CN112972688A - PPARδ抑制剂联合免疫治疗药物在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及PPARδ抑制剂联合免疫治疗药物在制备抗肿瘤药物中的应用。免疫治疗药物为免疫激动剂或免疫检查点抑制剂。肿瘤优选为黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、食管癌、大肠癌、结肠癌、淋巴瘤、脑瘤、肉瘤、子宫颈癌、前列腺癌、膀胱癌、骨肉瘤、头颈癌、肾细胞癌或胃癌。本发明的药物抗肿瘤效果显著，靶向性强并且副作用很小。

Description

PPARδ抑制剂联合免疫治疗药物在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术技术领域，尤其涉及一种PPARδ抑制剂联合免疫治疗药物在制备抗肿瘤药物中的应用及抗肿瘤药物组合物。
背景技术
近年来肿瘤已经成为威胁人们健康的严重疾病，除了传统的外科手术、放疗和化疗之外，免疫疗法可以调动机体的免疫系统特异性地杀伤肿瘤，相比传统的治疗方法，因为免疫疗法副作用较小、治疗效果好且疗效持久正越来越受到人们的关注，免疫疗法不但可以单独应用还可以结合放疗和化疗使用，而且不同的免疫疗法之间也可以联合使用，以增强治疗肿瘤的效果。
免疫治疗的目标就是建立新的或者是促进已经存在的抗肿瘤免疫反应，激发免疫系统特异性地消灭肿瘤细胞并产生针对肿瘤的免疫记忆反应。肿瘤躲避免疫系统攻击的方式多种多样，其中很重要的一点就是利用共抑制机理，通过CTLA-4、PD-(L)1等免疫抑制分子促进免疫逃逸(Beatty GL,Gladney WL.Clin Cancer Res.2015；21(4):687–692.)。针对这些靶点的第一代免疫检查点抑制剂近年来在肿瘤治疗中取得重大进展，抗PD-(L)1单抗和抗CTLA-4单抗已经获批上市治疗数十种癌症，但是总有效率也仅20％左右。该治疗方法有效的前提是免疫系统针对肿瘤抗原预先能够产生足够的免疫反应，也就是热肿瘤，虽然这部分肿瘤病人中含有对肿瘤免疫反应的T细胞，但是这部分T细胞的功能被PD-1信号和CTLA4所抑制，解除这种抑制作用对这部分病人是有效的，而对于冷肿瘤也就是免疫系统对肿瘤抗原没有产生足够反应的肿瘤，要使免疫系统更高效地运转起来，有效地激活免疫系统就显得尤为重要。
激活共刺激信号是激活免疫系统的重要手段，激活位于抗原呈递细胞(antigenpresenting cell，APC)上的CD40共刺激信号通路是激活免疫系统的有效方法之一。CD40分子主要表达于APC细胞上，包括某些单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞(dendritic cell，DC)上，也可表达于B细胞、血小板、内皮细胞和平滑肌细胞上。CD40L表达于活化的CD4 T细胞、记忆性CD8 T细胞上和活化的NK细胞上。CD40激活剂能够促进DC细胞共刺激分子CD80和CD86、主要组织相容性分子的表达，还能够促进具有免疫刺激作用的细胞因子的释放，从而促进APC的抗原呈递功能，在肿瘤模型中显示出促进T细胞免疫的能力(French RR,ChanHT,Tutt AL,Glennie MJ.Nat Med.1999；5(5):548–553.；Sotomayor EM,Borrello I,TubbE,et al.Nat Med.1999；5(7):780–787.