KR102352127B1

KR102352127B1 - Mitf 억제제를 유효성분으로 함유하는 골수-유래 억제세포 저해용 조성물

Info

Publication number: KR102352127B1
Application number: KR1020210077636A
Authority: KR
Inventors: 임종석; 이아람; 임지현; 이명석
Original assignee: 숙명여자대학교산학협력단
Priority date: 2019-08-22
Filing date: 2021-06-15
Publication date: 2022-01-14
Also published as: KR20210023306A; WO2021033973A1; KR20210075055A; KR20210075056A; KR102352126B1

Abstract

본 발명은 MITF(microphthalmia-associated transcription factor) 억제제를 유효성분으로 함유하는 골수-유래 억제세포(myeloid-derived suppressor cells, MDSC) 저해용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 암세포 환경에서 MDSC가 활성화되어 면역반응이 저하되고, 상기 MDSC의 활성화에 MITF가 관여하며, 상기 MITF의 억제제를 이용하여 MDSC를 저해할 수 있음을 확인하였으므로, 상기 MITF 억제제를 유효성분으로 함유하는 조성물을 MDSC에 의한 면역반응 저하를 완화하고, 항암 면역치료 효율을 증대하는데 유용하게 사용할 수 있다.

Description

MITF 억제제를 유효성분으로 함유하는 골수-유래 억제세포 저해용 조성물{Composition for inhibiting myeloid-derived suppressor cells comprising MITF inhibitor}

본 발명은 MITF(microphthalmia-associated transcription factor) 억제제를 유효성분으로 함유하는 골수-유래 억제세포(myeloid-derived suppressor cell) 저해용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 MITF 억제제를 유효성분으로 함유하는 골수-유래 억제세포에 의한 면역 반응 저하의 완화, 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.

골수성 세포(myeloid cells)는 조혈모줄기세포(hematopoietic stem cell)에서 기원한다. 이는 우리 몸에 가장 많이 존재하는 조혈모세포로, 골수 및 림프 조직에 주로 존재한다. 최종적으로는 대식세포(macrophage), 수지상세포(dendritic cell) 그리고 과립구(granulocyte)로 분화하나, 이들은 특정 계층 구조를 띄지 않고 다양한 단계의 분화도를 가진 골수성 세포가 조직과 환경에 특이적으로 다양하게 분포되는 특징을 가지고 있다.

골수-유래 억제세포(myeloid-derived suppressor cells, MDSC)는 골수성 세포 중에서 면역 반응 억제 작용을 가진 세포들로서, 매우 광범위한 미분화 골수성 세포를 포함하는 세포군이다. MDSC는 여러 전사 인자들을 통해 활성화가 매개되고, 그 결과 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이나 활성질소종(reactive nitrogen species, RNS)이 생산되어 T 세포의 증식에서부터 기능까지 다양한 과정을 저해하여 T 세포를 효과적으로 억제하는 것으로 알려져 있다. 이러한 MDSC의 작용이 자가면역 반응을 억제하는 점에서는 유익하지만, MDSC의 축적으로 면역 억제 환경이 지속되면 생체가 지속적으로 알러젠 및/또는 바이러스 감염에 노출되고, 이를 인해 만성 염증이 나타날 수 있다. 생체가 효과적인 면역 반응을 할 수 없게 되면 만성 염증 시 조직 손상이 일어나게 될 수 있다. 또한, MDSC는 암세포 미세환경(tumor microenvironment, TME)에서 종양 세포의 침입 및 전이를 보조하는 것이 확인되었다.

이러한 MDSC의 기능과 작용 기전에 대한 연구를 바탕으로 최근에는 이들의 조절을 통해 새로운 암 치료법을 개발하고자 하는 노력이 가속화되고 있다. 대표적으로 젬시타빈(Gemcitabine) 및 5-플루오로우라실(5-fluorouracil, 5-FU)은 MDSC를 직접적으로 감소시키는 화학요법제로 알려져 있다.

또한, MDSC의 빈도 및 기능이 최근 임상에서 항암면역치료제로 활발하게 사용되고 있는 면역관문억제제(immune checkpoint inhibitor, ICI)에 대한 환자의 내성에 기여하는 것이 알려지면서, MDSC의 중요성이 강조되고 있다. ICI는 암세포에 의한 T 세포의 억제를 막아줌으로써 암 환자의 항암 면역 반응을 향상시킨다. 실제로 CTLA-4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4) 및 PD-1(programmed cell death protein) 및 PD-L1(programmed cell death ligand 1)을 표적으로 하는 다양한 항체들이 악성흑색종, 편평비소세포폐암 및 신장암 등의 치료 목적으로 허가된 바 있다. 그러나 최대 80%에 달하는 많은 환자들이 이러한 치료법에 반응하지 않는 것으로 알려져 있고, 그 주된 원인으로 TEM을 구성하는 면역억제세포들 때문이라고 추정되고 있다. ICI 치료 효능에 영향을 주는 TME에서의 면역억제세포들은 Treg 세포, MDSC, TH2 CD4⁺ 세포, CAR(cancer-associated fibroblast) 및 M2로 분극된 TAM(tumor associated macrophage)이 잘 알려져 있다. 특히, MDSC를 결핍시키면 항암면역반응이 증강되어 ICI에 대한 내재되어 있던 저항성이 극복된다는 결과들이 보고되면서, MDSC를 ICI 치료에서의 중요한 예후인자로서 사용할 수 있음이 강조되고 있다.

한편, ICI에 대한 비반응 또는 낮은 반응성을 극복하기 위해 최근 다른 종류의 ICI와 조합하여 병용 치료하는 방법이 시도가 이루어지고 있고, 이 경우 단일치료(monotherapy)에 비해 임상적 이득이 의미 있게 높아짐이 보고되었다. 또한, 항-CTLA4와 항-PD-1의 병용, 항-PD-1과 IL-2R 작용제(agonist)의 병용, VEGF 억제제 또는 케모카인(chemokine) 조절제와 ICI의 병용, 항-CTLA4와 CTL 치료제의 병용 등이 임상 연구되고 있다. 나아가 방사선 치료와 함께 ICI를 투여하거나, ICI와 저농도의 다양한 기존 화학요법제 또는 표적 항암제를 병용하여 T 세포의 활성화와 종양으로의 침투를 유도함으로써, 치료반응을 높이고 항암면역반응의 효과를 상승시키기 위한 다양한 시도들도 이루어지고 있다.

MITF(microphthalmia-associated transcription factor)는 헬릭스-루프-헬릭스 루신 지퍼(Helix-loop-helix leucine zipper)를 함유한 전사인자로서 멜라노사이트(Melanocyte)와 멜라노마(Melanoma)의 생존과 분화를 조절하며 멜라닌 형성 기전에 관여하는 것으로 알려져 있다. MITF에 대한 연구 결과는 최근에 보고되기 시작했는데, LXR(Liver X receptor)이 활성화되면 MITF의 분해를 촉진하여 멜라닌합성(Melanogenesis)이 저해된다는 것이 알려져 있으나, MDSC에서 MITF의 역할에 대해서는 아직 밝혀진 바 없다.

