CN108524521A - 河豚毒素在制备抑制肺癌细胞或肿瘤增长的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及河豚毒素在制备抑制肺癌细胞或肿瘤增长的药物中的应用，属于医学药物研发技术领域。本发明提供的应用制备得到的抑制肺癌细胞或肿瘤增长的药物包括河豚毒素和药物载体；所述药物含有1～4μg/mL的河豚毒素。本发明提供的药物治愈效果好，患者依耐性小，价格适中，能够快速有效地缓解患者肺癌相关症状，延续患者生命。

Description

河豚毒素在制备抑制肺癌细胞或肿瘤增长的药物中的应用

技术领域

本发明涉及医学药物研发技术领域，具体涉及河豚毒素在制备抑制肺癌细胞或肿瘤增长的药物中的应用。

背景技术

近几十年来，我国肺癌发病率增长了4倍，每年新增的肺癌发生病人有60万以上的人，而且呈逐年递增的趋势。预计到2025年，每年新增的病人达到100万人。据官方统计，每年129个新发的癌症病人中，肺癌患者有23人，死亡病人是20人。肺癌已成为男性恶性肿瘤中发病率与死亡率均占第一位，女性中占第二位的疾病。肺癌的病因至今尚不完全明确，可能与长期吸烟，职业环境，电离辐射，既往肺部慢性感染，遗传以及大气污染有关。

传统的化学治疗与放射治疗对肺癌治疗效果十分有限。同时，长期治疗后，患者的造血与免疫系统会受到损伤，并且容易产生耐药性，无法彻底根治肺癌。靶向治疗是近年来治疗肺癌的一个新途径，利用靶标的药物阻断肺癌细胞信号通路、抑制肿瘤血管生成来抑制肿瘤细胞生长或促进其凋亡。然而，此类治疗只能适用于定向患者治疗，并且治疗费用较高，不利于用作广谱的抗癌药物。因此，寻求一种制作治愈效果好，价格适中的抗肺癌药物，从而快速有效地缓解患者肺癌相关症状，延续患者生命成为当前迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供河豚毒素在制备抑制肺癌细胞或肿瘤增长的药物中的应用。本发明提供的应用制备得到的药物治愈效果好，患者依耐性小，价格适中，能够快速有效地缓解患者肺癌相关症状，延续患者生命。

本发明提供了河豚毒素在制备抑制肺癌细胞或肿瘤增长的药物中的应用。

优选的是，所述药物中河豚毒素的有效剂量为1～4μg/mL。

本发明还提供了一种抑制肺癌细胞或肿瘤增长的药物，包括河豚毒素和药物载体；所述河豚毒素在药物中的质量含量为1～4μg/mL。

优选的是，每100mL所述药物载体包括2～4mL的香叶油，2～4mL的白术油，2～4mL的姜黄油，2～4mL的鸦胆子油和84～91mL的河豚肝油。

优选的是，所述河豚肝油的制备包括以下步骤：将河豚肝脏和水混合，熬煎2～2.5h，收集上层河豚肝油。

优选的是，所述河豚肝脏和水混合的质量比为(3～5)：1。

优选的是，所述熬煎的温度为110～125℃。

本发明还提供了上述技术方案所述药物的制备方法，包括以下步骤：

1)将河豚毒素溶于河豚肝油，制成河豚毒素母液；

2)将香叶油、白术油、姜黄油和鸦胆子油加入河豚肝油中，在60℃下加热搅拌后，与步骤1)得到的河豚毒素母液混合，在60℃下搅拌90～120min，得到抑制肺癌细胞或肿瘤增长的药物；

步骤1)和步骤2)中河豚肝油的用量比为(1～4)：(83～87)。

优选的是，所述河豚毒素母液中河豚毒素的浓度为80～120μg/mL。

优选的是，所述搅拌的速率为90～110rpm。

本发明提供了河豚毒素在制备抑制肺癌细胞或肿瘤增长的药物中的应用。本发明利用河豚毒素制备的药物能够杀死肺癌细胞，抑制肺癌肿瘤的增长，价格相对于其他抗癌药物明显下降。在小鼠皮下肿瘤实验中，药物组小鼠的生长与摄食和对照组相比均无显著差异，然而，给药组的小鼠肺癌肿瘤得到了很好地抑制，这为下一步的临床实验与药物推广奠定了良好的基础，所述药物治愈效果好，患者依耐性小，制作工艺简单，价格适中，能够1～2个月内有效地缓解患者肺癌相关症状，延续患者生命。

