이용하여 키네틱 유도(kinetic induction)이 확인되었다(도 3a 참조). 시간 별 분석은 표적 mRNA의 시간 경과(Time course)와 유사하게 12시간 내에서 피크 증가를 보여주었다. miRNA의 증가된 양은 전사(transcriptional) 유도임을 보여줄수 있는 엑티노마이신(actinomycin D)에 의해 억제되었다.
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서 Prf1 및 GzmB의 3'UTR에서 일치하는 염기서열을 가진 세 개의 miRNA가 실제적으로 Prf1 및 GzmB의 발현을 억제 할 수 있는지 확인하기 위하여, 본 발명자들은 IL-15를 처리하는 동안에 이들 miRNA에 일치하는 합성된 miRNA 미믹스(mimics)를 mNK 세포에 형질도입하였다(도 3b 참조). mNK 세포에 형질도입된 miR-27a*가 mRNA발현에 변화없이 ~60% 정도의 Prf1 및 GzmB의 단백질 발현양의 감소되었다. 그와 동시에 세포의 세포독성도 ~50% 감소되었다. 이와 대조적으로 miR-15a와 miR-204는 Prf1 및 GzmB의 단백질 발현양과 세포의 세포독성에 효과가 없었다(도 3c 참조).
miRNA 기능은 각각의 miRNA에 상보적인 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotides)인 헤어핀 억제제(hairpin inhibitor)에 의해 일시적으로(transiently) 반대작용(antagonize)으로 조절될수 있다. 또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서 Prf1 및 GzmB의 발현이 세포내 존재하는 miR-27a*에 의해 조절되는지를 확인하고자, 본 발명자들은 mNK 세포에 miR-27a* 억제제를 형질도입하였다. 본 발명자들은 mNK 세포에서 세포내 존재하는 miR-27a*가 Prf1 및 GzmB의 발현을 억제 할 것이라고 제안한 바대로, Prf1 및 GzmB의 발현이 강력하게 증가되는 것을 확인하였다. 게다가, miR-27a*와 miR-27a* 억제제의 형질도입은 각각 Prf1 및 GzmB의 발현을 감소시키고 증가시켰으며(도 3d 참조), 농도 의존적으로 NK 세포의 세포독성과 연관되었다. 다음으로 본 발명자들은 miR-27a*에 의해 NK 세포의 세포독성이 음성조절(negative regulation)으로 조절되는것이 NK 세포의 세포독성에 관련된 유전자의 유도라기보다 Prf1 및 GzmB의 발현 때문인지를 확인하여 보기로 하였다. miR-27a*와 miR-27a* 억제제의 형질도입은 NK 세포의 활성에 지표인 ERK의 양 또는 인산화 상태 그리고 INF-γ 생성에 영향을 주지 않았다. 하지만, 감소되고 증가된 Prf1 및 GzmB의 발현은 각각 NK 세포의 살상 능력(killing capacity)과 일치하였다(도 3e 참조). 이러한 실험 결과를 토대로, 본 발명자들은 miR-27a*는 음성적으로(negatively) Prf1 및 GzmB을 표적하여 NK 세포의 세포독성을 조절한다고 제안하였다.
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서 miR-27a*가 Prf1 및 GzmB 모두를 표적으로하는지 알아보고자, 본 발명자들은 리포터 분석을 수행하였다(도 4a 및 도 4b 참조). HEK293T 세포에 miR-27a*가 과잉발현(overexpression)되면 야생형 Prf1 3'-UTR 또는 GzmB 3'-UTR이 포함된 AANAT 리포터 유전자의 발현을 현저하게 감소시키지만, 대조군 miRNA가 발현되면 리포터 유전자의 발현에 중요한 효과가 없었다. 그러나 miR-27a*의 점돌연변이는 AANAT mRNA발현에 변화없이 리포터 단백질의 발현에 현저한 회복(recovery)을 유도했다(도 4c 참조). 이러한 실험에서 리포터 AANAT mRNA 발현양은 내부 대조군으로서 NeoR mRNA을 이용하였으며, 샘플 사이의 차이가 거의 없음을 보여주었다. AANAT 리포터 유전자에서 miR-27a*의 효과가 miR-27a* 결합 부위에 의존한다는 것을 설명하기 위해서, 본 발명자들은 miR-27a*가 결합하리라 추측되는 3'UTR의 결실 또는 돌연변이를 포함하는 리포터 컨스트럭트를 제작하였다(도 4a 참조). 비록 Prf1_D1 리포터 는 Prf1_WT과 비교하여 리포터 유전자 발현이 감소하였으나, 추측되는 miR-27a*-결합 부위가 전혀 없는 Prf1_D2는 리포터 유전자 발현의 억제효과가 3배정도 감소되었다(도 4d 참조). 게다가, miR-27a* 돌연변이(miR-27a*M)에 상보적인 3'UTR 돌연변이(Prf1_M과 GzmB_M)은 miR-27a*M에 해 억제되지만, 예상한대로 miR-27a*은 억제되지 않았다(도 4e 참조). 이러한 실험 결과로 본 발명자들은 miR-27a*는 특정하게 3'-UTR의 염기서열을 표적하여 Prf1 및 GzmB의 발현을 모두 억제시킨다는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서 발명자들은 NK 세포에서 miR-27a*의 생물학적 기능에 관하여 확인하고자, 휴지기와 IL-15에 의해 활성화된 NK 세포에서 각각 녹다운 및 농도-의존적 실험을 수행하였다. 휴지기의 mNK 세포에서, miR-27a* 억제제의 형질도입은 대조군 miRNA가 형질도입된 mNK 세포와 비교할 때, Prf1 및 GzmB 발현양이 2배정도 증가하였고, 그와 일치하게 NK 세포의 세포독성도 증가됨을 확인하였다. 그러나, miR-27a*가 형질도입된 휴지기 mNK 세포는 Prf1 과 GzmB 발현과 세포의 세포독성에 거의 변화가 없었다(도 5a 참조).
IL-15로 자극이 되면, mNK 세포는 IL-15의 농도(dose)가 증가함에 따라 Prf1 mRNA, GzmB mRNA, miR-27a* 의 발현이 증가하였다(도 5b 참조). 그러나, 일단 Prf1 과 GzmB의 발현이 증가되면 다음 변화는 거의 없었다(도 5c 참조). 이것은 NK 세포의 세포독성과도 일치하였다. 이러한 실험결과로 본 발명자들은 IL-15에 의해 유도된 miR-27a*가 표적 단백질의 발현을 억제함을 확인하였다. NK 세포에서 Prf1 과 GzmB의 발현이 miR-27a*에 의해 조절된다는 것은 다른 세포와 비교함으로써 검증되었다. NK92 세포는 mNK 세포와 비교하여볼 때, mRNA 발현은 유사하거나 감소한 반면, Prf1 과 GzmB의 발현은 높게 나타났다. 예상대로, NK92 세포는 mNK 세포보다 세포내 존재하는 miR-27a* 양이 적었다(도 5d 참조).
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서 Prf1 과 GzmB의 발현에 음성적(negative)인 역할이 in vitro에서 분화된 인간의 mNK 세포와 NK92세포에만 제한적으로 일어난다는 가능성을 배제하기 위해, 본 발명자들은 인간의 탯줄에서 추출한 제대혈세포(UBC)로부터 초대 NK 세포(CD3-CD56+CD16+)을 분리하여 miR-27a*를 형질도입하였다(도 6a 참조). mNK 세포와 유사하게 miR-27a*가 형질도입된 초대 NK 세포는 Prf1 과 GzmB의 특이적인 억제와 동시에 세포독성이 감소됨을 확인하였다(도 6b 참조). 예상한대로, miR-27a* 억제제가 형질도입된 초대 NK세포는 대조적인 결과를 보였다. 이러한 실험 결과를 토대로, 본 발명자들은 miR-27a*가 전사 후 조절(post-transcriptional regulation)에서 Prf1 과 GzmB의 발현 조절에 주요하게 작용하고 있다는 것을 제시하였다.
아울러, 본 발명의 구체적인 실시예에서 in vivo에서 miR-27a*가 Prf1 과 GzmB를 모두 표적하여 mNK 세포의 세포독성에 음성적인(negatively) 기능을 수행한다는 것을 확인하기 위하여(도 7a 참조), 본 발명자들은 종양 이종이식 모델의 암크기에 miR-27a*와 miR-27a* 억제제가 형질도입된 NK 세포가 어떠한 효과가 있는지를 알아보았다. 피하에(Subcutaneously) 주입된 SW620 세포는 빠르게 암을 형성하였다. 암의 평균크기는 22일째에 240 ± 28 mm3 이었다.
