CN109081803B

CN109081803B - 极性氨基酸修饰的吲哚乙醇衍生物，其合成，活性和应用

Info

Publication number: CN109081803B
Application number: CN201710443464.3A
Authority: CN
Inventors: 赵明; 彭师奇; 王玉记; 吴建辉; 甘太平; 吴晨
Original assignee: Capital Medical University
Current assignee: Capital Medical University
Priority date: 2017-06-13
Filing date: 2017-06-13
Publication date: 2021-03-30
Anticipated expiration: 2037-06-13
Also published as: CN109081803A

Abstract

本发明公开了下式的1‑(乙酰‑AA‑OBzl)‑3‑(乙氧基乙酰‑AA‑OBzl)吲哚(式中AA为L‑Ser残基,L‑Thr残基,L‑Gln残基,L‑Asn残基和L‑Cys(Bzl)残基)。公开了它们的制备方法、公开了它们的抗肿瘤活性，公开了它们的抗肿瘤转移活性，以及公开了它们的抗炎活性活性，因而本发明公开了它们在制备抗肿瘤药物，抗肿瘤转移药物和抗炎药物中的应用。

Description

极性氨基酸修饰的吲哚乙醇衍生物，其合成，活性和应用

技术领域

本发明涉及1-(乙酰-AA-OBzl)-3-(乙氧基乙酰-AA-OBzl)吲哚,涉及它们的制备方法，涉及它们的抗肿瘤活性，涉及它们的抗肿瘤转移活性,以及涉及它们的抗炎活性活性，因而本发明涉及它们在制备抗肿瘤药物，抗肿瘤转移药物和抗炎药物中的应用。本发明属于生物医药领域。

背景技术

恶性肿瘤严重威胁人类健康。其中肺癌是最具侵略性的人类癌症之一。对于肺癌患者晚期的患者，通常10％-15％的人只能存活5年。在过去的30年里这种困难的局面尚未显著有所改善。在很多临床病例中，肺癌在被诊断之前已经转移到周围组织。肿瘤转移，尤其是肿瘤肺转移是肿瘤患者死亡的最大风险。至今，仍然没有可预防肿瘤转移的抗肿瘤药物用于临床。炎症则会进一步恶化肿瘤及肿瘤转移患者的预后。至今，更没有可预防炎症及肿瘤转移的抗肿瘤药物用于临床。发明具有抗肿瘤，抗肿瘤转移和抗炎三重作用的药物是抗肿瘤药物研究的前沿。发明人的前期发明(专利申请公布号CN 106349148A，申请号CN201510409682.6) 曾经公开,在0.2μmol/kg剂量下氨基酸苄酯取代的双吲哚乙酸醇具有抗肿瘤，抗肿瘤转移和抗炎三重作用(左式)。发明人对这类双吲哚乙醇氨基酸酸苄酯有两点不满意。第一点不满意是MTT模型显示它们的抗肿瘤活性来自细胞毒作用(除1个化合物外，其余所有化合物抑制5 种肿瘤细胞增殖的IC₅₀为8.2-62.2μM)。临床应用显示，细胞毒类药物都有较大的毒副作用。也就是说，这类双吲哚乙醇氨基酸酸苄酯面临较大的毒副作用的风险。第二点不满意是它们发挥抗肿瘤，抗肿瘤转移和抗炎三重作用的最低有效剂量是0.2μmol/kg，偏高。在过去的两年里，发明人一直在寻找最低有效剂量比0.2μmol/kg低的非细胞毒类的具有抗肿瘤，抗肿瘤转移和抗炎三重作用的化合物。最终发明人发现，极性氨基酸苄酯(Ser-OBzl,Thr-OBzl, Gln-OBzl,Asn-OBzl和Cys(Bzl)-OBzl)修饰的吲哚乙醇(右式)在0.02μmol/kg剂量下具有抗肿瘤，抗肿瘤转移和抗炎三重作用。因为药物的毒副作用都可以随剂量降低而消失，所以有效剂量降低10倍表明了这种结构修饰有突出的技术效果。此外，MTT模型显示它们对肿瘤细胞增殖的IC₅₀均大于200μM。也就是说，极性氨基酸苄酯(Ser-OBzl,Thr-OBzl,Gln-OBzl, Asn-OBzl和Cys(Bzl)-OBzl)修饰的吲哚乙醇还没有细胞毒类化合物的毒副作用。根据两方面的优势，发明人提出了本发明。