；Diehl L,den Boer AT,Schoenberger SP,etal.Nat Med.1999；5(7):774–779.)。重组的人CD40L在进展期实体瘤和非何杰金淋巴瘤(Vonderheide RH,Dutcher JP,Anderson JE,et al.J Clin Oncol.2001；19(13):3280–3287.)、含有CD40L DNA的腺病毒在膀胱癌(Malmstrom PU,Loskog AS,Lindqvist CA,etal.Clin Cancer Res.2010；16(12):3279–3287.)等的临床试验中已经显示出初步疗效，能够有效地激发CD8 T细胞的抗肿瘤免疫反应。在抗CD40激动性抗体治疗胰腺癌的临床试验中发现，CD40信号还能够激活巨噬细胞的免疫监视作用，促进肿瘤浸润巨噬细胞功能从促肿瘤向抗肿瘤转变(Beatty GL,Chiorean EG,Fishman MP,et al.Science.2011；331(6024):1612–1616.)。
几种抗CD40激动性抗体已在临床显示出初步疗效，但是抗CD40激动性抗体单独应用总有效率有限，总反应率仅为14％左右，为此有研究考虑抗CD40激动性抗体和其它免疫刺激剂联合应用以增加其免疫效果，联合应用的免疫刺激剂主要有I型干扰素、IL-2和TLR受体激动剂等(美国专利US9095608B2；Bouchlaka MN,Sckisel GD,Chen M,et al.TheJournal of experimental medicine.2013；210(11):2223–2237.；美国专利US7993659B2.)。限制抗CD40激动性抗体临床应用的另一个重要因素是其较大的副作用，其临床有效剂量接近于毒性剂量，其副作用主要包括剂量依赖的细胞因子释放综合症(Vonderheide RH,Flaherty KT,Khalil M,et al.JClin Oncol.2007；25(7):876–883.)和肝脏毒性(例如转氨酶升高、肝细胞坏死等)(Medina-Echeverz J,Ma C,Duffy AG,etal.Cancer immunology research.2015；3(5):557–566.)。临床试验发现抗CD40激动性抗体和IL-2联合应用时更会发生随年龄增加的致死性的肝脏毒性以及肺脏和肠道的毒性(Bouchlaka MN,Sckisel GD,Chen M,et al.The Journal of experimentalmedicine.2013；210(11):2223–2237.)，在小鼠模型中发现抗CD40激动性抗体和化疗药物联合应用时更是发生了致死性的毒性(Long KB,Gladney WL,Tooker GM,et al.CancerDiscov.2016；6(4):400–413.)。因此较大的抗CD40激动剂剂量或者是与其它免疫刺激剂联用因免疫系统的全面活化而易于引起较大的副作用，从而限制了其临床应用，如何降低大剂量CD40激动剂应用引发的毒性而不影响甚至是增加其抗肿瘤活性是CD40激动剂抗肿瘤临床应用亟待解决的关键性问题。