附图说明

图1为本发明实施例4提供的药物处理24h肺癌细胞A549的培养结果图；

图2为本发明实施例4提供的药物处理48h肺癌细胞A549的培养结果图；

图3为本发明实施例4提供的药液20μL培养正常人肺原代细胞24h和48h结果图；

图4为本发明实施例4提供的灌药50d小鼠肿瘤拍照结果图；

图5为本发明实施例5提供的药液20μL处理组24h和48h实验结果图；

图6为本发明实施例5提供的药物处理期间小鼠体重的变化结果图；

图7为本发明实施例5提供的药物处理期间小鼠肿瘤体积的变化结果图；

图8为本发明实施例5提供的药物处理组与对照组Caspase-3和Ki-67westernblot表达结果图。

具体实施方式

本发明提供了河豚毒素在制备抑制肺癌细胞或肿瘤增长的药物中的应用。在本发明中，所述药物的剂型优选为液体剂型。

在本发明中，所述药物中河豚毒素的有效剂量为1～4μg/mL，优选为2μg/mL。本发明所述药物的服用剂量优选为1～1.5mL/次，服用频率优选为3次/天。

本发明提供了一种抑制肺癌细胞或肿瘤增长的药物，所述药物包括河豚毒素和药物载体；所述河豚毒素在药物中的质量含量为1～4μg/mL。本发明对所述河豚毒素的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的河豚毒素的常规市售产品即可。在本发明中，所述河豚毒素的纯度优选为99％以上。在本发明中，所述药物优选含有2μg/mL的河豚毒素。

在本发明中，所述药物载体的作用为使河豚毒素更好地被肠道吸收，在本发明中，所述药物的服用方式优选为口服。

在本发明中，每100mL所述药物载体包括2～4mL的香叶油，2～4mL的白术油，2～4mL的姜黄油，2～4mL的鸦胆子油和84～91mL的河豚肝油；优选的，每100mL所述药物载体包括3mL的香叶油，4mL的白术油，4mL的姜黄油，3mL的鸦胆子油和86mL的河豚肝油。本发明对所述香叶油、白术油、姜黄油和鸦胆子油的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的香叶油、白术油、姜黄油和鸦胆子油的常规市售产品即可。在本发明中，所述香叶油、白术油、姜黄油和鸦胆子油的纯度优选独立地在99％以上。

在本发明中，所述药物载体取材较为容易，制作工艺简单，价格低廉。

在本发明中，所述河豚肝油的制备方法优选包括以下步骤：将河豚肝脏和水混合，熬煎2～2.5h，收集上层河豚肝油。在本发明中，所述河豚肝脏和水混合的质量比为(3～5)：1，优选为4:1。在本发明中，所述煎熬的温度为110～125℃，优选为120℃。煎熬后，出油率为75％左右，油质呈黄色，收集上层河豚肝油后，本发明优选采用网筛去除油渣后冷藏。在本发明中，所述网筛的大小优选为40目。在本发明中，所述冷藏的温度优选为4℃。

本发明还提供了上述技术方案所述药物的制备方法，包括以下步骤：

1)将河豚毒素溶于河豚肝油，制成河豚毒素母液；

2)将香叶油、白术油、姜黄油和鸦胆子油加入河豚肝油中，在60℃下加热搅拌后，与步骤1)得到的河豚毒素母液混合，在60℃下搅拌90～120min，得到抑制肺癌细胞或肿瘤增长的药物。

本发明药物的制备优选先将河豚毒素制成河豚毒素母液，再与药物载体混合得到药物。本发明将河豚毒素溶于河豚肝油，制成河豚毒素母液。在本发明中，所述河豚毒素母液中河豚毒素的浓度为80～120μg/mL，更优选为100μg/mL。在本发明中，用于制备河豚毒素母液的河豚肝油与后一步骤使用的河豚肝油的用量比优选为(1～4)：(83～87)，更优选为2：85。

本发明优选将香叶油、白术油、姜黄油和鸦胆子油加入河豚肝油中，在60℃下加热搅拌后，与步骤1)得到的河豚毒素母液混合，在60℃下搅拌90～120min，得到抑制肺癌细胞或肿瘤增长的药物。在本发明中，所述搅拌的速率优选为90～110rpm，更优选为100rpm。在本发明中，所述搅拌的时间优选为100min。本发明对所述搅拌的方式没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的搅拌装置进行搅拌即可，如采用加热磁力搅拌器。

下面结合具体实施例对本发明所述的河豚毒素在制备抑制肺癌细胞或肿瘤增长的药物中的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