암의 성장은 miR-27a*가 형질도입된 mNK 세포로 인해 현저하게 감소되었다. 대조적으로, miR-27a* 억제제가 형질도입된 mNK 세포는 암에 대한 세포독성이 증가하였다(도 7b 내지 도7d 참조). 대조군 miRNA가 형질도입된 mNK 세포를 가진 쥐는 22일째 46%의 암 성장이 억제되었으나, miR-27a* 또는 miR-27a* 억제제 가 형질도입된 mNK 세포는 암 성장이 각각 27.2% 와 65.1%로 억제되었다(도 7e 참조). 암 성장에서 miR-27a* 억제제가 형질도입된 mNK 세포의 효과는 현재 항암 화학치료에 사용되는 세포독성 물질인 독소루비신(doxorubicin)과 비교되었다(도 7b 내지 도7e 참조). 암 성장에서 miR-27a* 억제제가 형질도입된 mNK 세포의 억제효과는 대조군 miRNA 또는 miR-27a*가 형질도입된 mNK 세포보다 더 길게 지속되었다. 대조군 miRNA 또는 miR-27a*가 형질도입된 mNK 세포에 의한 암 성장 억제 효과 정도는 2차 처리후, 점진적으로 5-7일 정도에 감소되었다(도 7e 참조). 그러나, in vitro에서 miR-27a* 억제제의 도입(introduction)으로 자라나는 암에 대항하는 mNK 세포의 세포독성의 정도(degree)와 기간(duration) 모두에 효과가 있으리라는 것을 제안한 바와같이 miR-27a* 억제제가 형질도입된 mNK 세포에서의 암 성장억제효과는 22일까지 유지되고, 증가되었다. 몸무게는 mNK 세포 처리에 의해 변화하지 않았으나, 독소루비신이 처리된 쥐의 무게는 현저하게 감소되었다(도 7f 참조). 이러한 실험 결과를 토대로, 본 발명자들은 in vivo에서 암에 대해 miR-27a*가 NK 세포의 세포독성에 필수적인 억제자라는 것을 확인하였으며, miRNA가 NK 세포를 이용한 항암치료에 중요한 표적 분자임을 제시하였다.
miR-27a*가 결합하는 부위에 돌연변이를 포함하는 서열을 NK 세포에 도입함으로써 세포 내 miR-27a* 표적 유전자의 3'UTR에 존재하는 miR-27a* 결합 서열과 경쟁하여 miR-27a*의 세포 내 활성을 억제하는 효과를 기대할 수 있다. 상기 NK 세포에 miR-27a*가 결합하는 부위에 돌연변이를 포함하는 서열은 서열번호 37 또는 서열번호 40인 것이 바람직하나, miR-27a*의 표적 유전자에 결합하는 부위가 돌연변이되어 표적 mRNA의 3'UTR에 존재하는 miR-27a* 결합 서열과 경쟁할 수 있는 서열이라면 모두 가능하다.
상기 NK 세포에서 Prf1 및 GzmB 단백질의 발현이 증가되었는지 여부를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 Prf1 및 GzmB 단백질 발현의 증가 여부는 웨스턴 블롯, 면역염색법, 형광염색법 및 리포터 분석(reporter assay)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법을 수행하여 확인할 수 있으나 이제 제한되는 것은 아니며, 당업계에 알려진 모든 공지의 방법을 통해 이루어질 수 있다.
상기 방법을 통하여 NK 세포의 활성이 실제로 증가되었는지 여부를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 NK 세포의 활성이 증가되었는지 여부는
ⅰ) 세포에 IL-15 자극을 주었을 때, 대조군과 비교하여 실험군의 IFN-γ 생성이 증가되었는지 확인하는 방법; 또는,
ⅱ) 대조군과 비교하여 실험군의 표적세포 살상능이 증가되었는지 확인하는 방법을 통해 확인할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 당업자라면 NK 세포의 표적 세포 살상능을 측정하기 위한 방법을 용이하게 알 수 있을 것이다.
상기 형질도입은 리포펙타민(Lipofectamine), 도진도(Dojindo)사의 힐리맥스(Hilymax), 퓨젠(Fugene), 제트 피이아이(jetPEI), 이펙텐(Effectene) 및 드림펙트(DreamFect)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 상용화된 형질도입용 시약; 칼슘-인산(calcium-phosphate), 양전하성 고분자, 리포좀, 나노입자, 뉴클레오펙션(nucleofection), 전기천공법(electroporation), 열 충격(heat shock), 마그네토펙션(magnetofection)을 이용하는 방법; 및 레트로 바이러스를 이용하는 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 이용하여 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은
1) miR-27a*을 발현하는 세포에 피검화합물을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 처리된 세포에서 miR-27a*상의 발현량을 측정하는 단계; 및,
3) 대조군과 비교하여 상기 단계 2)에서 miR-27a* 의 발현량이 감소된 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 항암제의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 피검화합물은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물 및 생활성 분자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업계에서 항암 활성이 알려지지 않은 것이라면 모두 가능하다.
상기 miR-27a*의 발현량은 RT-PCR, 정량적 또는 반정량적 RT-PCR(Quentitative or semi-Quentitative RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 실시간 PCR(Quentitative or semi-Quentitative real-time PCR), 노던 블롯(northern blot) 및 DNA 또는 RNA 칩(chip)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법을 수행하여 확인할 수 있으나 이제 제한되는 것은 아니며, 당업계에 알려진 모든 공지의 방법을 통해 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 활성화시킨 NK 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 NK 세포를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 서열번호 17로 기재되는 염기서열을 갖는 miR-27a*의 억제제를 유효성분으로 함유하는 NK 세포 활성화용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 miR-27a*의 억제제는 서열번호 20으로 기재되는 폴리뉴클레오티드인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니며 miR-27a*에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드라면 모두 가능하다.
상기 miR-27a*의 억제제는 Prf1 및 GzmB 단백질의 발현을 증가시킴으로써 NK 세포를 활성화시켜 세포 살상능을 증가시킨다.
본 발명의 자연 살해 세포 활성화용 약학적 조성물은 in vitro, in vivo 또는 ex vivo로 처리될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물을 in vitro에서 처리한 자연 살해 세포를 활성화 시킨 다음 개체로 투여하거나, 개체 내로 약학적 조성물을 직접 투여하여 자연 살해 세포를 활성화시키거나(in vivo), 개체에서 자연 살해 세포를 채집하여 본 발명의 약학적 조성물을 처리하여 활성화 시킨 뒤 다시 개체로 되돌려놓는 방법(ex vivo)이 모두 가능하나 이에 한정되지 않으며, 상기 방법들은 질병, 개체의 연령, 성별 및 체중 등에 따라 당업자에 의해 용이하게 선택되어 실시될 수 있다. 상기 개체는 포유류인 것이 바람직하다. 전형적인 포유류는 예를 들면 인간, 비인간 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말 또는 소를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 상기 질병은 종양과 관련된 다양한 질병, 예를 들어 폐암, 간암, 위암, 대장암, 방광암, 전립선암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 갑상선암, 흑색종 등의 각종 고형암 뿐만 아니라 백혈병을 비롯한 각종 혈액암, 바람직하게는 대장암 또는 혈액암이나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다.
상기 약학적 조성물은 통상적으로 사용되는 부형제, 붕해제, 감미제, 활택제, 향미제 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 붕해제로는 전분글리콜산나트륨, 크로스포비돈, 크로스카멜로스나트륨, 알긴산, 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 카르복시 메틸셀룰로오스 나트륨, 키토산, 구아검, 저치환도히드록시프로필셀룰로오스, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 폴라크릴린 칼륨 등이 있다. 또한, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약학적으로 허용가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨, 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적으로 허용가능한 첨가제는 상기 약학적 조성물에 대해 0.1~90 중량부 포함되는 것이 바람직하다.