이에 본 발명자들은 MDSC 저해를 통한 MDSC의 면역반응 저하를 완화하고, 항암면역치료제의 치료 효과를 향상시킬 수 있는 제제를 개발하기 위해 노력한 결과, 암세포 환경에서 MDSC가 활성화되어 면역반응이 저하되고, 상기 MDSC의 활성화에 MITF가 관여하며, 상기 MITF의 억제제를 이용하여 MDSC를 저해할 수 있음을 확인한 것에 기초하여 상기 MITF 억제제를 MDSC의 면역반응 저하의 완화 및 항암 면역 치료에 이용할 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.

국제 공개특허 제2013-082591호 국제 공개특허 제2011-116299호 대한민국 등록특허 제1902355호 대한민국 등록특허 제1826753호

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본 발명의 목적은 골수-유래 억제세포(myeloid-derived suppressor cell)를 저해하는 MITF(microphthalmia-associated transcription factor) 억제제를 유효성분으로 함유하는, 골수-유래 억제세포에 의한 면역 반응 저하의 완화, 치료 또는 예방용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 MITF(microphthalmia-associated transcription factor) 억제제를 유효성분으로 함유하는, 골수-유래 억제세포(myeloid-derived suppressor cell)에 의한 면역 반응 저하의 완화, 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 암세포 환경에서 골수-유래 억제세포(Myeloid-derived suppressor cell, MDSC)가 활성화되어 면역반응이 저하되고, 상기 MDSC의 활성화에 MITF(microphthalmia-associated transcription factor)가 관여하며, 상기 MITF의 억제제를 이용하여 MDSC를 저해할 수 있음을 확인하였으므로, 상기 MITF 억제제를 유효성분으로 함유하는 조성물을 MDSC에 의한 면역반응 저하를 완화하고, 항암 면역치료 효율을 증대하는데 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 마우스의 골수유래 골수-유래 억제세포(myeloid-derived suppressor cell, MDSC) 제작방법을 모식화한 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 마우스의 골수에서 분리한 세포에 MDSC의 분화 유도 인자인 GM-CSF와 함께 암세포를 배양한 배지(tumor cell-conditioned medium; TCCM)를 처리한 후 MDSC의 분화(도 2A) 및 활성(도 2B) 변화를 확인한 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 마우스의 골수에서 분리한 세포에 GM-CSF와 함께 TCCM을 처리한 후 MDSC에서 MITF(microphthalmia-associated transcription factor)의 유전자(도 3A) 및 단백질(도 3B) 발현 변화를 확인한 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 마우스의 골수에서 분리한 세포에 GM-CSF와 함께 TCCM을 처리한 MDSC의 T 세포 활성 억제 변화를 확인한 도이다.
도 5는 종양 형성 마우스에서 MDSC의 분화(도 5A), 활성(도 5B) 및 MITF 유전자 발현(도 5C) 변화를 확인한 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 마우스의 골수에서 분리한 세포에 MDSC의 활성을 유도하는 약물로 IL-18을 GM-CSF와 함께 처리한 후 MDSC의 분화(도 6A), 활성(도 6B), 및 MITF의 유전자(도 6C) 및 단백질(도 6D) 발현 변화를 확인한 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 마우스의 골수에서 분리한 세포에 MDSC의 활성을 유도하는 약물로 IL-4를 GM-CSF와 함께 처리한 후 MDSC의 분화(도 7A), 활성(도 7B) 및 MITF의 유전자 발현(도 7C) 변화를 확인한 도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 마우스의 골수에서 분리한 세포에 MDSC의 활성을 유도하는 약물로 LPS를 GM-CSF와 함께 처리한 후 MDSC의 분화(도 8A), 활성(도 8B) 및 MITF의 유전자 발현(도 8C) 변화를 확인한 도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 마우스의 골수에서 분리한 세포에 MDSC의 활성을 유도하는 약물로 심바스타틴(Simvastatin, Sim), 로바스타틴(Lovastatin, Lova), 프로바스타틴(Pravastatin, Prav), 로수바스타틴(Rosuvastatin, Rosu), 또는 아토바스타닌(Atorvastatin, Ator)을 GM-CSF와 함께 처리한 후 MDSC의 분화 변화를 확인한 도이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 마우스의 골수에서 분리한 세포에 MDSC의 활성을 유도하는 약물로 심바스타틴(Simvastatin, Sim), 로바스타틴(Lovastatin, Lova), 프로바스타틴(Pravastatin, Prav), 로수바스타틴(Rosuvastatin, Rosu), 또는 아토바스타닌(Atorvastatin, Ator)을 GM-CSF와 함께 처리한 후 MDSC의 활성(도 10A), 및 MITF의 유전자(도 10B) 및 단백질(도 10C) 발현 변화를 확인한 도이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 마우스의 골수에서 분리한 세포에 GM-CSF를 처리하여 분화를 유도한 이후, MDSC의 활성을 유도하는 약물로 심바스타틴(Simvastatin, Sim), 로바스타틴(Lovastatin, Lova), 프로바스타틴(Pravastatin, Prav), 로수바스타틴(Rosuvastatin, Rosu), 또는 아토바스타닌(Atorvastatin, Ator)을 24시간 동안 처리한 후 MDSC의 분화 변화를 확인한 도이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 마우스의 골수에서 분리한 세포에 GM-CSF를 처리하여 분화를 유도한 이후, MDSC의 활성을 유도하는 약물로 심바스타틴(Simvastatin, Sim) 또는 로바스타틴(Lovastatin, Lova)을 24시간 동안 처리한 후 MDSC의 활성(도 12A) 및 MITF의 유전자발현(도 12B) 변화를 확인한 도이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따라 마우스의 골수에서 분리한 세포에 MDSC의 활성을 억제하는 약물로 ATRA(All-trans retinoic acid)를 GM-CSF와 함께 처리한 후 MDSC의 분화(도 13A), 활성(도 13B), 및 MITF의 유전자 발현(도 13C) 변화를 확인한 도이다.
도 14는 본 발명의 실시예에 따라 마우스의 골수에서 분리한 세포에 MITF 유도제로 IBMX를 GM-CSF와 함께 처리한 후 MDSC의 분화(도 14A), 활성(도 14B), 및 MITF의 유전자 발현(도 14C) 변화를 확인한 도이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따라 마우스의 골수에서 분리한 세포에 MITF 억제제로 베르베린(Berberine)을 GM-CSF와 함께 처리한 후 MITF의 유전자 발현(도 15A), MDSC의 분화(도 15B) 및 활성(도 15C) 변화를 확인한 도이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 MITF(Microphthalmia-associated transcription factor) 억제제를 유효성분으로 함유하는, 골수-유래 억제세포(Myeloid-derived suppressor cell, MDSC)에 의한 면역 반응 저하의 완화, 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 상기 "MITF 억제제"는 MITF 발현 또는 활성 억제를 통해 MDSC의 활성을 억제하는 목적을 달성할 수 있는 물질을 제한 없이 포함할 수 있다. 구체적으로, MITF 억제제는 MITF의 유전자 발현 억제제 또는 MITF의 단백질 활성 억제제일 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 MITF의 유전자 발현 억제제는 MITF 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 앱타머, 짧은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA, shRNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA), 마이크로 RNA(microRNA, miRNA) 및 리보자임(ribozyme)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 "안티센스 뉴클레오타이드"는 왓슨-클릭 염기쌍에 정의된 바에 따라, DNA, 미성숙-mRNA 또는 성숙된 mRNA의 상보적 염기서열에 결합(혼성화)하여 DNA에서 단백질로서 유전정보의 흐름을 방해하는 것이다. 표적 서열에 특이성이 있는 안티센스 뉴클레오타이드의 성질은 그것들을 예외적으로 다기능이 되도록 한다. 안티센스 뉴클레오타이드는 모노머 단위의 긴 사슬이기 때문에 이들은 표적 RNA 서열에 대해 쉽게 합성될 수 있다. 최근 많은 연구들은 표적 단백질을 연구하기 위한 생화학적 수단으로 안티센스 뉴클레오타이드의 유용성을 증명하였다(Rothenberg et al., J. Natl. Cancer Inst., 81:1539-1544, 1999). 올리고뉴클레오타이드 화학 및 향상된 세포흡착, 표적결합 친화도 및 뉴클레아제 내성을 나타내는 뉴클레오타이드 합성 분야에서 최근 많은 진보가 있었으므로 안티센스 뉴클레오타이드의 사용은 새로운 형태의 억제제로 고려될 수 있다.