河豚毒素母液配制：称取纯度为99％的河豚毒素100μg溶解于1mL河豚肝油中配制成药物母液。

将河豚鱼的肝脏放入锅中，按照肝重添加25％的水，用120℃直火熬煎2小时，出油率为75％左右，油质呈深黄色，收集后用40目的网筛除去油渣放入4℃冰箱中冷藏备用。

配制含河豚毒素1μg/mL的药液。首先配制99mL基础载体，称取河豚肝油85mL，再分别加入香叶油3mL，白术油4mL，姜黄油4mL，鸦胆子油3mL，使用加热磁力搅拌器使基础载体加热至60℃后，添加含河豚毒素母液1mL，60℃恒温下100rpm转速下搅拌90分钟，使其充分溶解，室温下冷却后放入4℃冷藏备用。

实施例2

河豚毒素母液配制：称取纯度为99％的河豚毒素200μg溶解于2mL河豚肝油中配制成药物母液。

将河豚鱼的肝脏放入锅中，按照肝重添加25％的水，用120℃直火熬煎2小时，出油率为75％左右，油质呈深黄色，收集后用40目的网筛除去油渣放入4℃冰箱中冷藏备用。

配制含河豚毒素2μg/mL的药液。首先配制98mL基础载体，称取河豚肝油85mL，再分别加入香叶油3mL，白术油4mL，姜黄油3mL，鸦胆子油3mL，使用加热磁力搅拌器使基础载体加热至60℃后，添加含河豚毒素母液2mL，60℃恒温下110rpm转速下搅拌100分钟，使其充分溶解，室温下冷却后放入4℃冷藏备用。

实施例3

河豚毒素母液配制：称取纯度为99％的河豚毒素400μg溶解于4mL河豚肝油中配制成药物母液。

将河豚鱼的肝脏放入锅中，按照肝重添加25％的水，用120℃直火熬煎2小时，出油率为75％左右，油质呈深黄色，收集后用40目的网筛除去油渣放入4℃冰箱中冷藏备用。

配制含河豚毒素4μg/mL的药液。首先配制96mL基础载体，称取河豚肝油85mL，再分别加入香叶油2mL，白术油4mL，姜黄油3mL，鸦胆子油3mL，使用加热磁力搅拌器使基础载体加热至60℃后，添加含河豚毒素母液4mL，60℃恒温下90rpm转速下搅拌100分钟，使其充分溶解，室温下冷却后放入4℃冷藏备用。

实施例4

杀死肺癌细胞的实施方法。分别吸取0.5mL(浓度为2μg/mL)制备得到的药物，溶解于二甲基亚砜中，配制0.5mL药液/1mL二甲基亚砜的细胞实验药液。每500μL的细胞反应体系中，加入实验药液12.5μL-100μL，细胞培养24h和48h时分别在荧光倒置显微镜OlympusX71下拍照与计数。肺癌细胞A549的培养液中添加药液12.5μL-100μL后，肺癌细胞在24h和48h有很好的灭活效果(图1和图2，照片拍照为倍数均为100倍)图1中，图1-1为对照组(基础载体添加组)，图1-2为实验组1(12.5μL药液组)，图1-3为实验组2(25μL药液组)，图1-4为实验组3(50μL药液组)，图1-5为实验组4(100μL药液组)；图2中，图2-1为对照组(基础载体添加组)，图2-2为实验组1(12.5μL药液组)，图2-3为实验组2(25μL药液组)，图2-4为实验组3(50μL药液组)，图2-5为实验组4(100μL药液组)，同时，药液100μL对正常胚肺细胞MRC-5的影响较小(图3)，图3中，图3-1为细胞培养192h组，图3-2为细胞培养240h组。

阻抑肺癌肿瘤生长的药物实施方法。构建免疫缺陷模型鼠(NOD-SCID)A549肺癌肿瘤模型，每隔一天灌胃一次，分别灌胃含河豚毒素1μg/mL、2μg/mL和4μg/1mL的药液0.9mL。药物处理50d后，各河豚毒素添加组小鼠肺癌瘤体的重量与对照组(不添加河豚毒素，只灌胃基础载体组)相比明显下降(图4为灌药50d小鼠肿瘤拍照结果图)。同时，各实验组小鼠摄食正常，实验结束时，各实验组小鼠体重间无显著差异(灌药50d后，各实验组小鼠瘤体重量与体重结果见表1)。

表1灌药50d后，各实验组小鼠瘤体重量与体重

组别	瘤体重量(g)	小鼠体重(g)
			实验组1：对照组	5.09g±2.04	30.5g±1.7
实验组2：河豚毒素1ug添加组	2.96g±0.61	32.6g±0.7
			实验组3：河豚毒素2ug添加组	2.01g±0.74	29.3g±0.8
实验组4：河豚毒素4ug添加组	2.43g±0.18	31.3g±1.1