发明内容

本发明的第一个内容是提供下式的1-(乙酰-AA-OBzl)-3-(乙氧基乙酰-AA-OBzl)吲哚(式中AA为L-Ser残基,L-Thr残基,L-Gln残基,L-Asn残基和L-Cys(Bzl)残基)。

本发明的第二个内容是提供1-(乙酰-AA-OBzl)-3-(乙氧基乙酰-AA-OBzl)吲哚(AA为 L-Ser残基,L-Thr残基,L-Gln残基,L-Asn残基和L-Cys(Bzl)残基)的制备方法,该方法由以下步骤构成：

1)在氢化钠催化下吲哚乙醇与溴乙酸乙酯在四氢呋喃中80℃反应，生成为1-乙氧羰甲基-3- 乙氧羰甲氧基乙基-吲哚(1)；

2)在浓度为2N的NaOH水溶液中化合物1皂化得到1-羧甲基-3-羧甲氧基乙基吲哚(2)；

3)在二环己基碳二亚胺和N-羟基苯并三氮唑存在下化合物2在无水四氢呋喃中与L-氨基酸苄酯反应，生成1-(乙酰-AA-OBzl)-3-(乙氧基乙酰-AA-OBzl)吲哚(AA为L-Ser残基,L-Thr残基,L-Gln残基,L-Asn残基和L-Cys(Bzl)残基)。

本发明的第三个内容是评价1-(乙酰-AA-OBzl)-3-(乙氧基乙酰-AA-OBzl)吲哚(AA为L-Ser 残基,L-Thr残基,L-Gln残基,L-Asn残基和L-Cys(Bzl)残基)的抗肿瘤转移活性。

本发明的第四个内容是评价1-(乙酰-AA-OBzl)-3-(乙氧基乙酰-AA-OBzl)吲哚(AA为L-Ser 残基,L-Thr残基,L-Gln残基,L-Asn残基和L-Cys(Bzl)残基)的抗肿瘤活性。

本发明的第三个内容是评价1-(乙酰-AA-OBzl)-3-(乙氧基乙酰-AA-OBzl)吲哚(AA为L-Ser 残基,L-Thr残基,L-Gln残基,L-Asn残基和L-Cys(Bzl)残基)的抗炎活性。

附图说明

图1. 1-(乙酰-AA-OBzl)-3-(乙氧基乙酰-AA-OBzl)吲哚的合成路线.i)溴乙酸乙酯，NaH，80 ℃；ii)浓度为2N的NaOH水溶液；iii)二环己基碳二亚胺，N-羟基苯并三氮唑，N-甲基吗啉；3a中AA＝L-Ser残基，3b中AA＝L-Thr残基，3c中AA＝L-Gln残基，3d中AA L-Asn＝残基，3e中AA＝L-Cys(Bzl)残基。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备1-乙氧羰甲基-3-乙氧羰甲氧基乙基-吲哚(1)

室温下向5.00g(31mmol)吲哚乙醇与50mL无水四氢呋喃(THF)的溶液中缓慢加入2.98 g(4mmol，60％)NaH，搅拌30分钟之后缓慢滴加17.22mL(5mmol)溴乙酸乙酯，80℃加热48小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯，3/1)显示反应完成。停止加热，反应混合物冷却至室温。滤除掉固体，滤液减压浓缩。残留物用硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯，3/1)纯化，得到1.54 g(15％)标题化合物，为黄色糖浆。ESI-MS(m/e):334[M+H]⁺。

实施例2制备1-羧甲基-3-羧甲氧基乙基吲哚(2)