상기 "짧은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA)" 또는 "shRNA"는 단일 가닥으로 50-60개로 구성된 뉴클레오타이드를 의미하며, in vivo에서 스템-루프(stem-loop) 구조를 이루고 있다. 즉, shRNA는 RNA간섭(RNA interference; RNAi)을 통해 유전자 발현을 억제하기 위한 타이트한 헤어핀 구조를 만드는 RNA 서열이다. 5-10개의 뉴클레오타이드의 루프 부위 양쪽으로 상보적으로 15-30개의 뉴클레오타이드의 긴 RNA가 염기쌍을 이루어 이중가닥의 스템을 형성한다. shRNA는 일반적으로 발현되도록 하기 위하여 U6 프로모터를 포함하는 벡터를 통해 세포 내로 형질도입되며 대개 딸세포로 전달되어 유전자 발현억제가 유전되도록 한다. shRNA 헤어핀 구조는 세포 내 기작에 의하여 절단되어 siRNA가 된 후 RISC(RNA-induced silencing complex)에 결합한다. 이들 RISC는 mRNA에 결합하여 이를 절단한다. shRNA는 RNA 폴리머레이즈(polymerase)에 의해 전사된다.

상기 "작은 간섭 RNA(small interfering RNA)" 또는 "siRNA"는 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNA간섭 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 타겟 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 타겟 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knock-down) 방법으로서 또는, 유전자치료(gene therapy)의 방법으로 제공된다.

상기 "마이크로 RNA(microRNA)" 또는 "miRNA"는 약 22개의 염기서열로 이루어진 짧은 non-coding RNA를 의미한다. 유전자의 발현 과정에서 전사 후 조절인자(post-transcriptional regulator)로서 기능을 한다고 알려져 있다. 상보적인 염기 서열을 가진 표적(target) mRNA에 상보적으로 결합함으로써 표적 mRNA들을 분해시키거나 단백질로 번역되는 것을 억제한다.

또한, 상기 MITF의 단백질 활성 억제제는 MITF 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 모방체, 기질 유사체, 앱타머, 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 "펩티드 모방체(peptide mimetics)"는 MITF 단백질의 결합 도메인을 억제하여 MITF 단백질의 활성을 억제하는 것이다. 펩티드 모방체는 펩티드 또는 비펩티드일 수 있고, psi 결합과 같은, 비펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산으로 구성될 수 있다. 또한, "구조적으로 강제된(conformationally constrained)" 펩티드, 사이클릭 모방체(cyclic mimetics), 적어도 하나의 엑소사이클릭 도메인(exocyclic domain), 결합 부분(결합 아미노산) 및 활성 부위를 포함하는 사이클릭 모방체일 수 있다. 펩티드 모방체는 MITF 단백질의 이차구조 특성과 유사하게 구조화되고 항체 또는 수용성 수용체와 같은 거대한 분자의 억제 특성을 모방할 수 있으며, 천연의 길항제와 동등한 효과로 작용할 수 있는 신규한 소분자일 수 있다.

상기 "앱타머(aptamer)"는 단일 사슬 DNA 또는 RNA 분자로서, SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라 불리는 올리고 뉴클레오타이드(oligonucleotide) 라이브러리를 이용한 진화적인 방법에 의해 특정 화학 분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 갖고 결합하는 올리고머를 분리하여 수득할 수 있다. 앱타머는 표적에 특이적으로 결합하고 표적의 활성을 조정할 수 있는데, 예컨대, 결합을 통하여 표적의 기능을 차단할 수 있다.

상기 "항체"는 MITF 단백질에 특이적이고 직접적으로 결합하여 MITF 단백질의 활성을 효과적으로 억제할 수 있다. 상기 MITF 단백질에 특이적으로 결합하는 항체로는 폴리클로날(polyclonal) 항체 또는 모노클로날(monoclonal) 항체를 사용할 수 있다. 상기 MITF 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 당업자에게 알려진 공지의 방법으로 제작하여도 무방하며, 상업적으로 알려진 MITF 항체를 구입하여 사용할 수 있다. 상기 항체는 당업자에게 알려진 종래 방법에 따라 면역원인 MITF 단백질을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 랫트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 포함한다. 면역원은 근육 내,복강 내 또는 피하 주사방법으로 주사되며, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여할 수 있다. 외부 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 형성된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하여 항체를 분리할 수 있다.

또한, 상기 MITF 억제제는 AMPK 활성촉진제(activator)일 수 있고, 구체적으로 상기 AMPK 활성촉진제는 베르베린(Berberine) 또는 카지놀 U(Kazinol U)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 AMPK 활성촉진제는 MITF 유전자의 발현 또는 MITF 단백질의 활성, 예컨대 전사활성을 억제한다.

본 발명에서, 상기 "골수-유래 억제세포" 또는 "MDSC"는 세포독성 T 림프구 (cytotoxic T lymphocyte), NK 세포의 활성을 저해함으로써 면역을 억제하는 기능을 한다. 자가면역과 같이 불필요한 과도한 면역 반응을 억제하는 순기능이 있지만, 면역 반응이 필요한 상황에서 면역을 억제하여 질병을 발생시키거나 악화시키거나 또는 적절한 치료를 방해하는 역기능도 있다. 예컨대, MDSC는 종양 또는 암 환자에서 많이 증가되어 있는데, 이는 암 백신 투여의 효과를 현저히 감소시킴으로써 암 백신의 효능을 무력화시킨다. 또한, 항암 면역 치료제로 사용되고 있는 면역관문억제제(Imuune Checkpoint Inhibitor, ICI)에 대한 환자의 내성에 기여하여 항암면역치료제의 효율을 떨어뜨린다. 이러한 상황, 구체적으로 종양을 갖는 개체의 MDSC의 수를 효과적으로 감소시키거나, MDSC의 활성을 효과적으로 억제시킨다면 MDSC에 의한 면역 반응 저하를 막아 암 백신 또는 항암 면역 치료제의 효능을 증대시킬 수 있고, 암 치료를 원활하고 효과적으로 수행할 수 있게 될 것이다.

