CN110075123B - 一种血液制品及其组合物在制备治疗及预防肿瘤的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种血液制品及其组合物在制备治疗及预防肿瘤的药物中的用途，IgG4可以通过抑制免疫反应，从而对肿瘤的生长有间接的促进作用。而本发明提供的血液制品中不含有IgG4或IgG4的含量低于正常人血液中IgG4的含量，这种血液制品及其组合物对多种肿瘤的生长和转移有明显的抑制作用；此外，从肿瘤的微环境中去除IgG4或减低IgG4的浓度也可以起到治疗及预防肿瘤的作用。本发明提供的血液制品及治疗方法可广泛的预防和治疗多种恶性肿瘤，且治疗成本相对较低，适应症广，无明显副作用，具有广阔的临床应用前景。

Description

一种血液制品及其组合物在制备治疗及预防肿瘤的药物中的 用途

技术领域

本发明属于肿瘤免疫治疗药物技术领域，具体涉及了一种血液制品及其组合物在制备治疗及预防肿瘤的药物中的用途。

背景技术

我国的肿瘤发病率，特别是恶性肿瘤，日益增高，死亡率高居不下，每年新发肿瘤近400万，死于肿瘤的人200余万，急需有效的预防和治疗肿瘤的新办法。肿瘤的发生和发展是由两方面的因素造成的，一方面是肿瘤细胞增长和分裂的失控，另一方面是机体的免疫功能失灵，不能正常识别和抑制肿瘤细胞的生长。

目前对癌症的治疗方法主要包括手术、放疗、化疗、靶向治疗和免疫疗法。放疗和化疗对癌症有一定的治疗作用，但其副作用严重，对患者的总体五年生存率并无明显改善。靶向疗法是近年来出现的针对肿瘤细胞分子靶标的疗法，对某些特定的有靶标分子表达的肿瘤有特殊的疗效，但有这种特定靶标的病人的比例较小，且这种疗法对肿瘤抑制之后很多又有反弹，或出现其它副作用。免疫疗法是最新出现的疗法，对多种癌症有明显抑制作用，但目前的免疫疗法，绝大部分是细胞免疫，即通过重新激活抗肿瘤的淋巴细胞来达到杀伤肿瘤的目的。目前使用体液免疫来治疗肿瘤的方法很少。在体液免疫治疗肿瘤的方法当中，曾经有人用注射特异性抗肿瘤的抗体来杀灭肿瘤细胞，有些肿瘤特异性抗体可以携带抗肿瘤的药物，取得了一定的效果。但目前大多数免疫疗法药物尚在临床试验或临床前研究中，尚无多少成熟的药物上市。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种血液制品及其组合物在制备治疗及预防肿瘤的药物中的用途。IgG4可以通过抑制肿瘤微环境中的免疫反应，从而对肿瘤的生长有间接的促进作用。而本发明提供的血液制品中不含有IgG4或IgG4的含量明显低于正常人血液中IgG4的含量，这种血液制品及其组合物对多种肿瘤的生长和转移有明显的抑制作用，且药物成本相对较低，适应症广，无明显副作用，具有广阔的临床应用前景。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：

本发明提供了一种血液制品，所述血液制品中不含有IgG4或IgG4的含量明显低于正常人血液中IgG4的含量；它可以是从人血液中除去IgG4后剩余的组分的混合，或者是从人血液中除去部分IgG4后剩余的组分的混合且该剩余的组分的混合中IgG4的含量明显低于正常人血液中IgG4的含量；它还可以是一种人工制造的血液替代品、血浆替代品、血清替代品等，与人血液、血浆、血清等组分相同或相近，能够实现与人血液、血浆、血清等相同或相近的、临床上可接受的功能，且其不含有IgG4或IgG4的含量明显低于正常人血液中IgG4的含量；

或，所述血液制品通过从人血液中除去IgG4后制备得到；

或，所述血液制品通过从人血液中除去部分IgG4后制备得到，且其中IgG4的含量明显低于正常人血液中IgG4的含量。

所述“明显低于正常人血液中IgG4的含量”，指的是IgG4在所述血液制品中的含量不超过0.5g/L，最好不超过0.2～0.3g/L，IgG4含量越低效果越好。

从人血液中除去或部分除去IgG4的方法例如使用抗IgG4的抗体通过抗体吸附等方式来处理血液，抗IgG4的抗体与IgG4结合，从而将IgG4与血液中的其余组分分离开来除去。

本发明还提供了一种血液制品，所述血液制品为IgG制品，该IgG制品不含有IgG4或IgG4的含量不高于1％；它可以是从人IgG中除去IgG4后剩余的组分的混合，或者是从人IgG中除去部分IgG4后剩余的组分的混合，且该剩余的组分的混合中IgG4的含量不高于1％；它还可以为一种人工制造的IgG混合物，与人IgG组分相同或相近，能够实现与人IgG相同或相近的、临床上可接受的功能，且其不含有IgG4或IgG4的含量不高于1％；