冰浴下将1.31g(3.9mmol)1-乙氧羰甲基-3-乙氧羰甲氧基乙基-吲哚(1)用10mL甲醇溶解。往得到的溶液中滴加浓度为2N的NaOH水溶液，调节溶液的pH至12，搅拌5小时后TLC(石油醚/乙酸乙酯，3/1)显示反应完成。反应混合物用饱和KHSO₄水溶液节pH至7，减压浓缩，残留物物用15mL乙酸乙酯萃取3次，水层用饱和KHSO₄水溶液调节pH至4，用15mL乙酸乙酯萃取3次。分出的水层继续用饱和KHSO₄水溶液调节pH至2，用15mL 乙酸乙酯萃取3次并合并分离的乙酸乙酯层，用15mL饱和NaCl水溶液洗3次，用无水 Na₂SO₄干燥12小时。过滤，滤液减压浓缩，得到0.68g(62％)标题化合物，为黄色糖浆。 ESI-MS(m/e):276[M-H]^-；Mp 97-100℃；

IR(KBr,cm^-1):3196, 3051,2892,1651,1469,1435,1175,1124,840,901,724；¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ/ppm ＝12.731(s,2H),7.549(d,J＝7.8Hz,1H),7.324(d,J＝6.9Hz,1H),7.172(s,1H),7.114(t,J ＝6.9Hz,1H),7.021(t,J＝6.9Hz,1H),4.937(s,2H),4.053(s,2H),3.725(t,J＝7.2Hz,2H), 2.947(t,J＝7.2Hz,2H)。

实施例3制备1-(乙酰-Ser-OBzl)-3-(乙氧基乙酰-Ser-OBzl)吲哚(3a)

将0.55g(2.0mmol)1-羧甲基-3-羧甲氧基乙基-吲哚(2)，0.54g(4.0mmol)N-羟基苯并三氮唑和10mL无水THF的溶液搅拌30分钟，得到反应溶液A。将0.82g(4.0mmol)二环己基碳二亚胺用5mL无水THF溶解，得到反应溶液B。冰浴下，将反应溶液B缓慢滴加至反应溶液A中，搅拌30分钟。然后往里中加1.85g(8.0mmol)HCl·Ser-OBzl与15mL无水THF 的溶液。反应混合物用N-甲基吗啉调节pH至9，室温搅拌10小时。TLC(CH₂Cl₂/CH₃OH， 30/1，加3滴乙酸)显示反应完成。反应混合物过滤,滤液减压浓缩，残留物用30mL乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用20mL饱和NaHCO₃水溶液洗3次，20mL饱和NaCl水溶液洗3次，20mL 5％KHSO₄水溶液洗3次，20mL饱和NaCl水溶液洗3次，20mL饱和NaHCO₃水溶液洗3次及20mL饱和NaCl水溶液洗3次。乙酸乙酯层加无水Na₂SO₄干燥12小时，过滤，滤液减压浓缩，残留物用硅胶柱层析(CH₂Cl₂/CH₃OH，30/1，加3滴乙酸)纯化，得到 0.33g(26％)标题化合物，为淡黄色粉末。ESI-MS(m/e):632[M+H]⁺；Mp 132-134℃；

IR(KBr,cm^-1):3320,3028,2923,2865,1730,1665,1527,1468,1454, 1203,1173,1110,735,695；¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ/ppm＝8.765(d,J＝7.8Hz,1H), 7.862(d,J＝8.1Hz,1H),7.559(d,J＝7.2Hz,1H),7.341(m,11H),7.150(s,1H),7.074(m,1 H),7.005(m,1H),5.141(d,J＝6.0Hz,4H),4.870(s,2H),4.465(m,2H),3.992(m,2H),3.772 (m,6H),2.977(t,J＝7.2Hz,2H)。

实施例4制备1-(乙酰-Thr-OBzl)-3-(乙氧基乙酰-Thr-OBzl)吲哚(3b)

采用实施例3的方法从0.55g(2.0mmol)1-羧甲基-3-羧甲氧基乙基-吲哚(2)和1.96g (8.0mmol)HCl·Thr-OBzl得到0.49g(39％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e):632 [M+H]⁺；Mp 146-147.0℃；