상기 종양을 갖는 개체의 MDSC는 표현형이 CD11b⁺Gr1⁺PD-L1⁺인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 종양은 구체적으로 유방암, 피부 또는 안구 내 흑색종, 간암, 위암, 결장암, 폐암, 비소세포성폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 선암종, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 조성물은 MDSC를 저해할 필요가 있는 개체에 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 마우스의 골수에서 분리한 세포에 MDSC의 분화 유도 인자로 GM-CSF를 처리하여 마우스 골수유래 MDSC를 제작하였다.

또한, 본 발명자들은 마우스의 골수에서 분리한 세포에 MDSC의 분화 유도 인자인 GM-CSF와 함께 마우스 유방암 세포주를 배양한 배지(tumor cell-conditioned medium; TCCM)를 처리한 결과, GM-CSF에 의해 MDSC의 분화가 유도되고, TCCM에 의해 MDSC의 활성이 유도되며, 상기 활성이 유도된 MDSC에서 MITF의 유전자 및 단백질 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 상기 TCCM에 의해 활성이 유도된 MDSC와 T 세포를 공동배양한 결과, 활성이 유도된 MDSC에 의해 CD3⁺CD8⁺ T 세포 수가 감소하는 것을 확인하였다. 상기의 결과를 통해 암세포 환경에서 MDSC가 활성화되어 면역반응이 저하되고, MITF가 상기 MDSC의 활성화의 표적 인자로서 MDSC의 활성화에 관여하는 것을 확인하였다.

또한, 본 발명자들은 종양 형성 마우스의 비장 및 종양 부위에서 MDSC를 획득하였고, 상기 종양 부위에서 얻은 MDSC에서 높은 활성화 및 MITF의 발현이 나타나는 것을 확인하였다. 상기의 결과를 통해 암세포 환경에서 MDSC가 활성화되고, 상기 MDSC의 활성화에 MITF가 관여하는 것을 확인하였다.

또한, 본 발명자들은 마우스의 골수에서 분리한 세포에 MDSC의 분화 유도 인자인 GM-CSF와 함께 MDSC 활성을 유도하는 약물들, IL-18, IL-4, LPS 또는 스타틴(Statin) 계열 약물들을 처리한 결과, GM-CSF에 의해 MDSC의 분화가 유도되고, 상기 MDSC 활성 유도 약물들에 의해 MDSC의 활성이 유도되며, 상기 활성이 유도된 MDSC에서 MITF의 유전자 및 단백질 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 마우스의 골수에서 분리한 세포에 MDSC의 분화 유도 인자인 GM-CSF와 함께 MDSC 활성을 억제하는 약물로 ATRA(all-trans retinoic acid)를 처리한 결과, GM-CSF에 의해 MDSC의 분화가 유도되고, 상기 MDSC 활성 억제 약물에 의해 MDSC의 활성이 억제되며, 상기 활성이 억제된 MDSC에서 MITF의 유전자 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 상기의 결과를 통해 MDSC의 활성화에 MITF가 관여하는 것을 확인하였다.

또한, 본 발명자들은 마우스의 골수에서 분리한 세포에 MDSC의 분화 유도 인자인 GM-CSF와 함께 MITF 유도제로 IBMX를 처리한 결과, GM-CSF에 의해 MDSC의 분화가 유도되고, IBMX에 의해 MITF의 발현이 증가하며, 이때 MDSC가 활성화되는 것을 확인하였다. 반면, 마우스의 골수에서 분리한 세포에 MDSC의 분화 유도 인자인 GM-CSF와 함께 MITF 억제제로 베르베린(Berberine)을 처리한 결과, GM-CSF에 의해 MDSC의 분화가 유도되나, 상기 MITF 억제제에 의해 MITF 발현이 감소하고, 이때 MDSC의 활성이 억제되는 것을 확인하였다. 상기의 결과를 통해 MITF의 억제제를 이용하여 MDSC의 활성을 저해할 수 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명자들은 암세포 환경에서 MDSC가 활성화되어 면역반응이 저하되고, 상기 MDSC의 활성화에 MITF가 관여하며, 상기 MITF의 억제제를 이용하여 MDSC를 저해할 수 있음을 확인하였으므로, 상기 MITF 억제제를 유효성분으로 함유하는 조성물을 MDSC에 의한 면역반응 저하를 완화하고, 항암 면역치료 효율을 증대하는데 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.

또한, 상기 본 발명의 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.1 mg 내지 100 mg, 보다 구체적으로 0.5 mg 내지 10 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 질환의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 MITF 억제제를 유효성분으로 함유하는, 항암 보조제를 제공한다.

본 발명에서, 상기 MITF 억제제는 MITF의 유전자 발현 억제제 또는 MITF의 단백질 활성 억제제일 수 있다.

상기 MITF의 단백질 활성 억제제는 MITF 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 모방체, 기질 유사체, 앱타머, 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 MITF 억제제는 AMPK 활성촉진제(activator)일 수 있고, 구체적으로 상기 AMPK 활성촉진제는 베르베린(Berberine) 또는 카지놀 U(Kazinol U)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 항암 보조제는 항암제와 병용 투여될 수 있고, 상기 항암 보조제는 MDSC의 활성을 억제하여 MDSC에 의한 면역 반응 저하를 완화함으로써, 항암제의 효과를 유의적으로 상승시키는 항암 보조 효과를 나타낼 수 있다.

상기 항암제는 화학치료제, 타겟화된 치료제, 항체 치료제, 면역치료제 및 호르몬 치료제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 화학치료제는 예를 들어, 대사길항물질(예를 들어, 폴산, 푸린, 및 피리미딘 유도체), 알킬화제(예를 들어, 질소 머스타드, 니트로소우레아, 백금, 알킬 설포네이트, 히드라진, 트리아젠, 아지리딘, 방추체 저해제, 세포독성제, 토포이소머라제 억제제 및 기타) 또는 저메틸화제(예를 들어, 제불라린, 이소티오시아네이트, 아자시티딘(5-아자시티딘), 5-플루오로-2'-데옥시시티딘, 5,6-디하이드로-5-아자시티딘 및 기타)가 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 타겟화된 치료제는 암 세포의 조절되지 않는 단백질에 대해 특이적인 제제로 예를 들어, 티로신 키나제 억제제, 예를 들어 악시티니브(Axitinib), 보수티니브(Bosutinib), 세디라니브(Cediranib), 다사티니브(Dasatinib), 에르로티니브(Erlotinib), 이마티니브(Imatinib), 게피티니브(Gefitinib), 라파티니브(Lapatinib), 레스타우르티니브(Lestaurtinib), 닐로티니브(Nilotinib), 세막사니브(Semaxanib), 소라페니브(Sorafenib), 수니티니브(Sunitinib), 및 반데타니브(Vandetanib), 또는 시클린-의존성 키나제 억제제, 예를 들어 알보시디브(Alvocidib) 및 셀리시크리브(Seliciclib)가 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 항체 치료제는 암 세포의 표면 상에서 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 제제로 예를 들어, 트라스투주맙(Trastuzumab), 리툭시맙(Rituximab), 토시투모맙(Tositumomab), 세툭시맙(Cetuximab), 파니투무맙(Panitumumab), 알렘투주맙(Alemtuzumab), 베바시주맙(Bevacizumab), 에드레콜로맙(Edrecolomab) 또는 겜투주맙(Gemtuzumab)이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 면역 치료제는 종양을 공격하기 위해 피검체의 자체 면역계를 유도하도록 설계된 제제로 예를 들어, 이필리루맙(Ipilimumab), 아벨루맙(Avelumab), 니볼루맙(Nivolumab) 또는 펨브롤리주맙(Pembrolizumab)이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 호르몬 치료제는 특정 암에서 호르몬을 제공하거나 차단함으로써 암의 성장을 억제하는 제제로 예를 들어, 타목시펜(Tamoxifen) 또는 디에틸스틸베스테롤(diethylstilbestrol)이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 항암제의 적절한 투여량은 이미 당업계에 널리 알려져 있으므로, 각 환자의 상태에 따라 당업계에 알려진 기준에 의해 투여할 수 있다. 구체적인 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 투여 용량은 예를 들어 구체적으로는 1 mg/kg/일 내지 10 g/kg/일, 더 구체적으로는 10 mg/kg/일 내지 100 mg/kg/일이 될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 투여하고자 하는 대상의 연령, 건강 상태, 합병증 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 암세포 환경에서 MDSC가 활성화되어 면역반응이 저하되고, 상기 MDSC의 활성화에 MITF가 관여하며, 상기 MITF의 억제제를 이용하여 MDSC의 활성을 억제할 수 있음을 확인하였으므로, 상기 MITF 억제제를 항암 면역치료의 항암 보조제로 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 MITF 억제제를 MDSC의 저해가 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, MDSC 저해방법을 제공한다.