过氧化物酶体增殖剂激活受体(peroxisome proliferators-activatedreceptors，PPARs)是核激素受体家族中的配体激活受体，在不同的物种中已经发现了它的3种亚型，控制许多细胞内的代谢过程；三种PPAR类型，即α、γ和δ，构成核受体的一个亚家族。PPAR家族通常被内源性脂肪酸激活(HE Xu,MH Lambert,VG Montana,et al.Molecularcell.1999；3(3):397-403.)，通过转录激活靶基因(RM Evans,GD Barish,YX Wang.Naturemedicine.2004；10(4):355-361.)来控制全身脂肪酸代谢。PPARγ或PPARδ是M2型巨噬细胞成熟过程中所必需的，阻断PPARγ或PPARδ信号通路可促使巨噬细胞极化至M1状态(JIOdegaard,RR Ricardo-Gonzalez,MH Goforth,et al.Nature.2007；447(7148):1116-20.；JI Odegaard,RR Ricardo-Gonzalez,ARed Eagle,et al.Cell Metab.2008；7(6):496-507.)。在肿瘤微环境中，巨噬细胞是浸润性白细胞的主要群体之一，具有M2样表型(一种抑制表型)，它促进肿瘤的进展和免疫治疗或化学治疗的耐药性。将其极化逆转为M1状态被认为是一种重要的抗癌免疫治疗策略(D Saha,RL Martuza,SD Rabkin.Cancer Cell.2017；32(2):253-267.e255.；DG DeNardo,B Ruffell.Nat Rev Immunol.2019；19(6):369-382.)。
此外，一方面由于对本领域技术的理解存在差异；另一方面虽然发明人做出本发明时研究了大量文献和专利，但由于篇幅所限并未详细罗列所有的细节与内容，然而这绝非本发明不具备这些现有技术的特征，相反本发明已经具备现有技术的所有特征，而且申请人保留在背景技术中增加相关现有技术之权利。
发明内容
根据上述现有技术情况，本申请研究人员假设PPARγ或PPARδ抑制剂可以增强抗CD40激动性抗体的治疗效果。申请人通过研究发现联合应用抗CD40激动性抗体和PPARδ抑制剂治疗黑色素瘤的疗效优于单纯应用抗CD40激动性抗体，联合治疗有100％的有效率。同时，抗CD40激动性抗体与PPARδ抑制剂联合治疗较单纯应用抗CD40激动性抗体的有效剂量范围更广。在联合应用抗CD40激动性抗体和PPARδ抑制剂时，低剂量和高剂量的抗CD40激动性抗体具有同等良好的肿瘤治疗效果，而在与较低剂量的抗CD40激动性抗体联合治疗中几乎没有肝毒性。令人意外的是，在黑色素瘤模型中，只有抗CD40激动性抗体和PPARδ抑制剂联合使用具有更好的治疗效果，而相同剂量的抗CD40激动性抗体和PPARγ没有协同抗肿瘤作用，而且PPARδ抑制剂单独使用没有治疗效果。
基于申请人的上述研究发现，申请人请求保护以下技术方案：
本发明的第一方面，提供PPARδ抑制剂联合免疫治疗药物在抗肿瘤药物中的制药应用，
优选所述肿瘤为黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、食管癌、大肠癌、结肠癌、淋巴瘤、脑瘤、肉瘤、子宫颈癌、前列腺癌、膀胱癌、骨肉瘤、头颈癌、肾细胞癌或胃癌。
上述制药应用中，所述免疫治疗药物为免疫激动剂或免疫检查点抑制剂；
优选所述免疫激动剂为针对OX40、4-1BB(CD137)、CD27、GITR、CD28和ICOS等共刺激分子的激动剂；
优选所述免疫激动剂为CD40激动剂；
优选所述免疫检查点抑制剂选自PD-1抑制剂、PDL1抑制剂、TIM3抑制剂、LAG3抑制剂、CD47抑制剂；优选免疫检查点抑制剂选自抗PD-1抗体、抗PDL1抗体、抗TIM3抗体、抗LAG3抗体、抗CD47抗体和抗CTLA-4抗体；
优选免疫检查点抑制剂为抗PD-1抗体。