경구투여를 위한 고형제제에는 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 연질캅셀제, 환 등이 포함된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 에어로졸 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제로는 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 멸균된 수용액, 액제, 비수성용제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 좌제, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사제제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용 약학적 조성물을 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 개체의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 경구 투여제의 경우 일반적으로 성인에게 1일에 체중 1 kg당 본 발명의 조성물을 1일 0.0001 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 ㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
세포 배양 및 분화
<1-1> 초대 NK 세포 분리 및 분화
인간의 탯줄로부터 유래된 제대혈(umbilical cord blood, UCB)로부터 ACCUSPIN System-HISTOPAQUE-1077(sigma-aldrich, 미국)을 사용하여 초대 NK 세포(Primary Natural Killer cell)를 얻은 다음, MACS NK cell isolation KIT(MiltenyiBiotec, 독일) 매뉴얼에 따라 음성 선별(negative selection)하여 분리하였다. 이때, NK 세포 군집은 형광세포분석기(Flow Cytometer, FACS)로 분석하였을 때 CD56(NK 세포 마커)+/CD3(성숙 T 세포 마커)- 세포 93% 이상이고, CD3+ 5% 미만이었다.
본 발명에서 FACS 분석을 위한 모든 항체는 따로 설명하지 않는 한 Becton, Dickinson and Company 및 BD Pharmingen으로부터 구매하였다. 분석 대상인 세포는 염색 완충액[1% FBS(Hyclone) 및 0.01% NaN3(Sigma)를 포함하는 PBS]로 4℃에서 20분간 각 지정된 항체로 염색한 다음, FACS 분석하였다.
<1-2> 성숙한 NK 세포 분화
UCB로부터 Ficoll-Hypaque 밀도 기울기 원심 분리법으로 단핵구세포(mononuclear cell; MNC)를 분리하였다. 상기 MNC로부터 CD56+, CD3+, CD14+, CD19+, CD2+, CD11b+, CD15+ 및 CD123+ 세포를 lineage cell depletion kit(MiltenyiBiotec)를 이용하여 제거한 뒤, CD34 cell isolation kit(MiltenyiBiotec)를 사용하여 CD34[만능 줄기 세포(Pluripotent Stem Cell) 마커]+ 세포를 분리하였다. 분리된 CD34+ 세포의 순도(purity)는 FACS로 측정하였을 때 97% 이상이었다. 상기 분리된 CD34+ 세포를 하기 과정을 통해 in vitro 에서 성숙된 NK(mature Natural Killer; mNK) 세포로 분화시켰다. 즉, CD34+ 세포를 106 M의 HC(helical cytokine)(Sigma), SCF(stem cell factor)(30 ng/㎖), FL(flk2/flt3 ligand)(50 ng/㎖) 및 IL-7(Interleukin-7)(5 ng/㎖)가 포함된 MyeloCult H5100(Stem Cell Technologies, 캐나다)으로 37℃, 5% CO2 조건의 세포 배양기에서 14일 동안 배양하였다. 완전한 mNK 세포로 분화시키기 위해서 인간에서 유래된 IL-15(30 ng/㎖, R&D Systems, 미국)를 첨가하여 2주간 더 배양하였다. CD56+/CD3- 세포의 순도는 FACS로 분석하였을 때 90% 이상이 되었다.
<1-3> 세포주 배양
ATCC에서 구입한 NK92 악성 림프종 NK 세포, K562 적백혈병(erythroleukemia) 세포, HEK293T 세포 및 인간 SW620 세포를 각각 IL-2(100 units/㎖, PetroTech, Inc. 미국), 10% FBS 및 1% 스트렙토마이신/페니실린이 포함된 alpha-MEM 배지, IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 배지, 10% FBS 및 1% 스트렙토마이신/페니실린이 포함된 alpha-MEM 배지 및, 10% FBS, 2 mM L-글루타민, 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 첨가된 RPMI1640(GibcoBRL) 배지로 37℃, 5% CO2 조건의 세포 배양기에서 배양하였다.
활성화된 mNK 세포에서 GzmA , GzmB 및 Prf1 발현 확인
활성화된 NK 세포에서 Prf1(perforin1)(서열번호 1) 및 GzmB(granzymeB)(서열번호 2)의 발현이 알려진 바 있지만, 세포내 내재된(arming) NK 세포의 조절 메카니즘은 거의 알려진 바가 없다. 본 발명자들은 휴지기 및 활성화된 mNK 세포에서 GzmA(granzymeA), GzmB 및 Prf1의 발현 및 이에 따른 NK 세포의 세포 사멸능을 확인하였다.
<2-1> mNK 세포 활성화 정도에 따른 Prf1 및 GzmB 단백질 발현 확인
상기 실시예 1-2에서 수득한 mNK 세포에 30 ng/㎖의 IL-15를 처리하지 않거나, 6, 12, 24 또는 48시간 동안 처리한 뒤, 1% NP-40 및 complete proteinase inhibitor(Roche)를 포함하는 PBS(phosphate-buffer saline)로 처리하여 세포 용해액을 수득하였다. 상기 세포 용해액을 SDS-PAGE를 수행하여 단백질을 분리시킨 다음, Immobilon-P 막(Millipore Corporation, 미국)으로 전달시켰다. 이후 상기 트랜스퍼 막을 5% 스킴밀크로 30분간 블로킹 한 후, 1차 항체로서 항-Prf 항체(abcam), 항-GzmB 항체(폴리클로날항체, SantaCruz Biotechnology) 및 항-GAPDH 항체(모노클로날항체, Ab FRONTIER)를 4℃에서 하루 동안 처리하였다. 상기 일차 항체가 처리된 막을 Immobilon Western kit(MILLIPORE)를 사용하여 확인하였다. 이때, GAPDH의 단백질 발현량은 정량적 대조군으로서 사용하였다. 상기 면역블롯(immunoblot) 결과를 도 1a에 나타내었다.
그 결과, 도 1a에 나타난 바와 같이 IL-15를 처리한 지 24시간이 지났을 때 Prf1 및 GzmB 단백질의 발현량이 가장 많았다.
<2-2> mNK 세포 활성화 정도에 따른 표적 세포 사멸능 확인
본 발명자들은 mNK 세포를 IL-15 처리를 통해 활성화시킨 다음, 51Cr-방출 분석를 수행하여 NK 세포 세포독성을 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1-3의 K562 세포(표적 세포)를 1.5 의 51Cr을 37℃ 세포 배양기에서 1시간 동안 반응시켜 표지하였다. 상기 표지된 K562 세포를 PBS로 2회 세척한 다음, 96 웰 플레이트에 웰당 10,000개 세포가 되도록 분주하였다. 상기 96 웰 플레이트에 30 ng/㎖의 IL-15를 처리하지 않거나, 6, 24 또는 48시간 동안 처리한 상기 실시예 1-2에서 수득한 mNK 세포(효과 세포)를 효과 세포와 표적 세포의 비율이 5:1에서 1.5:1까지 되도록 분주한 다음 37℃, 5% CO2의 세포 배양기에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후 상층액을 회수하여 scintillation counter(RACTOBETA; LKB Instruments)로 방사능(radioactivity)을 측정한 다음, IL-15 처리 시간에 따른 mNK 세포의 표적 세포 사멸능을 도 1b에 그래프로 나타내었다.
그 결과, 도 1b에 나타난 바와 같이 IL-15를 처리한 지 24시간이 지났을 때 세포 사멸능이 가장 높았다.
<2-3> mNK 세포 활성화 정도에 따른 Prf1 및 GzmB mRNA 발현
상기 실시예 1-2에서 수득한 mNK 세포에 30 ng/㎖의 IL-15를 처리하지 않거나, 6, 12, 24 또는 48시간 동안 처리한 뒤, Trizol Reagent(Invitrogen, 미국)를 이용하여 전체 RNA를 분리한 다음, 상기 전체 RNA 1 ㎍을 Moloney murine leukemia virus(M-MLV) reverse transcriptase(Roche Diagnostics, 스위스)와 oligo-dT를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 42℃에서 1시간 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 상기 cDNA를 주형으로 2×SYBRPremix Ex TaqTM(TaKaRa, 일본), 표 1의 Prf1 또는 GzmB에 대한 프라이머 쌍을 이용하여 실시간 PCR(실시간 PCR)을 수행하였다(Dice TP800 Thermal Cycler(TakaraBio). 이때, 정량적 대조군으로서 GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 표 1의 GAPDH 프라이머 쌍을 사용하여 함께 실시간 PCR을 수행하였다. 상기 PCR 조건은 95℃에서 10분간 변성시킨 후, 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초의 조건으로 40 회전을 돌린 후, 72℃에서 8분 동안 신장 시켜준 뒤, 상온까지 식혀주었다. 실시간 PCR 결과를 각 시료별 Prf1 또는 GzmB의 발현량을 GAPDH 발현량으로 보정해주는 2-△△ Ct 비교 방법으로 분석한 후, IL-15 처리 시간에 따른 mNK 세포에서의 Prf1 또는 GzmB의 상대적 발현량을 도 1c에 그래프로 나타내었다.