或，所述IgG制品通过从人IgG中除去IgG4后制备得到；

或，所述IgG制品通过从人IgG中除去部分IgG4后制备得到，且其中IgG4的含量不高于1％。

该IgG制品例如主要包括IgG1、IgG2和IgG3，其中IgG1的含量最高。从人IgG中除去或部分除去IgG4的方法例如先用Protein G处理人血浆，将IgG与其它血浆蛋白分离开来，然后用抗IgG4的抗体通过抗体吸附等方式来处理IgG，抗IgG4的抗体与IgG4结合，从而将IgG4与其余亚型的IgG分离开来除去。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：

本发明提供了上述的血液制品在制备治疗及预防肿瘤的药物中的用途。

本发明同时提供了一种包括了上述的血液制品的组合物在制备治疗及预防肿瘤的药物中的用途。所述组合物中除了所述的血液制品外，还可含有其余的药物或具有药物活性的物质，例如肿瘤预防药物、肿瘤治疗药物、抗菌药物、抗病毒药物、免疫增强剂等。

一实施例中：所述肿瘤包括实体瘤、血液肿瘤。

一实施例中：所述肿瘤包括原发性肿瘤、转移瘤。

一实施例中：所述肿瘤为黑色素瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、皮肤癌、肺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、肝癌、前列腺癌中的至少一种。

一实施例中：所述预防包括预防肿瘤发生、预防肿瘤复发、预防肿瘤侵袭、预防肿瘤转移，即在肿瘤发生、肿瘤复发、肿瘤侵袭、肿瘤转移产生之前就防止肿瘤发生、肿瘤复发、肿瘤侵袭、肿瘤转移的出现；所述治疗包括抑制肿瘤生长、抑制肿瘤侵袭、抑制肿瘤转移，即在已经出现肿瘤生长、肿瘤侵袭、肿瘤转移后，抑制、降低甚至完全消除肿瘤生长、肿瘤侵袭、肿瘤转移的程度。

一实施例中：所述药物还包括辅料。所述辅料为药学上可接受的稀释剂、溶剂、赋形剂、吸收剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、增溶剂、乳化剂、助悬剂、表面活性剂、成膜剂、抛射剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、杀菌剂、防腐剂等；所述辅料还包括药学上可接受的药物载体，即能够担载药物，并且具有改变药物进入人体的方式和在体内的分布，控制药物释放速度达到控释或缓释，将药物靶向输送至靶器官等作用的体系，例如包括脂质体、微球、微囊、固体分散体、胶束、微乳液、凝胶、缓释型载体、控释型载体、靶向型载体、纳米颗粒材料等。

所述血液制品、包括了所述血液制品的组合物可直接采用药学上可接受的方法制备成制剂，或者加入上述的药学上可接受的辅料后采用药学上可接受的方法制备成制剂；制剂可以为固体形式或液体形式的制剂，例如片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、注射剂等。

一实施例中：所述药物的给药途径包括静脉给药、皮下给药、肿瘤局部给药、口服给药、腔内给药，所述腔内给药的腔包括腹膜腔、胸膜腔及中枢神经系统内的腔。相应的，所述血液制品、包括了所述血液制品的组合物可以制备成适用于上述给药途径的制剂。

一实施例中：所述血液制品为IgG制品时，所述药物的用量为每公斤体重0.01～1.0g的IgG制品。用药剂量、频率和时间长短可根据治疗效果而定。

一实施例中：所述药物与至少一种另外的治疗方式联合应用，可以在给药之前、给药期间、给药之后联合应用另外的治疗方式。该另外的治疗方式包括手术治疗、化疗、放疗、靶向治疗、免疫疗法等。

所述药物尤其适合于患者本身的自体治疗，即利用患者的血液制备所述血液制品(包括所述IgG制品)、包括了所述血液制品的组合物，然后用于患者自身给药。

对于可能发生肿瘤的个体，用同样的方法长期给药，可以达到预防肿瘤发生的效果。

对于手术后的肿瘤患者，用同样的方法给药，可以达到预防肿瘤复发和转移的效果。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是：

一种预防和/或治疗肿瘤的方法，从患者体内去除IgG4，或降低患者体内IgG4的含量。具体地：

一种预防和/或治疗肿瘤的方法，建立体外血液循环，不间断地从患者血液中去除IgG4，或降低血液中IgG4的含量。例如，通过体外血液循环将患者血液引导进入一个装置，在该装置内将血液中的IgG4去除，或降低血液中IgG4的含量，然后将血液释放回患者体内。