上述制药应用中，所述CD40激动剂选自抗CD40激动性抗体、CD40L蛋白、CD40L蛋白的表达载体，或其片段、衍生物、多聚体；
优选所述CD40L蛋白为重组CD40L蛋白；
优选CD40激动剂为抗CD40激动性抗体。
上述制药应用中，所述PPARδ抑制剂是能够抑制PPARδ的化合物、或者能够抑制PPARδmRNA作用的核酸分子、或者能靶向分解PPARδ的分子；
优选所述核酸分子为siRNA或者shRNA；
优选所述PPARδ抑制剂是GSK3787。
本发明的第二方面提供一种抗肿瘤药物组合物，包含分别制剂后组合包装的PPARδ抑制剂和免疫治疗药物，或者PPARδ抑制剂和免疫治疗药物混合后制成的制剂；
优选所述肿瘤为黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、食管癌、大肠癌、结肠癌、淋巴瘤、脑瘤、肉瘤、子宫颈癌、前列腺癌、膀胱癌、骨肉瘤、头颈癌、肾细胞癌或胃癌；
优选所述肿瘤为黑色素瘤。
优选地，所述PPARδ抑制剂是能够抑制PPARδ的化合物、或者能够抑制PPARδmRNA作用的核酸分子、或者能靶向分解PPARδ的分子；
进一步优选所述核酸分子为siRNA或者shRNA；优选所述PPARδ抑制剂是GSK3787。
优选地，所述免疫治疗药物为免疫激动剂或免疫检查点抑制剂；
进一步优选所述免疫激动剂为针对OX40、4-1BB(CD137)、CD27、GITR、CD28和ICOS等共刺激分子的激动剂；
进一步优选所述免疫激动剂为CD40激动剂；
进一步优选所述免疫检查点抑制剂选自PD-1抑制剂、PDL1抑制剂、TIM3抑制剂、LAG3抑制剂、CD47抑制剂；
进一步优选免疫检查点抑制剂选自抗PD-1抗体、抗PDL1抗体、抗TIM3抗体、抗LAG3抗体、抗CD47抗体和抗CTLA-4抗体。
上述抗肿瘤药物组合物，还包含可接受的药用载体，制成各种药学上可接受的制剂；
优选所述制剂为注射剂、靶向制剂或纳米制剂。
本发明的最后一方面提供PPARδ抑制剂联合免疫治疗药物在治疗肿瘤中的应用：向患者施用低剂量免疫治疗药物疗程期间也施用PPARδ抑制剂以增强免疫治疗效果、减少免疫治疗药物的副作用或避免增加免疫治疗药物剂量；
所述免疫治疗药物为免疫激动剂或免疫检查点抑制剂；
所述PPARδ抑制剂是能够抑制PPARδ的化合物、或者能够抑制PPARδmRNA作用的核酸分子、或者能靶向分解PPARδ的分子；
优选所述核酸分子为siRNA或者shRNA；优选所述PPARδ抑制剂是GSK3787。
所述免疫激动剂为针对OX40、4-1BB(CD137)、CD27、GITR、CD28和ICOS等共刺激分子的激动剂；
优选所述免疫激动剂为CD40激动剂；
所述免疫检查点抑制剂选自PD-1抑制剂、PDL1抑制剂、TIM3抑制剂、LAG3抑制剂、CD47抑制剂；优选免疫检查点抑制剂选自抗PD-1抗体、抗PDL1抗体、抗TIM3抗体、抗LAG3抗体、抗CD47抗体和抗CTLA-4抗体；
优选免疫检查点抑制剂为抗PD-1抗体。
B细胞在肿瘤发生发展中具有双重作用。大量研究表明，B细胞和浆细胞可能在微环境中起到促进肿瘤生长的作用，促进了基于B细胞清除的实体肿瘤治疗的发展。但是对人类肿瘤的一些研究表明，与小鼠肿瘤模型中B细胞的促肿瘤功能不同，人类肿瘤中的B细胞可以形成第三级淋巴结构(TLS)，TLS中的B细胞可以通过促进肿瘤抗原呈递给CD4 T细胞来促进免疫治疗反应，这与患者的良好预后有关(F Petitprez,A Reyniès,EZ Keung,etal.Nature.2020；577(7791):556-560.