그 결과, 도 1c에 나타난 바와 같이 Prf1 및 GzmB의 mRNA의 발현량은 IL-15를 처리한지 6시간이 지났을 때 발현량이 가장 높았다. 이로써 Prf1 및 GzmB의 mRNA 발현 증가와 단백질 발현 증가 사이에 시간적인 간격이 있음을 알 수 있었다.
유전자 센스 프라이머(5'→3') 안티센스 프라이머(5'→3')
Prf1 서열번호 3 gctggacgtgactcctaagc 서열번호 4 gatgaagtgggtgccgtagt
GzmA 서열번호 5 agctgacggaaaaagcaaaa 서열번호 6 agggcttccagaatctccat
GzmB 서열번호 7 gtaagggggaaacaacagca 서열번호 8 ccccaaggtgacatttatgg
GAPDH 서열번호 9 gccatcaatgaccccttcatt 서열번호 10 gctcctggaagatggtgatgg
Dicer1 서열번호 11 atgaatggaaaatgcccaaa 서열번호 12 cagaaccccaccacaaagtc
<2-4> mNK 세포 활성화 정도에 따른 IFN -γ 생성량 확인
본 발명자들은 mNK 세포에서 IL-15 처리 시간에 따른 IFN-γ 생성량을 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1-2에서 수득한 mNK 세포에 30 ng/㎖의 IL-15를 처리하지 않거나, 6, 12, 24 또는 48시간 동안 처리한 뒤, 서열번호 13의 센스 프라이머(5'-tccaacgcaaagcaatacat-3') 및 서열번호 14의 안티센스 프라이머(5'-gcaggcaggacaaccattac-3')의 IFN-γ에 대한 프라이머 쌍을 이용하여 상기 실시예 2-3과 동일한 방법으로 cDNA 합성 및 실시간 PCR을 수행하였다. 또한, 상기 IL-15를 처리하거나, 처리하지 않은 세포로부터 얻은 상층액에 존재하는 IFN-γ 농도를 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) kit(R&D systems, 미국)를 이용하여 제조사의 메뉴얼에 따라 측정하였다. 상기 실시간 PCR 결과 및 ELISA 결과를 도 1d에 그래프로 함께 나타내었다.
그 결과, 도 1d에 나타난 바와 같이 인터페론-감마(IFN-γ) 생성량은 Prf1 및 GzmB mRNA의 발현 증가 시간과 유사하게 IL-15를 처리한지 6시간이 지났을 때 가장 높았다.
<2-5> 휴지기 mNK 세포에서 Prf1 및 GzmB 의 단백질 및 mRNA 발현 확인
본 발명자들은 비활성화된 휴지기 NK 세포에서 Prf1 및 GzmB의 발현을 확인하였다. 본 발명자들은 Agilent Human whole genome 4×44K gene-expression microarray(GenoSensor Corporation)를 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하여 분석한 결과, 휴지기 NK 세포에서 Prf1 및 GzmB의 mRNA 발현량이 GzmA 및 GAPDH 발현량보다 높은 것을 확인하였다(도 1e). 이를 직접 확인하기 위하여, 30 ng/㎖의 IL-15를 처리하지 않거나 24시간 동안 처리한 상기 실시예 1-2의 mNK 세포에서 상기 실시예 2-3과 동일한 방법으로 cDNA를 합성한 다음, 상기 합성된 cDNA 및 표 1의 각 유전자에 대한 프라이머 쌍을 이용하여 반-정량적 PCR을 수행하였다. 상기 PCR 조건은 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초의 조건으로 22회 사이클을 반복하였으며, 완벽한 연장의 완료를 위해 72℃에서 5 분간 더 반응시켰다. 상기 PCR 산물은 전기영동하여 EtBr(ethidium bromide)염색으로 확인하였다.
또한, 상기 IL-15를 처리하거나, 처리하지 않은 세포에서 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 면역블롯을 수행하였다. 상기 반-정량적 PCR 및 웨스턴 블롯 결과를 도 1f에 나타내었다.
이러한 실험 결과를 토대로, 본 발명자들은 Prf1 및 GzmB 단백질 발현이 휴지기와 활성화 시기 모두에서 잘 알려지지 않은 전사 후 조절(post-transcriptional regulation) 메카니즘에 의해 억제되고 있음을 제안하게 되었다.
그 결과, 도 1e에서 나타난 바와 같이 마이크로어레이 결과에서 휴지기 NK 세포에서 Prf1 및 GzmB mRNA의 발현량이 GzmA과 GAPDH 발현량보다 높았다. 또한, 도 1f에서 나타난 바와 같이 반-정량적 RT-PCR 결과에서 휴지기 NK 세포에서 Prf1 및 GzmB 단백질 발현량이 거의 없음에도 불구하고 mRNA 발현이 높게 나타난다는 것을 확인함으로써 마이크로어레이 데이터를 확인할 수 있었다. 이로써, 본 발명자들은 Prf1 및 GzmB 단백질 발현이 휴지기와 활성화 시기 모두에서 잘 알려지지 않은 전사 후 조절(post-transcriptional regulation) 메카니즘에 의해 억제되고 있음을 제시하였다.
miRNA 에 의한 NK 세포의 Prf1 및 GzmB 발현 조절 확인
본 발명자들은 상기 실시예 2에서 확인한 NK 세포의 활성화 여부에 따라 Prf1 및 GzmB 단백질의 발현이 조절되는 이유가, 번역(translation)의 억제 메카니즘의 하나인 microRNA(miRNA)에 의한 유전자 사일런싱(gene silencing) 때문일 것으로 생각하고, 이를 증명하고자 하였다.
<3-1> miRNA 생성 여부에 따른 NK 세포의 Prf1 및 GzmB 단백질 발현 확인
본 발명자들은 miRNA 생성에 필수적인 효소인 Dicer의 발현을 억제시킨 mNK 세포에서 Prf1 및 GzmB의 단백질 발현량을 측정하였다. 구체적으로, 30 ng/㎖의 IL-15를 24시간 동안 처리한 상기 실시예 1-2의 mNK 세포에 Thermo Fisher Scientific로부터 구입한 인간의 Dicer1(DICER1 ON-TARGETplus SMARTpool) 또는 대조군 siRNA에 대한 Premade siRNA를 제조사의 매뉴얼에 따라 nucleofection A hhnology(Amaxa)를 이용하여 형질도입하였다. 형질도입한지 24시간이 지난 후, 상기 각각의 세포로부터 1차 항체로서 항-Dicer1(모노클로날항체, abcam))항-Prf 항체, 항-GzmA 항체(폴리클로날항체, SantaCruz Biotechnology), 항-GzmB 항체 및 항-GAPDH 항체를 사용하여 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 면역블롯을 수행하여 Dicer1, Prf1, GzmA, GzmB 및 GAPDH 단백질의 발현을 확인하였다. 상기 결과를 도 2a에 나타내었다.
그 결과, 도 2a에 나타난 바와 같이 Dicer1 siRNA가 형질도입된 mNK 세포에서 Prf1 및 GzmB 단백질 발현량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
<3-2> miRNA 생성 여부에 따른 NK 세포의 Prf1 및 GzmB mRNA 발현 확인
본 발명자들은 miRNA 생성에 필수적인 효소인 Dicer의 발현을 억제시킨 mNK 세포에서 Prf1 및 GzmB의 mRNA 발현량을 측정하였다. 구체적으로, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 처리된 mNK 세포에서 표 1의 각각의 유전자에 대한 프라이머를 이용하여 상기 실시예 2-3과 동일한 방법으로 실시간 PCR을 수행하여 Dicer1, Prf1, GzmA 및 GzmB mRNA의 발현을 확인하였다. 상기 결과를 도 2b에 나타내었다.
그 결과, 도 2b에서 나타난 바와 같이 Dicer1 siRNA가 형질도입된 mNK 세포에서 Prf1 및 GzmB mRNA 발현량에는 큰 차이가 없음을 확인하였다.
<3-3> miRNA 생성 여부에 따른 NK 세포의 표적 세포 사멸능 확인
본 발명자들은 miRNA 생성에 필수적인 효소인 Dicer의 발현을 억제시킨 mNK 세포에서 세포 사멸능을 측정하였다. 구체적으로, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 처리된 mNK 세포를 효과 세포로 사용하여 상기 실시예 2-2와 동일한 방법으로 51Cr-방출 분석를 수행하였다. 상기 결과를 도 2c에 나타내었다.