상기 MITF 억제제 및 MDSC에 대한 구체적인 설명은 상기 조성물에 대한 설명과 동일한 바, 구체적인 설명은 상기 내용을 원용하고, 이하에서는 MDSC 저해방법에 특유한 구성에 대해서만 설명하도록 한다.

본 발명에서, 상기 "골수-유래 억제세포 저해" 또는 "MDSC 저해"는 MDSC의 활성을 억제시키는 것뿐만 아니라, MDSC의 수를 감소시키는 것까지도 포함한다. 수를 감소시키는 것은 세포의 생성을 억제하는 것뿐만 아니라, 이미 생성된 세포를 사멸시키거나 다른 세포로 분화시키는 것도 포함한다. 그 외에도 생물학적 관점에서 "저해"라고 지칭되고 있는 모든 매커니즘이 포함된다.

본 발명에서, 상기 MDSC의 저해가 필요한 개체는 구체적으로 MDSC의 저해가 필요한 종양을 갖는 개체일 수 있고, 상기 종양을 갖는 개체의 MDSC는 표현형이 CD11b⁺Gr1⁺PD-L1⁺인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 종양은 구체적으로 유방암, 피부 또는 안구 내 흑색종, 간암, 위암, 결장암, 폐암, 비소세포성폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 선암종, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 암세포 환경에서 MDSC가 활성화되어 면역반응이 저하되고, 상기 MDSC의 활성화에 MITF가 관여하며, 상기 MITF의 억제제를 이용하여 MDSC의 활성을 억제할 수 있음을 확인하였으므로, 상기 MITF 억제제를 MDSC의 저해가 필요한 개체에 투여하여 MDSC 관련 질환 치료에 이용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 골수-유래 억제세포(myeloid-derived suppressor cells, MDSC) 제작

<1-1> 마우스 골수유래 MDSC 제작

Balb/c 마우스의 골수(bone marrow, BM)로부터 도 1의 모식도와 같이 골수-유래 억제세포(myeloid-derived suppressor cells, MDSC)를 제작하였다.

구체적으로, 6 내지 8주령 된 Balb/c 마우스는 Saeronbio. Inc.(한국)에서 구입하였다. 동물실험은 Institutional Ethical Committee of Sookmyung Women’s University (SMWU-IACUC-1708-017-02)의 승인을 받아 수행하였다. 6 내지 8주령 된 Balb/c 마우스의 넙적다리뼈를 적출하여 뼈 안의 골수를 분리한 뒤, RBC lysis buffer(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)를 처리하여 적혈구를 제거하여 세포를 얻었다. 얻어진 골수세포를 5×10⁵ cells/㎖의 세포 수로 24-웰 플레이트에서 10 ng/㎖ 농도의 GM-CSF가 포함된 RPMI 배지(Invitrogen, Grand Island, NY)로 96시간 동안 배양하여 MDSC의 분화를 유도하였다.

<1-2> 종양 형성 마우스에서의 MDSC 제작

Balb/c 마우스에 유방암 세포주를 주사하여 종양 형성 마우스를 제작하고, 상기 종양 형성 마우스로부터 MDSC를 제작하였다.

구체적으로 6 내지 8주령 된 Balb/c 마우스에 마우스 유방암 세포주인 4T1 세포를 5×10⁵ cells/100 ㎕ 의 세포 수로 포함하는 100 ㎕ PBS를 오른쪽 옆구리 쪽에 피하 주사하여 종양을 형성하였다. 상기 마우스는 12시간 명/암 주기에서 온도 23.5 ± 1℃, 습도 50 ± 5%의 숙명여자대학교 동물 실험실에서 사육하였다. 2주 뒤 종양, 골수 및 비장을 각각 적출하여 세포를 분리하였다. 그 다음, 형광 결합된 항-CD11b 항체, 항-Gr1 항체 및 MDSC 활성 마커인 PD-L1 항체를 이용하여 염색한 후, FACS(Fluorescence-acitivated cell sorting) 분석을 수행하여 MDSC의 분화 및 활성을 확인하였다. 상기 항체는 eBioscience (San Diago, CA)에서 구입하였다.

<실시예 2> 암세포 환경에서 MDSC에 의한 면역반응 저하 확인

<2-1> 암세포 환경에서 MDSC 활성 확인

암세포 환경에서 MDSC에 의해 면역반응이 저하되는지 알아보기 위하여, 암세포를 배양한 배지를 처리한 MDSC의 활성을 확인하였다.

구체적으로, 마우스 유방암 세포주인 4T1 세포를 10% 소태아혈청(FBS), 100 unit 항생제-항균제를 함유하는 RPMI 배지(Invitrogen, Grand Island, NY) 10 ml로 5% CO₂, 37℃ 조건 하에서 3일 동안 배양하여 세포가 80% 포화 상태가 되도록 하였다. 그 다음, 배양 배지를 회수하고 4℃로 유지된 centrifuge에 3000 g로 20분간 3000 NMWL (nominal molecular weight limit) centrifugal filter (Merck Milipore, Billerica, MA)로 농축하여 TCCM(tumor cell-conditioned medium)을 획득하였다. 상기 <실시예 1>에서 개시된 방법과 동일한 방법으로 골수세포 얻은 후, 5×10⁵ cells/㎖의 세포 수로 24-웰 플레이트에서 상기 획득한 TCCM 및 10 ng/㎖ 농도의 GM-CSF가 포함된 RPMI 배지로 96시간 동안 배양하여 MDSC의 분화를 유도하였다. 대조군으로 GM-CSF가 포함된 RPMI 배지로 분화를 유도한 MDSC를 이용하였다.

MDSC의 분화를 확인하기 위하여, 상기 분화 유도한 MDSC를 회수하여 형광 결합된 항-CD11b 항체 및 항-Gr1 항체로 염색한 후, FACS 분석을 수행하였다(도 2A).