；BA Helmink,SM Reddy,J Gao,etal.Nature.2020；577(7791):549-555.；R Cabrita,M Lauss,A Sanna,etal.Nature.2020；577(7791):561-565.)。因此，很明显，B细胞清除可能会对大部分患者产生有害后果，与靶向B细胞治疗方法的应用及其与其他疗法的联合应用相关的决策，应基于对不同B细胞亚群参与肿瘤-免疫相互作用的普遍本质的更好理解。人类肿瘤和小鼠肿瘤模型中B细胞所表现出的不同作用可能是因为B细胞本身是一个具有不同作用的异质性群体，而原来在小鼠的实验采用的又是对B细胞群体整体清除的办法来研究B细胞在肿瘤发生和发展中的作用。因此靶向有免疫抑制功能的B细胞就成为一种有吸引力的策略。
因此，本发明中PPARδ抑制剂仅靶向有免疫抑制功能的CD19+CD24hiIgDlo/-B细胞，而不影响具有免疫刺激作用的CD19+CD24loIgDhi B细胞，避免了完全清除B细胞带来的不良影响。并且，PPARδ抑制剂和免疫治疗药物联合治疗策略不但可以增加免疫治疗的效果，而且具有较高的安全性，以避免患者暴露于无效的免疫治疗和免疫治疗的潜在严重毒副作用。
本研究结果表明，在PPARδ抑制剂和免疫治疗药物联合治疗模型中，PPARδ抑制剂可能是通过其他机制而不是通过影响肿瘤相关巨噬细胞极化状态发挥治疗作用。在评价抗CD40激动性抗体和PPARδ抑制剂联合治疗黑色素瘤的作用机制时，发现引流淋巴结中抑制T细胞功能的B细胞数量和比例显著增加。清除B细胞或用PPARδ抑制剂抑制B细胞的免疫抑制功能，可显著提高低剂量抗CD40激动性抗体的治疗效果。除此之外，清除整个B细胞或使用PPARδ抑制剂也可以提高抗PD-1抗体的抗肿瘤效果。进一步研究发现肿瘤本身可以诱导引流淋巴结中CD19+CD24hiIgDlo/-B细胞增加，与CD19+CD24loIgDhi B细胞相比，CD19+CD24hiIgDlo/-B细胞表达更高的PPARδ、具有更强的增殖能力和免疫抑制功能，CD19+CD24loIgDhi B细胞则具有免疫刺激作用。PPARδ抑制剂可以降低CD19+CD24hiIgDlo/-B细胞的增殖及免疫抑制功能，而且副作用很小，具有很高的安全性。
本申请至少存在以下有益技术效果：
1)PPARδ抑制剂可以降低肿瘤诱导的CD19+CD24hiIgDlo/-B细胞的增殖和抑制功能，可以和CD40激动剂联合应用于抗肿瘤治疗，在减少CD40激动剂的用量的同时可以增强CD40激动剂刺激免疫反应的效果，明显增强CD40激动剂治疗肿瘤的效果，从而避免大剂量CD40激动剂带来的毒副作用。
2)本发明还证实PPARδ抑制剂和低剂量的CD40的激动剂联合应用于荷瘤小鼠能够有效激发机体产生抗肿瘤的T细胞，激发抗肿瘤的T细胞记忆反应，显著增强其抗肿瘤效果。
3)本发明证实PPARδ抑制剂还可以与其它免疫治疗药物(免疫激动剂或免疫检查点抑制剂)联合应用于抗肿瘤治疗。
4)与CD19+CD24loIgDhi B细胞相比，CD19+CD24hiIgDlo/-B细胞表达更高的PPARδ。本发明的PPARδ抑制剂和免疫治疗药物联合治疗模型中，PPARδ抑制剂仅降低有免疫抑制作用的CD19+CD24hiIgDlo/-B细胞的增殖与抑制功能，对有免疫刺激作用的CD19+CD24loIgDhi B细胞作用很小，避免了B细胞耗竭可能会对大部分患者产生的有害后果，靶向性强而且副作用很小，具有很高的安全性。
附图说明
图1是实施例1中FGK45.5具有剂量依赖性的抗肿瘤作用实验结果；