一种预防和/或治疗肿瘤的方法，抽出患者血液后，去除血液中的IgG4，或降低血液中IgG4的含量，然后将血液输入回患者体内。

一实施例中：从血液中去除IgG4，或降低血液中IgG4的含量的方法，例如使用抗IgG4的抗体通过抗体吸附等方式来处理血液，抗IgG4的抗体与IgG4结合，从而将IgG4与血液中的其余组分分离开来除去。或者，先用Protein G将IgG与其它血浆蛋白分离开来，然后用抗IgG4的抗体通过抗体吸附等方式来处理IgG，除去其中的IgG4，将处理后的部分与此前分离出的其他血浆蛋白混合。

一实施例中：所述方法与至少一种另外的治疗方式联合应用，可以在该方法使用之前、该方法使用期间、该方法使用之后联合应用另外的治疗方式。该另外的治疗方式包括手术治疗、化疗、放疗、靶向治疗、免疫疗法等。

本发明所涉及的试剂、仪器等，除有特别说明外，均可通过商业途径购买得到。本发明所涉及的方法，除有特别说明外，均为本领域常规方法。

本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：

IgG4是一种特殊的IgG亚型，它在正常人血液中的含量只占IgG总量的3～4％(质量百分比)，其结构与其它IgG(IgG1，IgG2，IgG3)有显著不同，其含有重链和轻链的两侧经常与其它IgG4互换，从而形成两个Fab可变区片段，各具自己的抗原亲和力，从而不能形成免疫复合物，同时其Fc段可以与效应细胞的Fc受体结合，但不能引起效应免疫细胞对抗原的杀伤，因此又被称为“封闭抗体”，而其它IgG亚型的总和(即IgG1，IgG2，IgG3)称为“攻击抗体”，因为其中的抗肿瘤抗原的特异性抗体，可以介导免疫系统对肿瘤的攻击作用。

我们发现IgG4在多种肿瘤病人的血液中含量明显升高，同时含IgG4的浆细胞在肿瘤的微环境中也明显升高，肿瘤细胞附近浸润的淋巴细胞和浆细胞的相当一部分都是IgG4细胞。癌组织与癌旁相比，癌组织中IgG4阳性细胞数目增加具有统计意义。癌组织与正常淋巴组织(淋巴结和扁桃体)相比，癌组织中IgG4阳性细胞数升高具有统计学意义。食管癌病人血清IgG4含量高于正常人，并且具有统计意义。食管癌组织中IgG4/IgG_total比正常对照组高，具有统计学意义。肿瘤局部微环境中浸润的IgG4阳性细胞数目与病人的生存期成负相关，IgG4阳性细胞数目越多，病人的生存期越短。

进一步研究发现，从肿瘤血液中提取出的IgG4与该病人的肿瘤细胞不反应，而从同一个病人血液中提取出的IgG1与该病人的肿瘤细胞反应，我们进一步发现，IgG4可以与其它IgG亚型反应，而这种反应不是通过IgG4的Fab端的可变区的抗原决定簇完成的，我们发现IgG4不但在凝胶电泳上与其它IgG亚型反应，而且在组织切片上也与抗肿瘤的IgG1反应，而这种抗肿瘤抗原的IgG1已经与肿瘤细胞抗原结合，从而IgG4阻断了抗肿瘤IgG1介导的对肿瘤的识别和杀伤作用。同时我们还发现，IgG4可以与IgG1竞争效应细胞上的Fc受体，从而从免疫效应细胞的水平进一步阻断IgG1对肿瘤细胞的杀伤作用。我们证明IgG4可以抑制由肿瘤特异性的IgG1和周围血中的单核细胞对肿瘤细胞杀伤的ADCC反应、NK细胞和巨噬细胞对肿瘤杀伤的ADCP反应，以及通过激活补体对肿瘤产生杀伤作用的CDC反应，特别重要的是，所有这些对免疫反应的抑制作用中，都是通过非抗肿瘤特异性IgG4完成的，即这些IgG4不能特异性地与肿瘤抗原反应，但可以阻断其它抗体，特别是IgG1抗体对肿瘤细胞的杀伤作用。这些非抗肿瘤特异性的IgG4蛋白在肿瘤微环境中，一方面与抗肿瘤的特异性IgG1以及其它IgG反应，另一方面，和效应细胞的Fc受体反应，这样IgG4就在肿瘤的微环境中为肿瘤形成了一道有力的防线，阻碍免疫系统对肿瘤细胞的识别和攻击，从而促进了肿瘤细胞的生长和转移。即IgG4可以通过抑制免疫反应，对肿瘤的生长起到间接的促进作用。