또한, MDSC의 활성을 확인하기 위하여, 상기 분화 유도한 MDSC를 회수하여 MDSC의 활성 마커인 iNOS, IL-10 및 TGF-β에 대한 qRT-PCR을 수행하였다. 상기 분화 유도한 MDSC를 회수하고 TRIzol Reagent Solution(Invitrogen)을 사용하여 제조사의 절차에 따라 총 RNA를 분리하였다. 그 다음, 분리한 총 RNA를 이용하여 qRT-PCR을 수행하였다. M-MLV 역전사 키트(Promega, Madison, WI)와 oligo-(dT) 프라이머와 dNTP(Bioneer, 한국)를 사용하여 제조사의 절차에 따라 분리한 총 RNA를 역전사하고, ABI Real-time PCR 7500 시스템에서 iNOS, IL-10, TGF-β 및 cyclophilin에 대한 프라이머 및 SYBR Green PCR Master Mix (Applied Bosystems, Foster City, CA)를 이용하여 제조사의 절차에 따라 정량적 PCR을 수행하였다. 이때 대조군으로 cyclophilin을 사용하였다. iNOS, IL-10, TGF-β 및 cyclophilin에 대한 프라이머는 Bioneer에서 구입하였다. 상기 실험은 3번 반복 수행하였다(도 2B).

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 대조군(GM-CSF) 및 TCCM 처리군(GM+TCCM) 모두 유사한 정도로 MDSC의 분화가 유도됨을 확인하였다(도 2A). 반면, TCCM 처리군(GM+TCCM)의 경우 MDSC의 활성 마커인 iNOS, IL-10 및 TGF-β의 발현이 대조군에 비해 높게 나타나므로, TCCM에 의해 MDSC의 활성이 유도됨을 확인하였다(도 2B).

<2-2> 암세포 환경에서 활성화된 MDSC의 MITF 발현 증가 확인

상기 실시예 <2-1>의 TCCM에 의해 활성이 유도된 MDSC에서 MITF(microphthalmia-associated transcription factor)의 유전자 및 단백질 발현 변화를 확인하였다.

구체적으로, MITF의 유전자 발현을 확인하기 위하여 상기 실시예 <2-1>에서 회수한 MDSC를 이용하여 상기 실시예 <2-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 MITF에 대한 qRT-PCR을 수행하였다. MITF에 대한 프라이머는 Bioneer에서 구입하였다(도 3A).

또한, MITF의 단백질 발현을 확인하기 위하여 상기 실시예 <2-1>에서 회수한 MDSC를 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다. 이를 위해 상기 실시예 <2-1>에서 회수한 MDSC에 세포 용해 버퍼를 처리하여 용해하였다. 세포 용해물을 10% SDS-PAGE 겔로 전기영동하여 분리하고, PVDF 멤브레인에 옮겼다. 그 다음, 일차 항체로 항-MITF 항체 및 항-액티닌(actinin) 항체를 처리하여 반응시킨 후, 상기 막에 붙은 일차 항체에 HRP-접합 이차 항체를 붙이고, 이를 enhanced chemiluminescence(PicoEPD™ Western Reagent kit, ELPIS-Biotech, Daejeon, Republic of Korea)을 이용하여 LAS-3000 imaging system (FUJIFILM Corporation, Tokyo, Japan)으로 분석하였다. 액티닌은 대조 단백질로 사용하였다(도 3B).

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, TCCM 처리군(GM+TCCM)의 경우 대조군(GM-CSF)에 비해 MITF의 유전자 발현(도 3A) 및 단백질 발현(도 3B)이 증가하는 것으로 나타나므로, MITF가 TCCM에 의해 활성이 유도된 MDSC에서 특이적으로 발현되는 표적 인자임을 확인하였다.

<2-3> 암세포 환경에서 MDSC에 의한 면역반응 저하 확인

MDSC는 T 세포의 증식 및 기능을 억제하여 면역반응을 저하하는 것으로 알려져 있다. 이에 암세포 환경에서 MDSC에 의해 면역반응이 저하되는지 알아보기 위하여, 암세포를 배양한 배지를 처리한 MDSC를 이용하여 T 세포 활성 억제 정도를 확인하였다.

구체적으로, 6 내지 8주령 된 Balb/c 마우스의 비장을 적출하여 세포를 분리하였다. 그 다음, 형광 결합된 항-CD3 항체를 이용하여 염색한 후, FACS를 이용하여 T 세포를 분리하였다. 분리한 T 세포를 2.5 μM CFSE로 7 분간 염색하여 CFSE 표지(Labeling)을 수행하였다. 5×10⁵ 개의 CFSE 표지된 CD3⁺ T 세포를 항-CD3 단일 클론 항체 및 가용성 항-CD28 단일 클론 항체로 코팅한 플레이트에서 2시간 동안 자극한 후, 상기 실시예 <2-1>에서 회수한 MDSC를 5×10⁵세포 수 또는 10×10⁵ 세포 수로 넣어주고, 3일 동안 배양하였다. 배양 3일 후 형광 결합된 항-CD8 항체를 이용하여 염색한 후, FACS 분석을 수행하여 CD8⁺ T 세포의 증식 정도를 측정하였다. 상기 항체는 eBioscience사에서 구입하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, TCCM 처리군(GM+TCCM)과 T 세포를 공동배양할 경우 대조군(GM-CSF)과 공동배양한 경우에 비해 CD3⁺CD8⁺ T 세포 수가 감소하므로, TCCM에 의해 활성이 유도된 MDSC가 T 세포 증식을 억제함을 확인하였다.

상기 결과를 통해 암세포 환경에서 MDSC가 활성화되어 면역반응을 저하하고, MITF가 상기 MDSC의 활성화의 표적 인자로서 MDSC의 활성화에 관여하는 것을 알 수 있다.

<실시예 3> 종양 형성 마우스의 MDSC에서의 활성 및 MITF 발현 확인

종양 형성 마우스에서 MDSC가 활성화되고, 상기 MDSC의 활성화에 MITF가 관여하는지 알아보기 위하여, 종양 형성 마우스에서의 MDSC를 이용하여 이의 활성 및 MITF의 유전자 발현 변화를 확인하였다.

구체적으로, MDSC의 활성을 확인하기 위하여 상기 실시예 <1-2>에 개시된 방법과 동일한 방법으로 종양 형성 마우스의 비장 및 종양 각각에서 세포를 분리한 후 FACS 분석을 수행하였다(도 5A). 또한, 상기 FACS sorter로 CD11b⁺Gr1⁺MDSC를 회수하여 상기 실시예 <2-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 qRT-PCR을 수행하였다(도 5B). 대조군으로는 분리(sorting)하기 전의 종양 형성 마우스의 비장을 이용하였다.

또한, MITF의 유전자 발현을 확인하기 위하여, 상기 회수한 CD11b⁺Gr1⁺MDSC를 이용하여 상기 실시예 <2-2>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 qRT-PCR을 수행하였다(도 5C).

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 종양 형성 마우스의 비장 및 종양 부위에서 얻은 MDSC는 대조군에 비해 활성화된 형태를 띠고(도 5A 및 도 5B), MITF의 유전자 발현이 증가해 있음을 확인하였다(도 5C). 특히, 종양 부위에서 얻은 MDSC가 비장 부위에서 얻은 것에 비해 활성화가 더 많이 되어 있고, MITF의 발현이 현저히 높게 나타나는 것을 확인하였다.