图2是实施例2中PPARδ抑制剂联合FGK45.5治疗的小鼠实验结果；
图3是实施例3中FGK45.5与PPARδ抑制剂联合治疗的免疫效应；
图4是实施例4中不同处理组荷瘤小鼠引流淋巴结淋巴细胞的亚群和表型变化；
图5是实施例5中PPARδ抑制剂减弱B细胞的免疫抑制作用验证实验结果；
图6是实施例6中PPARδ抑制剂联合抗PD-1抗体对B16荷瘤小鼠的治疗作用；
图7是实施例7中PPARδ抑制剂降低CD19+CD24hiIgDlo/-B细胞的增殖实验结果；
图8是实施例8中PPARδ抑制剂降低CD19+CD24hiIgDlo/-B细胞的抑制功能实验结果；
图中，Rat IgG代表对照抗体组，FGK代表抗CD40激动性抗体FGK45.5，T007代表PPARγ抑制剂T0070907，GSK代表PPARδ抑制剂GSK3787，Naive B代表来自天然未处理小鼠的B细胞，No B代表共培养体系中未添加B细胞组，Naive代表天然小鼠组，NS代表没有统计学意义，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001。
具体实施方式
下面结合附图进行详细说明。
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
主要试剂来源：
PPARγ抑制剂T0070907，购自美国Selleck Chemicals公司；
PPARδ抑制剂GSK3787，购自美国Selleck Chemicals公司；
FGK45.5(小鼠的抗CD40激动性抗体)：购自美国BioXcell公司(West Lebanon,NH)；
大鼠IgG：克隆号为2A3，购自美国BioXcell公司(West Lebanon,NH)；
抗CD19抗体：克隆号为1d3，购自美国BioXcell公司(West Lebanon,NH)；
抗PD-1抗体：克隆号为RMP1-14，购自美国BioXcell公司(West Lebanon,NH)；
抗CD3ε抗体：克隆号为145-2C11，购自美国Biolegend公司(San Diego,CA)；
抗CD28抗体：克隆号为37.51，购自美国Biolegend公司(San Diego,CA)；
B16肿瘤细胞：购买自美国ATCC(the American Type Culture Collection)细胞库。
实施例1抗CD40激动性抗体具有剂量依赖性的抗肿瘤作用，但高剂量可引起明显的肝毒性。
抗CD40激动性抗体能促进冷肿瘤向热肿瘤的转化，对某些肿瘤有中等程度的抗肿瘤作用，但其有效剂量范围窄，对肝脏及其他组织有毒性。有报道称，通过组织内注射和缓慢释放抗CD40激动性抗体到肿瘤引流区可以减轻毒性作用。
首先，我们检测了瘤周注射抗CD40激动性抗体是否具有明显的毒性。
我们使用了一个研究广泛和免疫原性较强的小鼠B16黑色素瘤模型(C57BL/6B16荷瘤小鼠模型)：C57BL/6小鼠(8-10周，n＝5/组)皮下接种7×105B16肿瘤细胞(小鼠黑色素瘤细胞)，肿瘤细胞接种后约8天肿瘤可触及时给予抗CD40激动性抗体。
每天对小鼠进行监测，每四天用卡尺测量一次肿瘤。肿瘤体积按长度(a)和宽度(b)测量，计算为肿瘤体积＝ab2/2。
用药方案：这些荷瘤小鼠用低剂量25μg的FGK45.5(小鼠的抗CD40激动性抗体)治疗3次，总剂量75μg(第8、11、14天)或高剂量40μg治疗5次总剂量200μg(第8、11、14、17、20天)或40μg同型对照大鼠IgG 5次(第8、11、14、17、20天)。在肿瘤与肿瘤引流腹股沟引流淋巴结之间进行皮下注射。各组最后一次注射结束72小时后，取小鼠血清检测丙氨酸转氨酶(ALT，已知肝组织损伤的指标)。