本发明发现，用不含有IgG4亚型的血液制品输入动物模型中，可以对肿瘤的生长和转移有明显的抑制作用。除去了IgG4的血清，可以预防和治疗肿瘤。同时，从血液中除去IgG4或降低血液中IgG4的含量，也对肿瘤的生长和转移有明显的抑制作用。尽管并不愿受到任何具体理论的局限，但我们推测，IgG4在肿瘤中明显增加，而这种增加明显抑制免疫系统对肿瘤细胞的识别和杀伤，而去除了IgG4后，就去除了对免疫系统的抑制作用，从而能够通过免疫系统的正常功能治疗肿瘤。本发明提供的这种血液制品和IgG制品及从血液中除去IgG4的治疗方法，成本较低，适应症广，无明显副作用，有望成为低价高效的肿瘤预防和治疗药物，具有广阔的临床应用前景。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1为实施例1中食管癌相关组织连续切片的HE染色和免疫组化结果，从上到下A、B、C分别代表了同一例患者的癌组织，癌旁组织，正常淋巴组织。从左到右依次为HE染色、IgG4亚型免疫组化、IgG1亚型免疫组化结果。图像采集时选取的视野是10倍物镜。图中免疫组化采用的是AEC显色，红色即为阳性信号，图中标尺显示大小为100μm。

图2为实施例2中IgG4阳性细胞数统计结果散点图，横坐标从左到右依次为食管组织(n＝55)、正常淋巴组织(n＝7)、癌旁组织(n＝11)，纵坐标为IgG4阳性细胞数，*表示P<0.05。

图3为实施例3中食管癌病人IgG4阳性细胞数目与生存期的相关分析，横坐标为是食管癌组织中IgG4阳性细胞的数目，纵坐标为病人的生存时间。

图4为实施例4中SDS(染色-褪色-再染色)中IgG1、IgG2、IgG3、IgG4阳性浆细胞在肿瘤组织中的大致分布示意图。上面四行从上到下依次为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4抗体染色结果，红色为阳性信号，蓝色为细胞核。最下面一行为上面四张替换颜色后的合成图，其中IgG1用黄色表示，IgG2用绿色表示，IgG3用紫色表示，IgG4用红色表示，蓝色为细胞核。左侧图为10X物镜下结果，右侧图为40X物镜下结果。

图5为实施例5中不同亚型的IgG的免疫荧光双重染色图像。从上到下A，B，C三组分别代表了同一张切片上IgG1和IgG4，IgG2和IgG4，IgG3和IgG4阳性细胞的分布，以及二者叠加后的图像。IgG1、IgG2和IgG3采用红色荧光标记，为555nm通道，IgG4采用绿色荧光标记，为488nm通道。图中比例尺显示的大小为50μm。

图6A为实施例6中食管癌病人和健康志愿者IgG4的血清含量比较结果，IgG4在血清中的浓度单位为g/L。图6B为食管癌病人与健康志愿者血清中IgG4占总IgG的含量(IgG4/IgG_total)比较结果。

图7A为实施例7中不同病理分期的食管癌病人IgG4的血清含量比较，IgG4在血清中的浓度单位为g/L。图7B为不同病理分期的食管癌病人血清中IgG4占总IgG的含量(IgG4/IgG_total)比较(*,P<0.05；**,P<0.01)。

图8为实施例8中的western blot结果，图中上样的蛋白分别是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4四种IgG亚型，与Biotin标记的IgG4过夜孵育，反应的位置在50KDa附近。

图9为实施例9中的连续切片结果照片。证明，从癌症病人血中提取出的IgG1可以与自身的肿瘤细胞反应(CK阳性)，而同样从同一个癌症病人血中提取出的IgG4不与自身的肿瘤细胞反应，所以肿瘤微环境中和血液中增加的IgG4不是抗肿瘤的特异性抗体。而正是这种非抗肿瘤的IgG4对肿瘤免疫有明显的抑制作用。

图10A为实施例10中Western Blot检测西妥昔单抗(抗EGFR)与非特异性IgG4及非特异性IgG1的相互作用关系，西妥昔单抗作为底物，上样量为3μg。转膜后，用标记了生物素的的非特异性IgG4和IgG1作为一抗4℃过夜孵育，可以观察到bio-IgG4(这种IgG4不抗肿瘤抗原也不抗IgG1)与西妥昔单抗有很强的结合能力。

图10B为实施例10中各蛋白的ADCC效应，西妥昔单抗可以介导ADCC效应，数据是三次独立重复试验的结果，按照mean±SD作图，西妥昔单抗与各组蛋白的p值均小于0.05，n＝12。