通过药物中添加河豚毒素可以有效杀死肺癌细胞，抑制肺癌肿瘤的生长。同时，本发明所涉及的制作工艺较为简单，价格相对较低，对正常细胞与活体小鼠的毒性小。

实施例5

杀死肺癌细胞的实施方法。吸取0.5mL实施例2制备得到的药物，溶解于二甲基亚砜中，配制0.5mL药液/1mL二甲基亚砜的细胞实验药液。在无菌操作下，将处于对数生长期的肺癌细胞A549细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液；用血球计数板计数细胞；12孔板每孔加入1×10⁴A549细胞，每组3复孔，每孔100μL细胞悬液，铺板过程中要确保每孔加入细胞数目的一致；铺好板后，置37℃5％CO₂培养箱培养。24h后，每500μL的细胞反应体系中，添加药液25μL后，细胞培养24h和48h时分别在荧光倒置显微镜Olympus X71下拍照与计数。药物处理组的肺癌细胞在24h和48h有很好的灭活效果如图5所示，同时，药液25μL对正常人胚肺细胞MRC-5的影响较小，如图5所示，图5中，图5-1为培养24h的对照组，图5-2为培养24h的25μL药液组，图5-3为正常原代细胞培养192h组；图5-4为培养48h的对照组，图5-5为培养48h的25μL药液组，图5-6为正常原代细胞培养240h组。

阻抑肺癌肿瘤生长的药物实施方法。选取4周龄体重在15～20g的免疫缺陷小鼠饲养在上海药物转化创新中心的SPF级动物房内。小鼠实验前在动物房饲养3天以适应环境。根据国际实验动物评估和认证委员会(AAALAC)的指导给小鼠提供粒状固体饲料和水并采用自由进食的方式饲养，饲养环境温度在20℃～25℃，相对湿度在40％～70％，环境照明维持12小时光照、12小时黑暗的交替循环。按照SOP要求进行样本预处理和接种，接种12只小鼠，每只小鼠选择前肢或后肢与躯体交界的一到两个部分进行皮下接种A549肺癌细胞。当瘤体积达到50mm³时，12只小鼠随机分为2个实验组(对照组6只小鼠和药物处理组6只小鼠)开始正式灌药实验。每隔一天灌胃一次，每次灌胃含河豚毒素2μg/mL的药液0.8mL或基础载体0.8mL。同时，每周测量2次老鼠重量和肿瘤体积。灌药实验周期为50d。药物处理期间小鼠体重的变化结果如图6所示。药物处理期间小鼠肿瘤体积的变化结果如图7所示。药物处理结束后对照组与处理组小鼠瘤体的重量如表2所示。

表2药物处理结束后对照组与处理组小鼠瘤体的重量

药物处理期间，处理组小鼠的体重与对照组相比无显著差异。瘤体的体积在灌药20d后的增殖速度明显低于对照组。处理50d后，对照组瘤体的质量为5.32g，显著重于处理组的1.92g。Ki-67是存在于增殖细胞核内的一种非组蛋白性核内蛋白，能够可靠而迅速地反映肿瘤增殖率。Caspase-3可通过阻滞细胞周期，裂解细胞结构物质，破坏平衡状态及修复机制等促进细胞凋亡的发生。药物处理组Caspase-3的表达明显增加，Ki-67的表达明显下降(图8)。药物中添加河豚毒素可能阻抑了肺癌肿瘤的增殖，增加了细胞凋亡的发生。药物处理组与对照组Caspase-3和Ki-67westernblot表达结果如图8所示。

通过本发明的药物制剂，药物处理组可以有效地杀死肺癌细胞，阻抑免疫缺陷小鼠中肺癌肿瘤的增殖。

实施例6

肺癌患者治疗的临床观察

患者1：桑先生，78岁，阜阳市太和县人。2017年1月在医生建议下开始服用本试验的胶囊。服用半个月后，病人明显感到头痛、血痰、胸闷持续不解、气急、呼吸困难影响睡眠的情况得到很大改善。CT显示肿瘤由此前的2.5mm×2mm缩小到2.5mm×0.5mm。疗效评价，多项指标得以改善：1、临床症状评价为有效。治疗后积分比治疗前积分减少≥1/3，乏力与食欲改善明显；2、生活质量评价为稳定。治疗后比治疗前增加10分左右；3、瘤体缩小评价为部分缓解：肿瘤病灶面积从2.5mm×2mm缩小到2.5mm×0.5mm，肿块两个最大垂径的乘积减少50％以上，并至少维持4周以上，无新病灶出现；4、体重评价为增加：治疗后比治疗前增加≥1kg。现在病人情况良好，生活大部分自理，活动正常。