IR(KBr,cm^-1):3451,3325,3032, 2973,2933,2869,1744,1705,1663,1645,1537,1481,1288,1126,1087,1013,745,731,695；¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ/ppm＝8.340(d,J＝5.7Hz,1H),7.583(t,J＝9.6Hz,2H),7.352 (m,11H),7.169(s,1H),7.076(m,1H),7.008(m,1H),5.124(d,J＝5.7Hz,1H),5.156(m,5 H),4.933(m,2H),4.389(dt,J＝3.0Hz,J＝9.0Hz,2H),4.216(m,2H),4.030(m,2H),3.734 (dt,J₁＝2.1Hz,J₂＝7.8Hz,2H),2.983(t,J＝7.2Hz,2H),1.077(m,6H)。

实施例5 1-(乙酰-Gln-OBzl)-3-(乙氧基乙酰-Gln-OBzl)吲哚(3c)

采用实施例3的方法从0.55g(2.0mmol)1-羧甲基-3-羧甲氧基乙基-吲哚和Tos·Gln-OBzl 3.26g(8.0mmol)得到0.37g(21％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e):896[M+H]⁺； Mp 136-139℃；

IR(KBr,cm^-1):3305,3201,3063,2923,1731, 1650,1533,1468,1212,1172,1114,735,696；¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ/ppm＝8.739(d, J＝4.2Hz,1H),8.112(d,J＝4.5Hz,1H),7.566(d,J＝4.8Hz,1H),7.338(m,13H),7.143(s,1 H),7.081(t,J＝4.2Hz,1H),7.015(t,J＝4.2Hz,1H),6.811(d,J＝3.9Hz,2H),5.117(m,4H), 4.823(m,2H),4.343(m,2H),3.959(m,2H),3.707(m,2H),2.985(t,J＝4.2Hz,2H),2.186(t, J＝4.5Hz,2H),2.139(t,J＝4.5Hz,2H),2.030(m,2H),1.834(m,2H)。

实施例6制备1-(乙酰-Asn-OBzl)-3-(乙氧基乙酰-Asn-OBzl)吲哚(3d)

采用实施例3的方法从0.55g(2.0mmol)1-羧甲基-3-羧甲氧基乙基-吲哚和HCl·Asn-OBzl 2.07g(8.0mmol)得到0.29g(21％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e):686[M+H]⁺； Mp 114-115℃；

IR(KBr,cm^-1):3321,3028,2924,2865,1731, 1655,1528,1467,1454,1210,1110,735,695；¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ/ppm＝8.643(d, J＝7.5Hz,1H),8.109(d,J＝8.1Hz,1H),7.554(d,J＝7.8Hz,1H),7.464(d,J＝11.7Hz,1H), 7.347(s,10H),7.263(d,J＝7.8Hz,1H),7.122(s,1H),7.045(m,4H),5.109(d,J＝6.6Hz,4 H),4.820(s,2H),4.721(m,2H),3.947(s,2H),3.690(m,2H),2.984(m,2H),2.664(m,4H)。

实施例7制备1-(乙酰-Cys(Bzl)-OBzl)-3-(乙氧基乙酰-Cys(Bzl)-OBzl)吲哚(3e)

采用实施例3的方法从0.55g(2.0mmol)1-羧甲基-3-羧甲氧基乙基-吲哚和 HCl·Cys(Bzl)-OBzl 2.70g(8.0mmol)得到0.42g(25％)标题化合物，为淡黄色粉末。ESI-MS (m/e):844[M+H]⁺；Mp 73-75℃；

IR(KBr,cm^-1):3320,3028,2923,2865,1731,1655,1527,1454,1203,1173,735,695；¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆) δ/ppm＝8.815(d,J＝7.8Hz,1H),8.086(d,J＝8.4Hz,1H),7.566(d,J＝7.2Hz,1H),7.307(m, 21H),7.148(s,1H),7.069(dt,J₁＝1.2Hz,J₂＝7.2Hz,1H),7.002(dt,J₁＝0.9Hz,J₂＝7.8Hz,1H),5.127(m,4H),4.843(s,2H),4.603(m,2H),3.986(s,2H),3.725(m,6H),2.989(t,J＝7.2Hz,2H),2.819(m,4H)。