图10C为实施例10中非特异性IgG4能够中和西妥昔单抗介导的ADCC，数据是三次独立重复试验的结果，按照mean±SD作图，p＜0.05，n＝12。

图11用于说明IgG4介导免疫逃避的新机制。局部增加的IgG4可以用其Fc端与肿瘤特异性IgG1反应，同时又可以与效应细胞的Fc受体反应，这样从两个层面阻断了免疫效应细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤作用。

图12A为实施例13中西妥昔单抗(IgG1)可以介导ADCP，巨噬细胞(橙色)吞噬肿瘤细胞(绿色)。

图12B为实施例13中非肿瘤特异性IgG4能够抑制巨噬细胞与A549的相互作用。西妥昔单抗与各组的p值均小于0.05。

图12C为实施例13中非肿瘤特异性IgG4能够中和西妥昔单抗介导的ADCP。IgG4对西妥昔单抗的肿瘤免疫有明显的抑制作用。

图13A为实施例14中西妥昔单抗(IgG1)可以介导CDC效应。西妥昔单抗与各组蛋白的p值均小于0.001。

图13B为实施例14中非肿瘤特异性IgG4能够中和西妥昔单抗介导的CDC效应，p＜0.001。

图14为实施例15的乳腺癌皮下肿瘤模型中，非肿瘤特异性IgG4能够促进肿瘤的生长。注射IgG组比对照组肿瘤明显增大，而注射去除了IgG4的总IgG组肿瘤明显变小。每组用了5只小鼠。IgG4组与各组比较的p值均小于0.05。

具体实施方式

下面通过实施例具体说明本发明的内容：

实施例1：IgG4在癌组织、癌旁组织和正常淋巴组织中的表达水平对比

选取了来自于同一个患者的食管癌、食管癌癌旁、正常淋巴组织(扁桃体)标本。通过对癌组织、癌旁组织、正常淋巴组织进行免疫组化，检测IgG4和IgG1的表达水平。结果如图1所示，发现IgG4在食管癌组织中远远高于癌旁组织和正常淋巴组织，与IgG1相比，IgG4肿瘤微环境中升高明显。肿瘤组织中有大量的IgG4阳性细胞，而癌旁和正常淋巴组织中几乎没有阳性。浸润在肿瘤间质中的IgG4阳性细胞聚集分布于浸润的肿瘤组织边缘。

实施例2：癌组织、癌旁组织和正常淋巴组织中的IgG4阳性细胞数统计

统计了55例食管癌组织、11例癌旁组织、7例正常淋巴组织(扁桃体)的免疫组化结果，统计高倍镜下IgG4阳性细胞数目，结果如图2所示，得到：癌组织与癌旁相比，癌组织中IgG4阳性细胞数目增加具有统计意义(p<0.05，配对t检验)。癌组织与正常淋巴相比，癌组织中IgG4阳性细胞数升高具有统计学意义(p<0.05，配对t检验)。

实施例3：癌组织中IgG4阳性细胞数及生存时间的关系

将食管癌病人的生存期与癌组织内IgG4浸润的密度进行相关性分析，如图3所示，肿瘤局部微环境中浸润的IgG4阳性细胞数目与病人的生存期成负相关，IgG4阳性细胞数目越多，病人的生存期越短(Pearson’s correlation，P<0.05)。

实施例4：SDS中肿瘤组织IgG四种亚型的阳性细胞分布

IgG四种亚型的浆细胞在体内的含量存在一定的比例，与四种的血清含量呈正相关，前面的实验发现IgG4在肿瘤组织中存在明显升高，为了了解IgG其他三种亚型在肿瘤微环境中的分布情况，利用本实验之前建立的SDS技术，在同一张切片先后对4种IgG亚型进行检测，通过反复的染色和褪色、抗原修复、一抗孵育等过程，得到四张不同IgG亚型的免疫组化阳性图像，后期通过图像叠加，将四种阳性信号整合到同一张图片中，直观比较四种IgG亚型在同一肿瘤组织中的含量，结果如图4所示。图片采集的视野选择是物镜40倍，其中IgG1，IgG2，IgG3，IgG4阳性细胞个数都能够直接计数，在不同的高倍镜视野，四种亚型的分布具体的细胞数目存在差异，但与正常人群中的IgG4占总IgG百分含量的平均值相比，IgG4的百分含量都有明显升高。

实施例5：不同亚型的IgG在肿瘤微环境中含量的免疫荧光结果

利用免疫荧光双重染色的方法对不同亚型的IgG在肿瘤微环境中含量进行评估。在正常人体内IgG1含量最高，其次是IgG2、IgG3、IgG4。从图5中我们可以看到，IgG1的含量最高，其次是IgG2、IgG3。与IgG2和IgG3相比，IgG4阳性细胞数目有明显的增加。图中IgG1和IgG4，IgG2和IgG4，IgG3和IgG4在同一肿瘤组织上的阳性信号经常紧密相近，但不存在叠加。而这种相近的现象在除IgG4之外的IgG其它亚型之间并不存在。