患者2：林先生，52岁，江西南昌人。2016年4月检查出是肺癌晚期肝转移，骨转移。由于扩散范围比较广，医院建议化疗，但是患者比较畏惧化疗带来的副作用，最终选择了保守治疗。8月份患者的姐姐了解到本试验药物在控制晚期患者病情，缓解疼痛上效果比较好，自愿签订协议服用药物。服用之后冯先生食欲明显改善，睡眠相对以前有明显改善，复查后检查报告显示肝部的两个小肿瘤明显缩小，而且以前疼痛也所有缓解，效果还是比较明显，至今还是在服用，情况比较稳定，各项指标均出现好转。

患者3：王女士，35岁，广西南宁人，2017年1月在一次检查中发现右肺下叶外侧基底段可见一结节影，大小为2.3*2.0cm，可见分叶、毛刺，胸膜牵拉，FDG摄取增高，最大SUV值：7.0。余肺显影清晰，肺纹理正常。右下肺门及纵隔(上纵隔血管间隙、气管前-腔静脉后、气管隆突下)可见多个淋巴结浓聚。心肌显影清晰。心包内可见一结节影，伴FDG摄取增高。一个月后复查显示，肿瘤体积显著增加，达到2.6*2.0cm。在医生的建议下，服用本实验药物，35天后，肿瘤未持续增加，55天后，肿瘤体积明显缩小，达到2.2*0.8cm。现在持续服用本实验药物，肿瘤面积降低至2.0*0.5cm，病情稳定。

患者4：马先生，67岁，安徽合肥人，2017年初发现患者患有肺癌，2017年9月患者系左胸癌放疗后，现胸部平扫显示两肺纹理增多、紊乱，肺野透亮度增加，左肺上叶尖后段见团块状高密度影，大小约3.6cm*6.1cm，周围见片絮状及条状高密度影，余肺实质散在条片状高密度影；纵隔居中，左锁骨下见增大淋巴结影，双侧胸腔未见积液及胸膜肥厚征象。2017年10月，患者在医生的建议下服用本实验药物。2017年12月，患者在医院检查中发现，肿瘤大小缩小至3.2cm*5.1cm。2018年1月，检查中发现肿瘤大小为2.5cm*5.0cm.目前，患者继续服用药物，情况稳定。

患者5：张先生，51岁，四川泸州人。2017年11月在医院进行CT检查时发现，右胸门增大，右肺下叶见最大截面积9.7cm*9.2cm团块状软组织密度影，其内密度欠均匀，增强扫描病灶边缘强化，可见少许小血管进入其内：右肺中下叶少许斑片，索条影，右肺斜裂区及左下叶内前基地段小结节影。2017年12月，患者在医生的建议下服用本实验药物。2018年2月，患者在医院检查中发现，肿瘤大小缩小至9.1cm*8.1cm，疼痛也所有缓解。目前，在继续服用本药物。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.河豚毒素在制备抑制肺癌细胞或肿瘤增长的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物中河豚毒素的有效剂量为1～4μg/mL。

3.一种抑制肺癌细胞或肿瘤增长的药物，包括河豚毒素和药物载体；所述河豚毒素在药物中的质量含量为1～4μg/mL。

4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于，每100mL所述药物载体包括2～4mL的香叶油，2～4mL的白术油，2～4mL的姜黄油，2～4mL的鸦胆子油和84～91mL的河豚肝油。

5.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述河豚肝油的制备包括以下步骤：将河豚肝脏和水混合，熬煎2～2.5h，收集上层河豚肝油。

6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述河豚肝脏和水混合的质量比为(3～5)：1。

7.根据权利要求5或6所述的药物，其特征在于，所述熬煎的温度为110～125℃。

8.权利要求3～7任意一项所述药物的制备方法，包括以下步骤：

1)将河豚毒素溶于河豚甘油，制成河豚毒素母液；

2)将香叶油、白术油、姜黄油和鸦胆子油加入河豚肝油中，在60℃下加热搅拌后，与步骤1)得到的河豚毒素母液混合，在60℃下搅拌90～120min，得到抑制肺癌细胞或肿瘤增长的药物；

步骤1)和步骤2)中河豚肝油的用量比为(1～4)：(83～87)。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述河豚毒素母液中河豚毒素的浓度为80～120μg/mL。

10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述搅拌的速率为90～110rpm。