实施例8测定化合物3a-e的抗肿瘤转移活性

本测定模型用Lewis小鼠肺癌细胞(LLC,购自ATCC)接种,选用DMEM培养基(含10％经灭活的胎牛血清,1×10⁵U/L青霉素和100mg/L链霉素),按照贴壁细胞培养方法每两天传代一次，富集细胞。待细胞生长状态良好并处于对数生长期时消化细胞，用生理盐水调整细胞密度至1×10⁷个/mL。胎盘蓝染色，使活细胞计数>95％。取近交系C57BL/6雄性小鼠(SPF级,体重20±2g)，左手固定小鼠。用75％乙醇对小鼠右前肢腋窝皮肤消毒。右手持1mL 无菌注射器往小鼠腋部皮下注射LLC肿瘤细胞悬液，每只小鼠注射0.2mL。小鼠接种10天后，长出直径约4-5mm的肿瘤即为瘤源。接种10天的Lewis肺癌荷瘤小鼠乙醚麻醉，脱颈椎处死。用75％乙醇浸泡10min，消毒，在超净工作台上剥离瘤体。选择生长良好的肿瘤组织在无菌平皿中剪碎，置于玻璃制造的组织匀浆器内。按瘤块重比生理盐水体积为1比3(g 比mL)的比例加温度为4℃的生理盐水，轻轻研磨制成细胞悬液。细胞悬液过200目细胞筛制单细胞悬液。用生理盐水调单细胞悬液的细胞密度至1.5×10⁷个/mL。胎盘蓝染色，使活细胞计数>95％。左手固定近交系C57BL/6雄性小鼠，用75％的乙醇对小鼠右前肢腋窝皮肤消毒。右手持1mL无菌注射器于小鼠腋部皮下注射瘤细胞悬液，每只注射0.2mL。接种 10天后小鼠长出直径4-5mm的肿瘤，按测得的肿瘤体积将接种小鼠随机分组。每组12只小鼠。接种肿瘤的第11天小鼠或口服公认的抗肿瘤转移肽Arg-Gly-Asp-Ser(RGDS)的生理盐水溶液(剂量为20μmol/kg/天)或口服化合物3a-e的生理盐水溶液(剂量为0.02μmol/kg/天)或口服化合物2的生理盐水溶液(剂量为2μmol/kg/天)或口服生理盐水(剂量为10mL/kg/天)，每天给1次药，连续给药12天，每隔两天测量并记录肿瘤体积。最后一次给药的次日测量瘤体积，乙醚麻醉脱颈椎处死，取小鼠的肿瘤称重，取小鼠的肺并计算肿瘤肺部转移的瘤节数。用t检验对数据进行统计分析。结果见表1。在0.02μmol/kg剂量下化合物3a-e不仅有效地抑制肿瘤肺转移，而且化合物活性与剂量比它们高1000倍RGDS及剂量比它们高100 倍的化合物2没有显著性差异。这些数据表明，本发明有显著的技术效果。

表1化合物3a-e的抗肿瘤转移活性

a)与生理盐水相比p<0.01，与RGDS及化合物2比p>0.05；n＝10

实施例9测定化合物3a-e的抗肿瘤生长活性

测定前将阿霉素用生理盐水溶解,化合物2和化合物3a-e用含吐温80的生理盐水溶解, 用于S180小鼠给药。在无菌环境中取接种于雄性ICR小鼠10天生长旺盛的S180腹水瘤液，用生理盐水稀释成(1:2)的液体充分混合，将肿瘤细胞悬液用新鲜配制的0.2％台盼蓝染色，混匀后按白细胞计数方法计数，染蓝色者为死细胞，不染色者为活细胞。按细胞浓度＝4 大方格内活细胞数/4×10⁴×稀释倍数＝细胞数/mL计算细胞密度，按细胞存活率＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100％计算细胞存活率。将存活率大于90％的瘤液用匀浆法制成密度为2.0×10⁷个/mL的细胞悬液。该细胞悬液接种于小鼠右腋皮下(0.2mL/只)，制造S180 荷瘤小鼠。接种24h后S180荷瘤小鼠每日腹腔注射阿霉素的生理盐水溶液(剂量为2μmol/kg/ 天g)或每日口服化合物2的生理盐水溶液(剂量为5μmol/kg/天)或每日口服化合物3a-e的生理盐水溶液(剂量为0.02μmol/kg/天)。每天给药一次，连续给药12天。最后一次给药的次日测量瘤体积，乙醚麻醉脱颈椎处死，然后用镊子固定小鼠右腋肿瘤生长部位，剪开皮肤钝性剥离肿瘤并称重。用瘤重(均值±SD g)表示疗效，数据用t检验和方差分析。结果见表2。在0.02μmol/kg剂量下化合物3a-e不仅有效地抑制肿瘤生长，而且活性与剂量比它们高100 倍的化合物2没有显著性差异。这些数据表明，本发明有显著的技术效果。