그 결과, 도 2c에 나타난 바와 같이 Dicer1 siRNA가 형질도입된 mNK 세포에서 NK 세포의 세포독성이 감소하였다. 의 증가와도 일치하였다(도 2c). 하지만, GzmA mRNA와 단백질 발현은 miRNA 생성을 억제함에도 불구하고 변화가 없었다(도 2a). NK 세포에서 Dicer1을 억제함으로써 Prf1 및 GzmB 단백질 발현증가와 세포의 세포독성이 증가되는 효과는 NK92 세포에서도 나타났다. 게다가, Prf1 및 GzmB의 단백질 발현증가는 Dicer를 억제시킨 휴지기 mNK 세포에서도 확인하였으므로, 휴지기 또는 활성시기 모두에서 세포내 miRNA가 Prf1 및 GzmB의 발현을 조절한다는 것을 제시하였다.
Prf1 및 GzmB 의 발현을 조절하는 miRNA 선별 및 확인
본 발명자들은 상기에서 확인한 miRNA에 의한 Prf1 및 GzmB의 조절이, Dicer1의 발현을 억제시켜 모든 miRNA 생성을 방해함으로써 유발된 일반적 스트레스 때문이 아니라 실제 세포 내 miRNA에 의해 조절되는 것인지 확인하기 위하여 하기 실험을 수행하였다.
<4-1> Prf1 및 GzmB 의 발현을 조절하는 miRNA 선별
본 발명자들은 Prf1 및 GzmB의 발현을 억제하는 miRNA를 탐색하기 위하여 활성화된 mNK 세포로부터 마이크로어레이 기술을 이용하여 miRNA를 분석하였다. 도 1의 Prf1 및 GzmB에 대한 분석을 토대로 하여 Prf1 및 GzmB의 발현을 억제시키는 miRNA는 휴지기 상태에서는 높게 발현되다가 NK 세포가 활성화되면 그들의 표적 mRNA와 유사하거나 또는 감소된 발현을 보일 것으로 예상하였다.초기 스크리닝으로 IL-15로 자극된 NK 세포에서 발현량이 증가 또는 감소되는 25개의 miRNA를 선별한 다음, 상기 선별된 miRNA 중 Prf1 및 GzmB의 발현의 억제에 영향을 주는 miRNA가 무엇인지 확인하기 위하여 중요한 씨드(seed) 염기서열을 중점으로 Prf1 및 GzmB mRNA에 대한 miRNA의 in silico 서열 상보성 분석을 miRNA 표적 예측 알고리즘을 사용하여 수행하였다. 그 결과, miR-15a, miR-204 및 miR-27a*를 선별하였다.
본 발명자들은 mNK 세포에서 IL-15 자극에 의해 상기 miRNA의 발현량이 실제로 증가하는지 확인하기 위하여 실시간 PCR을 통해 상기 miRNA의 발현을 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1-2에서 수득한 mNK 세포에 30 ng/㎖의 IL-15를 처리하지 않거나, 6, 12 또는 24시간 동안 처리한 뒤, 상기 실시예 2-3의 방법과 동일한 방법으로 cDNA를 합성한 뒤, TaqMan MicroRNA Assays Kit(Applied biosystems)에 포함된 각 miRNA에 대한 프라이머 쌍 및 TaqMan MicroRNA Assay kit를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 실시간 PCR을 수행하였다. 이때, 정량적 대조군으로서 TaqMan MicroRNA Assays Kit에 포함된 U6 snRNA 프라이머 쌍을 사용하여 U6 snRNA(U6 small nuclear RNA)를 각 샘플과 함께 실시간 PCR을 수행하였다. 실시간 PCR 결과를 각 miRNA의 발현량을 U6 snRNA 발현량으로 보정해주는 2-△△ Ct 비교 방법으로 분석한 후, IL-15 처리 시간에 따른 mNK 세포에서의 miR-15a, miR-204 또는 miR-27a*의 상대적 발현량을 도 3a에 그래프로 나타내었다.
그 결과, 도 3a에서 나타난 바와 같이 IL-15 처리 시간에 따른 miR-15a, miR-204 또는 miR-27a*의 상대적 발현량은 표적 mRNA와 유사하게 12시간 전에 발현량이 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 이러한 miRNA의 유도는 엑티노마이신 D(actinomycin D)에 의해 억제되어 상기 miRNA의 발현량의 증가가 전사 수준에서 증가된 것임을 알 수 있었다.
<4-2> Prf1 및 GzmB 의 발현을 조절하는 miR -27a * 선별
본 발명자들은 Prf1 및 GzmB의 3'UTR에서 일치하는 염기서열을 가진 세 개의 miRNA가 실제적으로 Prf1 및 GzmB의 발현을 억제 할 수 있는지 확인하고자 하였다. 즉, 상기 실시예 1-2의 mNK 세포에 30 ng/㎖의 IL-15를 24시간 동안 처리한 다음, miR-15a, miR-204 및 miR-27a* 각각의 서열과 동일하게 합성된 각 miRNA 미믹스(mimics)[miR-15a 미믹스: 서열번호 15(5'-UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG-3'), miR-204 미믹스: 서열번호 16(5'-UUCCCUUUGUCAUCCUAUGCCU-3'), miR-27a* 미믹스: 서열번호 17(5'-AGGGCUUAGCUGCUUGUGAGCA-3'), Thermo Scientific Life Science Research](도 3b)를 상기 실시예 3-1와 동일한 방법으로 형질도입하였다. 상기 형질도입된 세포에서 항-Prf1 항체, 항-GzmB 항체 및 항-GAPDH 항체를 이용하여 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 Prf1, GzmB 및 GAPDH에 대한 면역블롯을, 상기 실시예 2-2와 동일한 방법으로 51Cr-방출 분석을 각각 수행하였다. 상기 결과를 도 3c에 나타내었다.
그 결과, 도 3c에서 나타난 바와 같이 mNK 세포에 형질도입된 miR-27a*가 mRNA발현에 변화없이 60% 이하 정도의 Prf1 및 GzmB의 단백질 발현량의 감소되었다. 그와 동시에 세포의 세포독성도 50% 이하 감소되었다. 이와 대조적으로 miR-15a와 miR-204는 Prf1 및 GzmB의 단백질 발현량과 세포의 세포독성에는 효과가 없었다.
<4-3> miR -27a * 억제에 의한 Prf1 및 GzmB 발현 감소 확인
상기 실시예 4-2에서 확인한 miR-27a*가 Prf1 및 GzmB를 조절하는 miRNA인지 한번 더 검증하기 위하여, 상기 실시예 1-2의 mNK 세포에 대조군 miRNA 및, miR-27a* 또는 miR-27a*와 상보적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드인 헤어핀 억제제(hairpin inhibitors)[miR-15a 억제제: 서열번호 18(5'-CACAAACCATTATGTGCTGCTA-3'), miR-204 억제제: 서열번호 19(5'-AGGCATAGGATGACAAAGGGAA-3'), miR-27a* 억제제: 서열번호 20(5'-TGCTCACAAGCAGCTAAGCCCT-3'), Thermo Scientific Life Science Research]를 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 형질도입시킨 다음, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 Prf1, GzmB 및 GAPDH에 대한 면역블롯을 수행하였다. 상기 결과를 도 3d에 나타내었다.
그 결과, 도 3d에서 나타난 바와 같이 본 발명자들이 mNK 세포에서 세포내 존재하는 miR-27a*가 Prf1 및 GzmB의 발현을 억제 할 것이라고 제안한 바대로, miR-27a*에 의해 Prf1 및 GzmB의 발현이 강력하게 증가되는 것을 확인하였다. 또한, miR-27a*와 miR-27a* 억제제의 형질도입은 각각 Prf1 및 GzmB의 발현을 감소시키고 증가시켰다.
<4-4> miR -27a * 발현 여부에 따른 단백질 발현 및 세포 독성 변화 확인
본 발명자들은 다음으로 miR-27a*에 의해 NK 세포의 세포독성이 감소되는 것이 NK 세포의 세포독성(cytotoxicity)에 관련된 유전자 발현을 유도해서가 아니라, Prf1 및 GzmB의 발현을 억제하기 때문임을 확인하기 위하여 하기 실험을 수행하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1-2의 mNK 세포에 대조군 miRNA, miR-27a* 및 miR-27a* 억제제를 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 형질도입시킨 다음, 항-Prf1 항체, 항-GzmB 항체, 항-인산화-ERK 항체(모노클로날항체, Cell Signaling), 항-ERK 항체(모노클로날항체, Cell Signaling) 및 항-GAPDH 항체를 이용하여 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 Prf1, GzmB, 인산화-ERK, ERK 및 GAPDH에 대한 면역블롯을 수행하였다. 또한, 상기 형질도입된 세포에서 상기 실시예 2-4와 동일한 방법으로 INF-γ 생성을 측정하였고, 상기 실시예 2-2와 동일한 방법으로 51Cr-방출 분석을 수행하였다. 상기 결과를 도 3f에 함께 나타내었다.