结果如图1a所示，注射FGK45.5的小鼠肿瘤负荷较对照组低，但高剂量组FGK45.5抗肿瘤作用更明显。
这些结果表明，FGK45.5的抗肿瘤作用具有剂量依赖性。
我们通过分析ALT来评估上述治疗的毒性。FGK45.5低剂量组小鼠肝损伤较轻，血清ALT较对照组小鼠血清约40单位略有升高至100单位左右。值得注意的是，高剂量组FGK45.5的毒性作用进一步增强。用高剂量FGK45.5治疗的小鼠肝脏显示出更严重的损伤，ALT水平显著升高至500单位左右(图1b)。
这些数据表明，较高剂量的激动性CD40抗体局部皮下注射可以提高这种治疗的抗肿瘤效果，但也会引起较严重的肝脏毒性，通过增加抗CD40激动性抗体剂量来增加其抗肿瘤效果的方案是行不通的。因此，如何在保证抗肿瘤作用的前提下降低激动性CD40抗体的毒副作用是其临床应用的关键。
实施例2 PPARδ抑制剂可增强小剂量抗CD40激动性抗体的治疗效果且无明显肝脏毒性，而PPARγ抑制剂无此作用。
据报道，PPARγ或PPARδ是脂肪酸的传感器，对M2型(一种抑制表型)巨噬细胞的成熟是必需的，阻断PPARγ或PPARδ通路可促使巨噬细胞极化至M1状态。在肿瘤微环境中，巨噬细胞是浸润性淋巴细胞的主要群体之一，具有M2样表型，它促进肿瘤的进展和免疫治疗或化学治疗的耐药性。将其极化逆转为M1状态被认为是一种重要的抗癌免疫治疗策略。鉴于其将肿瘤浸润巨噬细胞(TAM)转换为主要M1表型的能力，我们利用实施例1的B16荷瘤小鼠模型和低剂量FGK45.5的治疗方案来确定PPARγ抑制剂(T0070907，美国Selleck公司)或PPARδ抑制剂(GSK3787，美国Selleck公司)和抗CD40激动性抗体是否具有联合抗肿瘤作用。
B16黑色素瘤荷瘤小鼠模型建立、低剂量及高剂量FGK45.5的用药方案均按照实施例1进行，低剂量FGK45.5、T0070907或GSK3787联合组于B16细胞注射第7～16天按附图2a、2b中标示的剂量腹腔注射T0070907或GSK3787，每日1次；高剂量剂量FGK45.5、T0070907或GSK3787联合组于B16细胞注射第7～22天按附图2b中标示的剂量腹腔注射T0070907或GSK3787，每日1次；T0070907或GSK3787单独治疗组于B16细胞注射第7～16天按附图2a、2b中标示的剂量腹腔注射T0070907或GSK3787，每日1次。
与先前的研究一致，单独使用FGK45.5的低剂量(总共75μg剂量)仅表现出轻微的抗肿瘤作用。而PPARγ抑制剂或PPARδ抑制剂单独治疗几乎没有抗肿瘤作用，但FGK45.5与PPARδ抑制剂联合治疗可显著降低肿瘤生长速度。此外，FGK45.5和PPARγ抑制剂没有协同抗肿瘤作用(图2a)。
接下来我们进一步检查了PPARδ抑制剂和不同剂量FGK45.5联合治疗的效果。PPARδ抑制剂和低剂量FGK45.5联合的治疗效果基本上等同于其和高剂量FGK45.5联合的治疗效果，与高剂量FGK45.5的治疗效果一致，这三种治疗方案都具有明显的、几乎相同的抗肿瘤作用。
用肿瘤生长体积曲线评估的抗肿瘤效果在高剂量FGK45.5与PPARδ抑制剂联合组、低剂量FGK45.5与PPARδ抑制剂联合组和单独高剂量FGK45.5组肿瘤发生率分别为62％(5/8)、77％(6/9)和87％(7/8)，有效率均为100％，而单用FGK45.5低剂量组的肿瘤发生率和有效率分别为100％(8/8)和50％(4/8)(图2b)。