상기 결과를 통해 암세포 환경에서 MDSC가 활성화되고, 상기 MDSC의 활성화에 MITF가 관여하는 것을 알 수 있다.

<실시예 4> 활성을 유도한 MDSC에서 MITF 발현 증가 확인

MITF와 MDSC의 상관성을 알아보기 위하여, MDSC의 활성을 유도하는 약물을 처리한 후 MITF 발현 변화를 확인하였다.

<4-1> IL-18로 활성 유도한 MDSC에서 MITF 발현 증가 확인

MDSC의 활성을 유도하는 약물로 IL-18을 처리하고 MDSC의 분화를 유도한 후, MITF의 유전자 및 단백질 발현 변화를 확인하였다.

구체적으로, 상기 <실시예 1>에서 개시된 방법과 동일한 방법으로 골수세포 얻은 후, 5×10⁵ cells/㎖의 세포 수로 24-웰 플레이트에서 10 또는 50 ng/㎖ 농도의 IL-18, 및 10 ng/㎖ 농도의 GM-CSF가 포함된 RPMI 배지로 96시간 동안 배양하여 MDSC의 분화를 유도하였다. 대조군으로 GM-CSF가 포함된 RPMI 배지로 분화를 유도한 MDSC를 이용하였다.

상기 분화 유도한 MDSC를 회수하여 상기 실시예 <2-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 FACS 분석을 수행하여 MDSC의 분화를 확인하였다(도 6A).

또한, 상기 분화 유도한 MDSC를 회수하여 상기 실시예 <2-1> 및 <2-2>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 qRT-PCR을 수행하여 MDSC의 활성을 확인하고(도 6B), MITF의 유전자 발현을 확인하였다(도 6C).

또한, 상기 분화 유도한 MDSC를 회수하여 상기 실시예 <2-2>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 웨스턴 블럿팅을 수행하여 MITF의 단백질 발현을 확인하였다(도 6D).

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 대조군 및 IL-18 처리군 모두 유사한 정도로 MDSC의 분화가 유도됨을 확인하였다(도 6A). 반면, IL-18 처리군의 경우 IL-18 처리 농도 의존적으로 MDSC의 활성이 증가하고(도 6B), MITF의 유전자 발현(도 6C) 및 단백질 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 6D).

<4-2> IL-4로 활성 유도한 MDSC에서 MITF 발현 증가 확인

MDSC의 활성을 유도하는 약물로 IL-4를 처리하고 MDSC의 분화를 유도한 후, MITF의 유전자 발현 변화를 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <3-1>에 기재된 방법에 따라 MDSC의 분화 및 활성을 유도하되, 활성을 유도하는 약물로 10 ng/㎖의 IL-4를 처리하였다.

상기 분화 유도한 MDSC를 회수하여 상기 실시예 <2-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 FACS 분석을 수행하여 MDSC의 분화를 확인하였다(도 7A).

또한, 상기 분화 유도한 MDSC를 회수하여 상기 실시예 <2-1> 및 <2-2>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 MDSC의 활성을 확인하고(도 7B), MITF의 유전자 발현을 확인하였다(도 7C).

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 대조군 및 IL-14 처리군 모두 MDSC의 분화가 유도됨을 확인하였다(도 7A). 반면, IL-4 처리군의 경우 IL-4에 의해 MDSC의 활성화가 유도되고(도 7B), 대조군과 비교하여 MITF의 유전자 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 7C).

<4-3> LPS로 활성 유도한 MDSC에서 MITF 발현 증가 확인

MDSC의 활성을 유도하는 약물로 LPS를 처리하고 MDSC의 분화를 유도한 후, MITF의 유전자 발현 변화를 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <3-1>에 기재된 방법에 따라 MDSC의 분화 및 활성을 유도하되, 활성을 유도하는 약물로 100 ng/㎖의 LPS를 처리하였다.

상기 분화 유도한 MDSC를 회수하여 상기 실시예 <2-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 FACS 분석을 수행하여 MDSC의 분화를 확인하였다(도 8A).

또한, 상기 분화 유도한 MDSC를 회수하여 상기 실시예 <2-1> 및 <2-2>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 MDSC의 활성을 확인하고(도 8B), MITF의 유전자 발현을 확인하였다(도 8C).

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 대조군 및 LPS 처리군 모두 MDSC의 분화가 유도됨을 확인하였다(도 8A). 반면, LPS 처리군의 경우 LPS에 의해 MDSC의 활성화가 유도되고(도 8B), 대조군과 비교하여 MITF의 유전자 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 8C).

<4-4> 스타틴(Statin) 계열 약물로 활성 유도한 MDSC에서 MITF 발현 증가 확인

스타틴(Statin) 계열 약물인 심바스타틴(Simvastatin)은 IRF4(Interferon regulatory factor 4)의 발현을 억제하여 MDSC의 활성을 유도하는 것으로 알려져 있다. 이에 MDSC의 활성을 유도하는 약물로 스타틴 계열 약물을 처리하고 MDSC의 분화를 유도한 후, MITF의 유전자 및 단백질 발현 변화를 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <3-1>에 기재된 방법에 따라 MDSC의 분화 및 활성을 유도하되, 활성을 유도하는 약물로 심바스타틴(Sim, 0.5 또는 1 μM), 로바스타틴(Lovastatin, Lova, 0.5 또는 1 μM), 프로바스타틴(Pravastatin, Prav, 5 또는 10 μM), 로수바스타틴(Rosuvastatin, Rosu, 0.5 또는 1 μM), 또는 아토바스타틴(Atorvastatin, Ator, 0.05 또는 0.1 μM)을 처리하였다(도 9 및 도 10).

또한, 상기 실시예 <1-1>에 기재된 방법에 따라 GM-CSF가 포함된 RPMI 배지로 96시간 동안 배양하여 MDSC의 분화를 유도하고, 상기 스타틴 계열 약물을 24시간 동안 처리하였다(도 11 및 도 12).

그 다음, 상기 MDSC를 회수하여 상기 실시예 <2-1> 및 <2-2>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 MDSC의 분화(도 9 및 도 11) 및 활성(도 10A 및 도 12A)을 확인하고, MITF의 유전자 발현(도 10B 및 도 12B) 및 단백질 발현(도 10C)을 확인하였다.

그 결과, 도 9 내지 도 12에 나타낸 바와 같이, 대조군 및 스타틴 계열 약물 처리군 모두 유사한 정도로 MDSC의 분화가 유도됨을 확인하였다(도 9 및 도 11). 반면, 스타틴 계열 약물 처리군의 경우 MDSC의 분화 초기부터 스타틴 계열 약물 처리한 경우(도 10) 및 이미 분화된 MDSC에 스타틴 계열 약물을 처리한 경우(도 12) 모두 스타틴 계열 약물에 의해 MDSC의 활성화가 유도되고(도 10A 및 도 12A), 대조군과 비교하여 MITF의 유전자 발현(도 10B 및 도 12B) 및 단백질 발현(도 10C)이 증가하는 것을 확인하였다.

상기 결과를 통해 활성이 유도된 MDSC에서 MITF의 발현이 증가하는 것을 확인하였으므로, MDSC의 활성화에 MITF가 관여하는 것을 알 수 있다.