그 결과, 도 3f에서 나타난 바와 같이 miR-27a*와 miR-27a* 억제제의 형질도입은 NK 세포의 활성에 지표인 ERK의 양 또는 인산화 상태 그리고 INF-γ 생성에 영향을 주지 않았다. 하지만, 감소되고 증가된 Prf1 및 GzmB의 발현은 각각 NK 세포의 표적 세포 살상능(killing capacity)과 일치하였다. 이로써, 본 발명자들은 miR-27a*는 Prf1 및 GzmB을 표적하여 NK 세포의 세포독성(cytotoxicity)을 음성적으로(negatively) 조절하는 것을 제시하였다.
miR -27a * 결합 부위 의존적인 Prf1 및 GzmB 발현 조절 확인
<5-1> 3' UTR 에 miR -27a * 결합 부위를 포함하는 리포터 벡터의 제조
본 발명자들은 miR-27a*가 Prf1 및 GzmB을 모두 표적하는지 확인하기 위하여 리포터 분석을 위한 컨스트럭트(도 4a 및 도 4b)를 제작하고 "pcAANAT-Prf1_WT" 및 "pcAANAT-GzmB_WT"로 각각 명명하였다. 구체적으로 상기 컨스트럭트의 제조는 하기와 같이 수행되었다. 먼저 인간의 mNK 세포로부터 High Pure RNA Isolation Kit(Roche)를 이용하여 전체 RNA를 추출하였다. 상기 전체 RNA 1 ㎍을 Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche)를 이용하여 55℃에서 30분, 85℃에서 5분의 조건으로 RT-PCR을 수행하여 cDNA를 수득하였다. 상기 cDNA를 주형으로 서열번호 21의 센스 프라이머(5'-aaGAATTCtgagaacagtgagcttgg-3') 및 서열번호 22의 안티센스 프라이머(5'-aaTCTAGAcaccataacatcatatt-3')의 프라이머 쌍 또는 서열번호 23의 센스 프라이머(5'-aaGAATTCctacaggaagcaaacta-3') 및 서열번호 24의 안티센스 프라이머(5'-aTCTAGAccactcagctaagaggt-3')의 프라이머 쌍 및, Pfu 폴리머라아제(SolGent)를 이용하여 Prf1 또는 GzmB를 각각 증폭한다음, EcoRI 과 XbaI의 제한효소자리가 존재하는 증폭된 Prf1_WT 및 GzmB_WT의 염기서열을 각각 확인하고, EcoRI 과 XbaI의 제한효소를 이용하여 리포터 벡터인 pcAANAT (Kim TD 등, Mol Cell Biol . 25(8), 3232-3246, 2005)에 클로닝하였다. 이 때, PCR 반응은 94℃에서 4분간 초기 변성한 후, ① 94℃에서 35초간 변성, ② 55℃에서 40초간 어닐링 및 ③ 72℃에서 1분간 연장하는 사이클(①→②→③)을 35회 반복하고, 마지막 연장을 72℃에서 5분 동안 반응시켜 수행하였다. 이때, 증폭된 산물을 2-△△ CT 방법(Livak 등, Methods, 25(4), 402-408, 2001)을 이용하여 GAPDH(glyseraldehyde -3-phosphate dehydrogenase)로 보정하여 수치화하였다.
또한, Prf1 3'UTR 부위(서열번호 25) 또는 GzmB 3'UTR 부위(서열번호 26) 중에서 miR-27a* 결합 부위에 점돌연변이를 포함하는 "pcAANAT-Prf1_M" 및 "pcAANAT-GzmB_M", Prf1 3'UTR 부위에서 miR-27a* 결합 부위의 하류(downstream) 부위 또는 miR-27a* 결합 부위를 포함하는 부위가 결실된 "pcAANAT-Prf1_D1" 및 "pcAANAT-Prf1_D2"도 함께 제작하였다. 구체적으로, 상기에서 제작한 pcAANAT-Prf1_WT 및 pcAANAT-GzmB_WT의 Prf1 및 GzmB 3'UTR을 서열을 참고하여 서열번호 27의 센스 프라이머(5'-aaGAATTCtgagaacagtgagcttgg-3') 및 서열번호 28의 안티센스 프라이머(5'-aaTCTAGActgcagggcttgagaatg-3')의 Prf1_D1(Prf1 3'UTR 부위에서 miR-27a* 결합 부위의 하류(downstream) 부위가 결실)에 대한 프라이머 쌍 및 서열번호 29의 센스 프라이머(5'-aaGAATTCtgagaacagtgagcttgg-3') 및 서열번호 30의 안티센스 프라이머(5'-aaTCTAGAttgcgaatttgcgttggg-3')의 Prf1_D2(Prf1 3'UTR 부위에서 miR-27a* 결합 부위를 포함하는 부위가 결실)에 대한 프라이머 쌍을 각각 디자인하였다. 상기 프라이머 쌍을 이용하여 Prf1_D1 및 Prf1_D2를 PCR한 다음, 상기와 동일한 방법으로 pcAANAT에 클로닝하였다.
pcAANAT-Prf1_M는 이중 단계 PCR 이용하였는데 1차 DNA 단편을 획득하기 위해서 pcAANAT-Prf1_WT를 주형으로 하여 서열번호 31의 센스 프라이머(5'-aGAATTCtgagaacagtgagcttgg-3') 및 서열번호 32의 안티센스 프라이머(5'-gaatggcggacgcgttacgcagtttgg-3')의 프라이머 쌍을 이용하여 증폭하였고, 2차 DNA 단편을 획득하기 위해서 pcAANAT-Prf1_WT를 주형으로 하여 서열번호 33의 센스 프라이머(5'-ccaaactgcgtaacgcgtccgccattc-3') 및 서열번호 34의 안티센스 프라이머(5'-aaTCTAGAcaccataacatcatatt-3')의 프라이머 쌍을 이용하여 증폭하였다. 상기에서 수득한 1차 PCR 산물 및 2차 PCR 산물을 각각 정제하여 합친 후, 이를 주형으로 하여 서열번호 35의 센스 프라이머(5'-aGAATTCtgagaacagtgagcttgg-3') 및 서열번호 36의 안티센스 프라이머(5'-aaTCTAGAcaccataacatcatatt-3')의 프라이머 쌍을 이용하여 최종 PCR 산물(Prf1_M, 서열번호 37: Prf1 3'UTR 부위에서 miR-27a* 결합 부위가 돌연변이됨)을 수득한 다음, 상기와 동일한 방법으로 클로닝하였다. 또한 pcAANAT-GzmB_M은 pcAANAT-GzmB_WT을 주형으로 하여 서열번호 38의 센스 프라이머(5'-aaGAATTCtacaggaagcaaagtaacgcgccgc-3') 및 서열번호 39의 안티센스 프라이머(5'-aaTCTAGAccactcagctaagaggt-3')의 프라이머 쌍을 이용하여 GzmB_M(서열번호 40: GzmB 3'UTR 부위에서 miR-27a* 결합 부위가 돌연변이됨)을 증폭한 다음, 상기와 동일한 방법으로 클로닝하였다.
<5-2> miR -27a * 에 의해 Prf1 및 GzmB 의 발현이 모두 조절됨을 확인
miR-27a*가 Prf1 및 GzmB 모두를 표적으로하는지 알아보고자, 본 발명자들은 하기와 같이 리포터 분석을 수행하였다(도 4a 및 도 4b).