实施例6：肿瘤患者与正常人血清中IgG4的含量及IgG4/IgG_total比较

收集了59例食管癌病人的血清，26例健康对照者血清，送往金域医学检验中心有限公司进行血清总IgG和血清IgG4亚型的检测，检测方法均采用免疫散射比浊法。将每例样本中IgG4和总IgG的含量(g/L)整理，结合临床相关资料分析，得到以下的结果：

59例食管癌病人血清IgG4含量为(1.32±0.21)g/L，26例正常人的血清IgG4含量为(0.52±0.21)g/L。对食管癌病人的IgG4含量与正常人IgG4含量进行独立样本t检验，得到食管癌病人血清IgG4含量高于正常人，并且具有统计意义(P<0.0001)。结果如图6A所示。

59例食管癌病人血清IgG4/IgG_total＝(11.38±1.91)％，26例正常人血清IgG4/IgG_total＝(3.26±2.011)％。59例食管癌病人血清与26例正常人血清IgG4(IgG4/IgG_total)水平进行独立样本t检验，得到食管癌组IgG4/IgG_total比正常对照组高，具有统计学意义(P＝0.003)。结果如图6B所示。

以上结果说明肿瘤病人体内IgG4的绝对含量与相对含量都比正常人高，并且具有统计学意义。

实施例7：不同分期的肿瘤患者血清中IgG4的含量及IgG4/IgG_total比较

统计了食管癌病人的肿瘤病理分期与血清IgG4水平的关系，如图7A所示，I-II期食管癌病人的血清IgG4明显低于IV期食管癌病人血清IgG4水平，并且有统计学意义(P<0.01，独立样本t检验)。III期病人与IV病人相比，不存在统计学差异。另外如图7B所示，IgG4占总IgG的比例(IgG4/IgG_total)也是在I-II期病人与IV期病人之间存在统计学差异(P<0.05，独立样本t检验)，III期病人与IV相比没有统计学意义。

实施例8：Biotin标记的IgG4与IgG各亚型反应结果

Biotin即生物素是一类常用的蛋白质标记物，蛋白质标记上生物素后能够特异性和辣根过氧化酶标记的链霉亲和素或者荧光基团标记的链霉亲和素结合，进而在免疫组化或蛋白质印记后续的反应中被识别。在IgG4蛋白标记上生物素Biotin后，可以做第一抗体使用。其后的试剂使用荧光基团标记的链霉亲和素，在western blotting中发现，Biotin标记的IgG4可以和IgG的各类亚型反应，在50KD附近的位置出现反应条带，即Biotin标记的IgG4可以和其他IgG的重链反应。说明IgG4可以和IgG的亚型反应，并且这种反应是在IgG空间结构发生变化的条件下才能实现。结果见图8。

实施例9：非特异性IgG4可以与已经与肿瘤细胞反应的抗肿瘤抗原IgG1反应，从而阻断免疫效应细胞对肿瘤的识别和杀伤作用

我们发现癌症病人血清中提取出来的IgG1可以与同一病人的肿瘤细胞抗原反应，而同样提取出来的IgG4不与同一病人的肿瘤抗原反应。然而，非肿瘤特异性的IgG4可以与IgG1反应，我们进一步证实，非肿瘤特异性的IgG4可以在组织切片上与已经与肿瘤细胞结合的IgG1反应，从而IgG4阻断了由抗肿瘤抗原IgG1介导的免疫杀伤作用。我们认为这是在肿瘤的微环境中发生的真实反应，即IgG4对肿瘤免疫有阻断作用。

结果如图9的连续切片照片所示，从乳腺癌病人血中提出的IgG1可以与自身的癌细胞反应，而提出的IgG4不与癌细胞反应，证明与IgG1反应的细胞是癌细胞(CK)，而不是免疫细胞(CD68)。

实施例10：IgG4的抑制ADCC效应

西妥昔单抗能介导ADCC，IgG4能够与IgG1结合从而中和IgG1的抗肿瘤作用。

本实验首先建立了西妥昔单抗介导的ADCC。然后再加入蛋白IgG4，观察蛋白IgG4能否中和西妥昔单抗的抗肿瘤作用。

方法和材料：

细胞系：A549(中国上海细胞库)，PBMC是从健康志愿者新鲜血液中ficoll密度梯度离心分离而来。细胞培养所用的培养基均为1640(Hyclone)完全培养基，其中包含10％FBS(Hyclone)和1％双抗，均在37℃，5％CO₂条件下培养。