<실시예 5> 활성을 억제한 MDSC에서 MITF 발현 감소 확인

ATRA(all-trans retinoic acid)는 MDSC의 활성을 억제하는 것으로 알려져 있다. 이에 MITF와 MDSC의 상관성을 알아보기 위하여, MDSC의 활성을 억제하는 약물로 ATRA를 처리한 후 MITF 발현 변화를 확인하였다.

구체적으로, 상기 <실시예 1>에 개시된 방법과 동일한 방법으로 골수세포 얻은 후, 5×10⁵ cells/㎖의 세포 수로 24-웰 플레이트에서 ATRA(0.5 또는 1 μM) 및 10 ng/㎖ 농도의 GM-CSF가 포함된 RPMI 배지로 96시간 동안 배양하여 MDSC의 분화를 유도하였다(도 13).

상기 분화 유도한 MDSC를 회수하여 상기 실시예 <2-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 FACS 분석을 수행하여 MDSC의 분화를 확인하였다(도 13A).

또한, 상기 분화 유도한 MDSC를 회수하여 상기 실시예 <2-1> 및 <2-2>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 qRT-PCR을 수행하여 MDSC의 활성을 확인하였다(도 13B), MITF의 유전자 발현을 확인하였다(도 13C).

그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, 대조군 및 ATRA 처리군 모두 유사한 정도로 MDSC의 분화가 유도됨을 확인하였다(도 13A). 반면 ATRA 처리군의 경우 ATRA에 의해 MDSC의 활성화가 억제되고(도 13B), 대조군과 비교하여 MITF의 유전자 발현이 감소하는 것을 확인하였다(도 13C).

상기 결과를 통해 활성이 억제된 MDSC에서 MITF의 발현이 감소하는 것을 확인하였으므로, MDSC의 활성화에 MITF가 관여하는 것을 알 수 있다.

<실시예 6> MITF 조절에 의한 MDSC 활성 변화 확인

<6-1> MITF 유도제에 의한 MDSC의 활성 증가 확인

흑색종 세포에서 IBMX가 MITF의 발현을 유도하는 것이 알려져 있다. 이에, MITF의 발현 또는 활성 조절이 MDSC 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, MITF 발현 유도제로 IBMX를 처리한 MDSC의 활성 변화를 확인하였다.

구체적으로, 상기 <실시예 1>에서 개시된 방법과 동일한 방법으로 골수세포 얻은 후, 5×10⁵ cells/㎖의 세포 수로 24-웰 플레이트에서 10 μM 농도의 IBMX 및 10 ng/㎖ 농도의 GM-CSF가 포함된 RPMI 배지로 96시간 동안 배양하여 MDSC의 분화를 유도하였다. 대조군으로 GM-CSF가 포함된 RPMI 배지로 분화를 유도한 MDSC를 이용하였다.

상기 분화 유도한 MDSC를 회수하여 상기 실시예 <2-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 FACS 분석을 수행하여 MDSC의 분화를 확인하였다(도 14A).

또한, 상기 분화 유도한 MDSC를 회수하여 상기 실시예 <2-1> 및 <2-2>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 qRT-PCR을 수행하여 MDSC의 활성을 확인하고(도 14B), MITF의 유전자 발현을 확인하였다(도 14C).

그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, 대조군 및 IBMX 처리군 모두 유사한 정도로 MDSC의 분화가 유도됨을 확인하였다(도 14A). 반면, IBMX 처리군의 경우 대조군과 비교하여 MITF의 유전자 발현이 증가하고(도 14C), MDSC의 활성이 증가하는 것을 확인하였다(도 14B).

<6-2> MITF 억제제에 의한 MDSC 활성 저해 확인

베르베린(Berberine), 카지놀 U(Kazinol U) 등은 AMPK 활성촉진제(AMPK activator)이면서 멜라닌 세포에서 MITF의 발현 또는 활성을 억제하는 것이 알려져 있다. 이에 MITF의 발현 또는 활성 조절이 MDSC 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, MITF 억제제로 베르베린을 처리한 MDSC의 활성 변화를 확인하였다.

구체적으로, 상기 <실시예 1>에 개시된 방법과 동일한 방법으로 골수세포 얻은 후, 5×10⁵ cells/㎖의 세포 수로 24-웰 플레이트에서 10 μM 농도의 베르베린 및 10 ng/㎖ 농도의 GM-CSF가 포함된 RPMI 배지로 96시간 동안 배양하여 MDSC의 분화를 유도하였다. 대조군으로 GM-CSF가 포함된 RPMI 배지로 분화를 유도한 MDSC를 이용하였다.

상기 분화 유도한 MDSC를 회수하여 상기 실시예 <2-2>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 qRT-PCR을 수행하여 MITF의 발현을 확인하였다(도 15A).

또한, 상기 분화 유도한 MDSC를 회수하여 상기 실시예 <2-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 FACS 분석을 수행하여 MDSC의 분화를 확인하였다(도 15B).

또한, 상기 분화 유도한 MDSC를 회수하여 상기 실시예 <2-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 qRT-PCR을 수행하여 MDSC의 활성을 확인하였다(도 15C).

그 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이, 베르베린 처리군의 경우 베르베린에 의해 MITF의 발현이 억제되고(도 15A), MDSC의 분화가 다소 감소하는 것을 확인하였다(도 15B). 또한, 베르베린 처리군의 경우 대조군과 비교하여 MDSC의 활성이 유의적으로 저해되는 것을 확인하였다(도 15C).

상기의 결과를 통해 MITF의 발현 또는 전사활성을 억제하여 MDSC의 활성을 저해할 수 있음을 알 수 있다.

상기 <실시예 1> 내지 <실시예 6>을 통해 암세포 환경에서 MDSC가 활성화되어 면역반응이 저하되고, 상기 MDSC의 활성화에 MITF가 관여하며, 상기 MITF의 억제제를 이용하여 MDSC의 활성을 억제할 수 있음을 확인하였으므로, 상기 MITF 억제제를 포함하는 조성물을 MDSC의 저해가 필요한 개체, 예컨대 종양을 갖는 개체에 투여하여 MDSC에 의한 면역반응 저하를 완화하는데 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 상기 MITF 억제제를 포함하는 조성물을 항암제, 예컨대 항암면역치료제와 병용 투여하여 항암 면역치료 효율을 증대하는 보조요법으로 유용하게 사용할 수 있다.

Claims

MITF(microphthalmia-associated transcription factor) 억제제로 AMPK 활성촉진제(activator)인 베르베린(Berberine)을 유효성분으로 함유하는, 유방암을 갖는 개체의 골수-유래 억제세포(myeloid-derived suppressor cell; MDSC)에 의한 면역 반응 저하의 완화, 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 종양을 갖는 개체의 MDSC는 표현형이 CD11b⁺Gr1⁺PD-L1⁺인 것을 특징으로 하는, 종양을 갖는 개체의 MDSC에 의한 면역 반응 저하의 완화, 치료 또는 예방용 약학 조성물.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 MDSC를 저해할 필요가 있는 개체에 투여하기 위한 것을 특징으로 하는, 종양을 갖는 개체의 MDSC에 의한 면역 반응 저하의 완화, 치료 또는 예방용 약학 조성물.