본 발명자들은 상기 실시예 1-3의 HEK293T 세포에 pcAANAT-Prf1_WT 및 pcAANAT-GzmB_WT를 각각 miR-27a* 또는 miR-27a* 억제제와 동시에 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 형질도입 시킨 다음, 항-AANAT 항체(Santa Cruz Biotechnology) 및 항-GAPDH 항체를 사용하여 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 면역블롯을 수행하여 리포터 단백질인 AANAT(Arylalkylamine N-acetyltransferase)의 발현을 확인하였다. 이때, GAPDH는 정량적 대조군으로서 사용하였다. 또한, 상기와 동일하게 형질도입된 세포에서 서열번호 41의 센스 프라이머(5'-CCCAAGCTGCGCACTTGG-3') 및 서열번호 42의 안티센스 프라이머(5'-GGGAACATAGCTGCTTTA-3')의 프라이머 쌍을 사용하여 상기 실시예 2-3과 동일한 방법으로 실시간 PCR을 수행하여 AANAT mRNA의 발현량을 확인하였다. 이때, NeoR mRNA는 서열번호 43의 센스 프라이머(5'-ATGACTGGGCACAACAGACA-3') 및 서열번호 44의 안티센스 프라이머(5'-AGTGACAACGTCGAGCACAG-3')의 프라이머 쌍을 사용하여 AANAT mRNA와 동시에 실시간 PCR을 수행하였다. 형질도입 효율을 보정하기 위하여, 벡터 내부 대조군(control)인 NeoR mRNA으로 상기 AANAT mRNA의 발현량을 보정하여 나타내었다. 상기 결과를 도 4c에 나타내었다.
그 결과, 도 4c에서 나타난 바와 같이 HEK293T 세포에 miR-27a*가 과발현되었을 경우 야생형 Prf1 3'-UTR 또는 GzmB 3'-UTR이 포함된 AANAT 리포터 유전자의 발현이 현저하게 감소시키지만, 대조군 miRNA가 발현되었을 경우 리포터 유전자의 발현에 유의한 효과가 없었다. 그러나 miR-27a*의 점돌연변이를 도입시켰을 경우, AANAT mRNA 발현에는 유의한 차이를 보이지 않았지만, 리포터 단백질의 발현은 현저하게 회복(recovery)되는 것을 확인하였다.
<5-3> miR -27a * 결합 부위 특이적인 리포터 유전자 발현 조절 확인
본 발명자들은 상기 실시예 5-2에서 확인한 miR-27a*의 효과가 리포터 유전자의 3'UTR에 포함된 miR-27a* 결합 부위에 의존하는지 확인하기 위하여, 3'UTR의 miR-27a* 결합 부위에 결실 또는 돌연변이를 포함하는 상기 실시예 5-1에서 제조한 벡터(도 4a)를 이용하여 하기 실험을 수행하였다.
우선, 상기 실시예 1-3의 HEK293T 세포에 miR-27a* 및, pcAANAT-Prf1_WT, pcAANAT-Prf1_D1 또는 pcAANAT-Prf1_D2를 동시에 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 형질도입 시킨 다음 상기 실시예 5-2와 동일한 방법으로 각각 면역블롯을 수행하여 AANAT 및 GAPDH 단백질의 발현량을 확인하였다. 또한, 상기와 동일한 방법으로 형질도입된 세포에서 상기 실시예 5-2와 동일한 방법으로 각각 실시간 PCR을 수행하여 AANAT mRNA 발현량을 확인하였다. 상기 결과를 도 4d에 나타내었다.
그 결과, 도 4d에 나타난 바와 같이 비록 pcAANAT-Prf1_D1 리포터는 pcAANAT-Prf1_WT과 비교하여 리포터 유전자 발현이 감소하였으나, 추측되는 miR-27a*-결합 부위가 전혀 없는 pcAANAT-Prf1_D2는 리포터 유전자 발현의 억제효과가 3배 정도 감소된 것을 관찰하였다.
또한, 본 발명자들은 상기 실시예 1-3의 HEK293T 세포에 pcAANAT-Prf1_M 및 pcAANAT-GzmB_M를 각각 대조군 miRNA, miR-27a* 또는 miR-27a*M(돌연변이 miR-27a*)와 동시에 형질도입시킨 다음 상기 실시예 5-2와 동일한 방법으로 각각 면역블롯을 수행하여 AANAT 및 GAPDH 단백질의 발현량을 확인하였다.
그 결과, 도 4e에 나타난 바와 같이 miR-27a* 돌연변이(miR-27a*M)에 상보적인 3'UTR 돌연변이(Prf1_M과 GzmB_M)은 miR-27a*M에 의해 억제되지만, 예상한대로 miR-27a*은 억제되지 않았다. 상기 결과로부터 본 발명자들은 miR-27a*가 3'-UTR의 특정 염기서열을 표적하여 Prf1 및 GzmB의 발현을 모두 억제시킨다는 것을 확인하였다.
miR -27a * 의 NK 세포에서 생물학적 기능 확인
<6-1> NK 세포 활성화 여부에 따른 miR -27a * 발현에 대한 반응의 차이 확인
본 발명자들은 miR-27a*가 NK 세포의 세포독성에 필수적인 Prf1 및 GzmB의 발현을 억제한다는 것을 확인하였다. 다음으로, NK 세포에서 miR-27a*의 생물학적 기능을 확인하고자, 휴지기 및 활성화된 NK 세포에서 miR-27a* 녹다운(knockdown) 실험을 수행하였다.
우선, 상기 실시예 1-2의 mNK 세포에 대조군 miRNA, miR-27a* 또는 miR-27a* 억제제를 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 형질도입 시킨 다음, 상기 형질도입된 세포에서 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 면역블롯을, 상기 실시예 2-2와 동일한 방법으로 51Cr-방출 분석을 각각 수행하였다. 상기 결과를 도 5a에 함께 나타내었다.
그 결과, 도 5a에 나타난 바와 같이 휴지기의 mNK 세포에서 대조군 miRNA가 형질도입된 mNK 세포와 비교할 때, miR-27a* 억제제를 형질도입한 경우 Prf1 및 GzmB 발현량이 2배정도 증가하였고, 그와 일치하게 NK 세포의 세포독성도 증가됨을 확인하였다. 그러나 miR-27a*가 형질도입된 휴지기 mNK 세포는 Prf1 및 GzmB 발현과 세포의 세포독성에 거의 변화가 없었다.
<6-2> NK 세포 활성화에 따른 miR -27a * 의 발현 증가 확인
본 발명자들은 NK 세포에서 miR-27a*의 생물학적 기능을 확인하고자, 휴지기 및 활성화된 NK 세포에서 IL-15 도스-의존성(dose-dependency) 실험을 수행하였다.
우선, IL-15를 처리하지 않거나, 330 ng/㎖ 또는 60 ng/㎖으로 처리한 상기 실시예 1-2의 mNK 세포에서 TaqManMicroRNA Assays Kit에 포함된 miR-27a* 또는 U6 snRNA에 대한 프라이머 쌍을 이용하여 상기 실시예 2-5와 동일한 방법으로 반-정량적 PCR을, 상기 실시예 2-3과 동일한 방법으로 GzmB 및 Prf1 mRNA에 대한 실시간 PCR을 각각 수행하였다. 상기 결과를 도 5b에 U6 snRNA에 대한 miR-27a*의 상대값(miR-27a*/U6) 및 GzmB 및 Prf1 mRNA의 상대량을 각각 그래프로 나타내었다.
그 결과, 도 5b에 나타난 바와 같이 IL-15로 자극이 되면, mNK 세포는 IL-15의 농도(dose)가 증가함에 따라 Prf1 mRNA, GzmB mRNA 및 miR-27a*의 발현이 함께 증가하였다
또한, 상기와 동일하게 처리한 세포에서 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 면역블롯을, 상기 실시예 2-2와 동일한 방법으로 51Cr-방출 분석을 각각 수행하였다. 상기 결과를 도 5c에 함께 나타내었다.
그 결과, 도 5c에 나타난 바와 같이 일단 Prf1 및 GzmB 단백질의 발현이 증가되면 다음 변화는 거의 없었다. 이것은 NK 세포의 세포독성과도 일치하였다. 이러한 실험결과로 본 발명자들은 IL-15에 의해 유도된 miR-27a*가 표적 단백질의 발현을 억제하는 것을 알 수 있었다.
<6-3> NK 세포에서 miR -27a * 에 의한 Prf1 및 GzmB 의 조절 확인
본 발명자들은 NK 세포에서 Prf1 및 GzmB의 발현이 miR-27a*에 의해 조절된다는 것을 검증하기 위하여 mNK 세포 및 NK92 세포주에서 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 면역블롯을, 상기 실시예 2-5와 동일한 방법으로 반-정량적 PCR을 수행하였다. 상기 결과를 도 5d에 함께 나타내었다.
그 결과, 도 5d에 나타난 바와 같이 NK92 세포는 mNK 세포와 비교하여볼 때, mRNA 발현은 유사하거나 감소한 반면, Prf1 및 GzmB의 발현은 높게 나타났다. 예상대로, NK92 세포는 mNK 세포보다 세포내 존재하는 miR-27a* 양이 적었다.