抗体与相关试剂：IgG4、IgG1均来自Athens Research公司，西妥昔单抗购买自武汉瑞力升公司，人血清白蛋白(Hsa)购自PRSPEC。测量细胞活性的试剂CCK-8试剂盒购自上海诩圣生物科技有限公司。Ficoll淋巴细胞分离液购自GE healthcare。

Western Blot：

检测西妥昔单抗与非特异性IgG4及非特异性IgG1的相互作用关系，西妥昔单抗作为底物，梯度上样量分别为3μg、5μg、10μg。转膜后，用标记了生物素的的非特异性IgG4和IgG1作为一抗4℃过夜孵育，一抗的蛋白浓度均为3μg/5mL。可以观察到bio-IgG4与西妥昔单抗有很强的结合能力，而bio-IgG1很少与西妥昔单抗结合。

抗体介导的细胞毒作用(ADCC)：

本实验采用cck-8试剂盒检测细胞活性以观察各实验组介导的ADCC效应。首先把靶细胞(A549)按4X10³/孔，4个重复孔接种到96孔板中，每个孔的培养液总体积为100μL，待细胞贴壁后，同时加入效应细胞(PBMC)和蛋白。加入蛋白和PBMC后总体积仍为100μL。靶效比为1:20，在蛋白的单独效应实验里，各蛋白包括西妥昔单抗的浓度均为3μg/mL，在非特异性IgG4的中和实验中，西妥昔单抗的浓度是3μg/mL，其余蛋白浓度均为9μg/mL。培养箱中孵育24h后，每孔加入10μl cck-8，在450nm处测出吸光度值，计算细胞活力。

结果：非特异IgG4能够中和西妥昔单抗介导的ADCC作用。之前并没有报道过非特异IgG4能够中和临床抗肿瘤药物(西妥昔单抗)的ADCC作用，本实验揭示了肿瘤免疫逃逸过程中IgG4扮演了重要的角色，另外也对临床IgG1型抗肿瘤药物应用提供一些参考。

实施例11：IgG4与抗肿瘤的IgG1竞争效益免疫细胞的Fc受体

我们进一步发现IgG4可以竞争性地与免疫效应细胞的Fc受体结合，从而阻断或减低免疫效应细胞与特异性抗肿瘤的IgG1的结合，进一步阻断肿瘤免疫。这种竞争性结合与IgG4的浓度有关，浓度越高竞争性越强，对IgG1的抑制就越大，免疫细胞对肿瘤的杀伤力就越小。

实施例12：不含有IgG4的血液制品及不含有IgG4的IgG制品的制备

1)不含有IgG4的血液制品的具体制备步骤。

IgG4可以通过用抗IgG4的特异性抗体从血液制品中提取出来，剩余部分即为不含有IgG4的血液制品。

2)不含有IgG4的IgG制品的具体制备步骤

首先用G蛋白将IgG从血清中提取出来，然后用抗IgG4的特异性抗体将IgG4吸附出来，剩余的部分即为不含有IgG4的IgG制品。

实施例13：非特异性IgG4的抑制ADCP(antibody-dependent cellularphagocytosis)效应

西妥昔单抗能介导ADCP，IgG4能够与IgG1结合从而阻断IgG1的抗肿瘤作用。

本实验首先建立了西妥昔单抗介导的ADCP。然后再加入蛋白IgG4，观察蛋白IgG4能否中和西妥昔单抗的抗肿瘤作用。

方法和材料：

细胞系：A549(中国上海细胞库)，PBMC是从健康志愿者新鲜血液中ficoll密度梯度离心分离而来。细胞培养所用的培养基均为1640(Hyclone)完全培养基，其中包含10％FBS(Hyclone)和1％双抗，均在37℃，5％CO₂条件下培养。

抗体与相关试剂：IgG4、IgG1均来自Athens Research公司，西妥昔单抗购买自武汉瑞力升公司，测量细胞活性的试剂CCK-8试剂盒购自上海诩圣生物科技有限公司。Ficoll淋巴细胞分离液购自GE healthcare。

抗体介导的细胞吞噬作用(ADCP)：

本实验采用cck-8试剂盒检测细胞活性以观察各实验组介导的ADCP效应。首先把靶细胞(A549)按4X10³/孔，4个重复孔接种到96孔板中，每个孔的培养液总体积为100μL，待细胞贴壁后，同时加入效应细胞(PBMC)和蛋白。加入蛋白和PBMC后总体积仍为100μL。靶效比为1:20，在蛋白的单独效应实验里，各蛋白包括西妥昔单抗的浓度均为3μg/mL，在非特异性IgG4的中和实验中，西妥昔单抗的浓度是3μg/mL，其余蛋白浓度均为9μg/mL。培养箱中孵育24h后，每孔加入10μL cck-8，在450nm处测出吸光度值，计算细胞活力。