表2化合物3a-e对S180小鼠肿瘤生长的影响

a)与生理盐水相比p<0.05,与化合物2比p>0.05；n＝12.

实施例10测定化合物3a-e的抗炎活性

因为二甲苯引起的小鼠耳肿胀被公认为急性炎症模型，所以本发明在二甲苯引起的小鼠耳肿胀模型上测定化合物3a-e的治疗作用。因为阿司匹林是治疗急性炎症的阳性药，所以本发明选择阿司匹林为阳性对照药。ICR雄性小鼠(体重20±2g)在温度为22℃的环境静息2天,自由饮水和进食。之后，随机分为生理盐水组(剂量为0.2mL/只)，阿司匹林组(剂量为1.11mmol/kg)，化合物2组(剂量为2μmol/kg)及化合物3a-e组(剂量为0.02μmol/kg)，每组12只小鼠。测定时小鼠按所在组或口服生理盐水，或口服阿司匹林，或口服化合物2，或口服化合物3a-e。给药30min后,往小鼠的左耳廓均匀涂抹30μL二甲苯,2h后小鼠接受乙醚麻醉，断颈处死,剪下左右两耳,用7mm的打孔器在两耳的相同位置取圆形耳片,称重,求出两耳肿胀差值作为肿胀度。即肿胀度＝右耳圆片重量–左耳圆片重量。结果见表 3。在0.02μmol/kg剂量下化合物3a-e不仅有效地抑制二甲苯引起的小鼠耳肿胀，而且活性与剂量比它们高100倍的化合物2没有显著性差异。这些数据表明，本发明有显著的技术效果。

表3化合物3a-e对二甲苯引起的小鼠耳肿胀的影响

a)表示与生理盐水相比p<0.05；b)表示与生理盐水相比p<0.01；n＝12。

Claims

1.下式的1-(乙酰-AA-OBzl)-3-(乙氧基乙酰-AA-OBzl)吲哚，

式中AA为L-Ser残基,L-Thr残基,L-Gln残基,L-Asn残基或L-Cys(Bzl)残基。

2.权利要求1的1-(乙酰-AA-OBzl)-3-(乙氧基乙酰-AA-OBzl)吲哚的制备方法，该方法包括:

1)在氢化钠催化下吲哚乙醇与溴乙酸乙酯在四氢呋喃中80℃反应，生成为1-乙氧羰甲基-3-乙氧羰甲氧基乙基-吲哚(化合物1)；

2)在浓度为2N的NaOH水溶液中化合物1皂化得到1-羧甲基-3-羧甲氧基乙基吲哚(化合物2)；

3)在二环己基碳二亚胺和N-羟基苯并三氮唑存在下化合物2在无水四氢呋喃中与L-氨基酸苄酯反应，生成1-(乙酰-AA-OBzl)-3-(乙氧基乙酰-AA-OBzl)吲哚。

3.权利要求1的1-(乙酰-AA-OBzl)-3-(乙氧基乙酰-AA-OBzl)吲哚在制备抗肿瘤转移药物中的应用。

4.权利要求1的1-(乙酰-AA-OBzl)-3-(乙氧基乙酰-AA-OBzl)吲哚在制备抗腹水瘤药物中的应用。

5.权利要求1的1-(乙酰-AA-OBzl)-3-(乙氧基乙酰-AA-OBzl)吲哚在制备抗炎症药物中的应用。