<6-4> 초대 NK 세포에서 miR -27a * 에 의한 Prf1 및 GzmB 의 조절 확인
본 발명자들은 miR-27a*가 Prf1 및 GzmB의 발현을 감소시키는 것이 in vitro에서 분화된 인간의 mNK 세포 및 NK92 세포주에서 제한적으로 일어나는 것인지 확인하기 위하여, 인간의 탯줄에서 추출한 제대혈 세포로부터 분리한 초대 NK 세포에서 miR-27a*의 기능을 확인하였다. 상기 실시예 1-1의 초대 NK 세포를 상기 실시예 1-1의 방법으로 FACS 분석하여 NK 세포의 표지 마커인 CD56 및 CD16을 동시에 가진 세포수를 도 6a에 백분율로 표시하였다. 상기 실시예 1-1의 초대 NK 세포(CD3-, CD56+, CD16+)에 대조군 miRNA 또는 miR-27a*를 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 형질도입한 다음, 항-Prf1 항체, 항-GzmB 항체, 항-ERK 항체 및 항-GAPDH 항체를 사용하여 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 면역블롯을, 상기 실시예 2-2와 동일한 방법으로 51Cr-방출 분석을 각각 수행하였다. 상기 결과를 도 6b에 함께 나타내었다.
그 결과, 도 6b에 나타난 바와 같이 mNK 세포와 유사하게 miR-27a*가 형질도입된 초대 NK 세포는 Prf1 및 GzmB의 특이적인 억제와 동시에 세포독성이 감소됨을 확인하였다. 예상한대로, miR-27a* 억제제가 형질도입된 초대 NK세포는 상기와 대조적인 결과를 보였다. 상기 실험 결과를 토대로, 본 발명자들은 miR-27a*가 전사 후 조절(post-transcriptional regulation)에서 Prf1 및 GzmB의 발현 조절에 주요하게 작용하고 있음을 제시하였다.
인간 암 이종 이식 마우스 모델( in vivo )에서 miR -27a * 가 NK 세포의 세포 독성에 미치는 영향 확인
본 발명자들은 상기 결과로부터 miR-27a*가 Prf1 및 GzmB를 모두 표적하여 단백질 발현을 억제시킴으로써 mNK 세포의 세포독성을 감소시키는 역할을 하는 것을 확인하였다. 이러한 miR-27a*의 기능이 in vivo에서도 유지되는지 확인하기 위하여 하기 실험을 수행하였다(도 7a).
<7-1> 이종이식 마우스의 제조
본 발명자들은 인간 암 이종이식(xenograft) 모델에서 miR-27a*이 NK 세포의 세포독성에 미치는 영향을 실험하고자 이종이식 마우스 모델을 제조하였다. 구체적으로, 암컷 BALB/c nude mice(BALB/c-nu/nu,5 주령, SLC, 일본)은 SLC(Hamahatsu)에서 구매하였다. 상기 마우스를 21±2℃에서 12 시간 빛-어둠 주기로 유지하면서 사육하였고, 실험에 들어가기 1주일 동안 환경에 순응시켰다. 본 발명의 모든 동물 실험은 생명공학연구원(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)의 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인되었다. 상기 마우스에 상기 실시예 1-3의 SW620 6106개를 피하로(Subcutaneously) 주입하였다.
<7-2> miR -27a * 의 암에 미치는 영향 확인
주입 후 7일이 지난 다음 상기 마우스에 PBS, 대조군 miRNA, miR-27a* 또는 miR-27a* 억제제를 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 형질도입시킨 mNK 세포(2.8×106개)를 정맥주사로(intravenously) 2시간에 2번 주입하였다. 독소루비신(Doxrubicin, Sigma)(2 mg/kg)은 격일(every other day)로 복강주사(intraperitoneally)로 투약하였다. 이후, 상기 마우스에서 발생한 암의 크기는 암크기는 캘리퍼(caliper)를 이용하여 측정하였으며, 하기 수학식 1에 따라 크기를 계산하였다. 각 마우스의 몸무게(Body weight)는 실험 전반에 걸쳐 일주일에 세 번 측정하였다. 각 그룹별 암 크기, 암조직 크기 변화, 암의 평균 크기, 암크기 억제율 및 체중 변화를 각각 도 7b 내지 도 7f에 나타내었다.
Figure 112010007715241-pat00001
그 결과, 도 7b 내지 도 7f에 나타난 바와 같이 같이 암 이종이식 모델 마우스의 암의 평균크기는 22일째에 240 ± 28 mm3 이었다. 암의 성장은 miR-27a*가 형질도입된 mNK 세포로 인해 현저하게 감소되었다. 대조적으로, miR-27a* 억제제가 형질도입된 mNK 세포는 암에 대한 세포독성이 증가하였다. 대조군 miRNA가 형질도입된 mNK 세포를 주입한 마우스는 22일째 46%의 암 성장이 억제되었으나, miR-27a* 또는 miR-27a* 억제제가 형질도입된 mNK 세포는 암 성장이 각각 27.2% 와 65.1%로 억제되었다. 암 성장에서 miR-27a* 억제제가 형질도입된 mNK 세포의 효과는 현재 암 화학치료에 사용되는 세포독성 약물인 독소루비신과 비교하였다. 암 성장에서 miR-27a* 억제제가 형질도입된 mNK 세포의 억제효과는 대조군 miRNA 또는 miR-27a*가 형질도입 된 mNK 세포보다 더 길게 지속되었다. 대조군 miRNA 또는 miR-27a*가 형질도입 된 mNK 세포에 의한 암 성장 억제 효과 정도는 2차 처리후, 점진적으로 5-7일 정도에 감소되었다. 그러나 in vitro에서 miR-27a* 억제제의 도입으로 자라나는 암에 대항하는 mNK 세포의 세포독성의 정도(degree)와 기간(duration) 모두에 효과가 있으리라는 것을 제안한 바와 같이 miR-27a* 억제제가 형질도입된 mNK 세포에서의 암 성장 억제효과는 22일까지 유지되었다. 암 이종이식 모델 마우스의 몸무게는 mNK 세포 처리에 의해 변화하지 않았으나, 독소루비신이 처리된 쥐의 무게는 현저하게 감소되었다. 이러한 실험 결과를 토대로, 본 발명자들은 in vivo에서 암에 대해 miR-27a*가 NK 세포의 세포독성에 필수적인 억제자라는 것을 확인하였으며, microRNA가 NK 세포를 이용한 항암치료에 중요한 표적 분자임을 제시하였다.
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Claims (16)

  1. 시험관 내에서(In vitro) miR-27a*에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 NK 세포에 형질도입하는 단계를 포함하는, NK 세포의 세포독성 증가 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 miR-27a*에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드는 서열번호 20으로 기재되는 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 NK 세포의 세포독성 증가 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 NK 세포에서 Prf1 및 GzmB 단백질의 발현이 증가되었는지 여부를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 NK 세포의 세포독성 증가 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 NK 세포독성이 증가되었는지 여부를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 NK 세포의 세포독성 증가 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 NK 세포독성이 증가되었는지 여부는
    ⅰ) 세포에 IL-15 자극을 주었을 때, 대조군과 비교하여 실험군의 IFN-γ 생성이 증가되었는지 확인하는 방법; 또는,
    ⅱ) 대조군과 비교하여 실험군의 표적세포 살상능이 증가되었는지 확인하는 방법을 통해 확인하는 것을 특징으로 하는 NK 세포의 세포독성 증가 방법.
  6. 1) miR-27a*을 발현하는 세포에 피검화합물을 처리하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 처리된 세포에서 miR-27a*의 발현량을 측정하는 단계; 및,
    3) 대조군과 비교하여 상기 단계 2)에서 miR-27a*의 발현량이 감소된 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 항암제의 스크리닝 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 피검화합물은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물 및 생활성 분자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항암제의 스크리닝 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 miR-27a*의 발현량은 RT-PCR, 정량적 또는 반정량적 RT-PCR(Quentitative or semi-Quentitative RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 실시간 PCR(Quentitative or semi-Quentitative real-time PCR), 노던 블롯(northern blot) 및 DNA 또는 RNA 칩(chip)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법을 수행하여 확인하는 것을 특징으로 하는 항암제의 스크리닝 방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. miR-27a*에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 형질도입한 NK 세포를 유효성분으로 함유하는 폐암, 대장암, 유방암, 흑색종 또는 혈액암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 삭제
  13. 제 11항에 있어서, 상기 암은 대장암 및 혈액암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 암인 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
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