结果：非肿瘤特异IgG4能够中和西妥昔单抗介导的ADCP作用。之前并没有报道过非特异IgG4能够中和临床抗肿瘤药物(西妥昔单抗)的ADCP作用，本实验揭示了肿瘤免疫逃逸过程中IgG4扮演了重要的角色，另外也对临床IgG1型抗肿瘤药物应用提供一些参考。

实施例14：非肿瘤特异性IgG4的抑制CDC(complement-dependent cytotoxicity)效应

西妥昔单抗能介导CDC，IgG4能够与IgG1结合从而中和IgG1的抗肿瘤作用。

本实验首先建立了西妥昔单抗介导的CDC。然后再加入蛋白IgG4，观察蛋白IgG4能否中和西妥昔单抗的抗肿瘤作用。

方法和材料：

细胞系：A549(中国上海细胞库)，补体(Co)是从健康志愿者新鲜血液中ficoll密度梯度离心分离而来。细胞培养所用的培养基均为1640(Hyclone)完全培养基，其中包含10％FBS(Hyclone)和1％双抗，均在37℃，5％CO₂条件下培养。

抗体与相关试剂：IgG4、IgG1均来自Athens Research公司，西妥昔单抗购买自武汉瑞力升公司，测量细胞活性的试剂CCK-8试剂盒购自上海诩圣生物科技有限公司。

补体依赖的细胞毒作用(CDC)：

本实验采用cck-8试剂盒检测细胞活性以观察各实验组介导的CDC效应。首先把靶细胞(A549)按4X10³/孔，4个重复孔接种到96孔板中，每个孔的培养液总体积为100μL，待细胞贴壁后，同时加入补体(Co)和蛋白。加入蛋白和Co后总体积仍为100μL。靶效比为1:20，在蛋白的单独效应实验里，各蛋白包括西妥昔单抗的浓度均为3μg/mL，在非特异性IgG4的中和实验中，西妥昔单抗的浓度是3μg/mL，其余蛋白浓度均为9μg/mL。培养箱中孵育24h后，每孔加入10μL cck-8，在450nm处测出吸光度值，计算细胞活力。

结果：非特异IgG4能够中和西妥昔单抗介导的CDC作用。之前并没有报道过非特异IgG4能够中和临床抗肿瘤药物(西妥昔单抗)的CDC作用，本实验揭示了肿瘤免疫逃逸过程中IgG4扮演了重要的角色，另外也对临床IgG1型抗肿瘤药物应用提供一些参考。

实施例15：非肿瘤特异性IgG4在体内加速了癌症的生长。

动物模型：

Balb/c小鼠(Vital River technical co.,LTD(Beijing,China))，小鼠年龄在6到8周，体重20±2g。所有小鼠在左前臂皮下接种1x10⁵ 4T1细胞，构建乳腺癌模型。IgG4来源于人骨髓瘤血浆(Athens Research&Technology,Inc.)。通过将总IgG(IVIG)(中国上海Raas)过滤IgG4特异性抗体的柱，获得缺少IgG4的总IgG(IVIG)。

小鼠分为单纯IgG4组、不含IgG4的IgG组和对照组(PBS)。分别以200ug/小鼠(1mg/mL，200μL)注射IgG4和无IgG4的IgG。

第一次注射IgG4次日，在注射IgG4的确切位置，将1x10⁵ 4T1小鼠乳腺癌细胞(ATCC)接种于每只小鼠。治疗液注射4次，间隔5天。每三天测量并拍照一次肿瘤肿块的大小。老鼠在第21天被宰杀。对比发现，局部注射非肿瘤特异性IgG4的肿瘤肿块，比注射“不加IgG4的IgG”或接种21天后注射PBS的IgG大一倍。这一体内结果表明，IgG4可以通过抑制局部免疫反应有效促进肿瘤生长(图14)。

以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (4)

1.一种血液制品在制备治疗肿瘤的药物中的用途，所述肿瘤为乳腺癌、直肠癌、食道癌或肺癌，所述血液制品为IgG制品，该IgG制品中不含有IgG4或IgG4的含量不高于1%；

或，所述IgG制品通过从人IgG中除去IgG4后制备得到；

或，所述IgG制品通过从人IgG中除去部分IgG4后制备得到，且其中IgG4的含量不高于1%。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述治疗包括抑制肿瘤生长、抑制肿瘤侵袭、抑制肿瘤转移。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物的给药途径包括静脉给药、皮下给药、肿瘤局部给药、口服给药、腔内给药。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述血液制品为IgG制品时，所述药物的用量为每公斤体重0.01～1.0 g的IgG制品。

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