更重要的是，低剂量FGK45.5与PPARδ抑制剂联用组和高剂量FGK45.5与PPARδ抑制剂联用组相比表示肝毒性的指标(血清ALT水平)明显降低。各组在PPARδ抑制剂(GSK3787)最后一次注射后24小时取小鼠尾静脉血，分离血清后检测ALT水平，低剂量FGK45.5与PPARδ抑制剂联用组血清ALT水平约为100IU/L，与高剂量FGK45.5与PPARδ抑制剂联合组血清ALT水平约为500IU/L相比，差异有统计学意义，与单独使用低剂量FGK45.5组相当(图2c)。
诱导免疫系统产生抗肿瘤的免疫记忆反应是免疫系统发挥长效抗肿瘤作用及阻止肿瘤复发的关键。接下来进一步确认FGK45.5与PPARδ抑制剂联合用药是否能诱导机体抗肿瘤的免疫记忆反应：
在上述B16荷瘤小鼠模型和治疗方案中，低剂量FGK45.5与PPARδ抑制剂联合治疗组和单用高剂量FGK45.5组治疗结束后均有部分无瘤小鼠。这些无瘤小鼠被用来做下面描述的记忆实验。初次治疗结束90天后，用5×105B16肿瘤细胞经尾静脉注射再激发这些无肿瘤小鼠。对照组为年龄相匹配的未经过注射B16肿瘤细胞的小鼠。
值得注意的是，两个治疗组中约92％的小鼠存活了40天以上，而对照组的所有小鼠都在31天内死亡。此外，低剂量FGK45.5与PPARδ抑制剂联合治疗组小鼠存活100天以上者占80％，而高剂量FGK45.5单独治疗组仅50％存活100天以上，但两组的差别并没有统计学意义。这些结果表明，低剂量FGK45.5与PPARδ抑制剂联合治疗同样可以诱导免疫系统产生与单独使用高剂量FGK45.5相当的抗肿瘤记忆反应(图2d)。
以上结果提示，在FGK45.5与PPARδ抑制剂联合用药组，PPARδ抑制剂在显著提高小剂量抗CD40激动性抗体治疗效果的同时，并未加重肝损伤，低剂量FGK45.5与PPARδ抑制剂联合治疗方案达到了良好的安全性和有效性的统一。因此鉴于安全性的考虑，我们在下面的实验中的FGK45.5的剂量均选用低剂量，包括单独应用和联合应用。
实施例3 FGK45.5与PPARδ抑制剂联合疗法能够有效提高CD8 T细胞浸润肿瘤的深度。
通过流式细胞术和组织切片免疫细胞染色来量化FGK45.5单独治疗组、低剂量FGK45.5与PPARδ抑制剂联合治疗组和对照组肿瘤中的免疫效应细胞。
结果如图3所示，虽然，与FGK45.5单独治疗组相比，联合治疗组肿瘤内CD8+T细胞占CD45+细胞的比例仅轻微增加，没有表现出统计学意义上的差别，但与对照组相比联合治疗组肿瘤内CD8+细胞毒性T细胞占CD45+细胞的比例显著增加。FGK45.5联合PPARδ抑制剂治疗组肿瘤CD45+淋巴细胞中CD8+T细胞的比例提高到25％左右，单独使用FGK45.5治疗组约为15％，而对照组仅为10％。相比之下，CD4+T细胞、B细胞和髓系来源的抑制细胞(MDSC细胞)占CD45+细胞的比例在各处理组之间并没有明显区别(图3a)。特别令人感兴趣的是，对肿瘤的免疫组化染色发现单独使用FGK45.5的治疗组肿瘤中CD8+T细胞主要在外围，但在FGK45.5与PPARδ抑制剂联合治疗组肿瘤中CD8+T细胞浸润到肿瘤更深的区域(图3b)。
实施例4 FGK45.5引起引流淋巴结中B淋巴细胞增加。
抗原对的T细胞启动作用发生在淋巴结，不同处理方法引起荷瘤小鼠淋巴结的细胞变化应比其它部位更为明显。接下来我们研究了不同处理组荷瘤小鼠引流淋巴结淋巴细胞的亚群和表型变化。
采用实施例1中的C57BL/6B16荷瘤小鼠模型(小鼠皮下接种7×105B16细胞，肿瘤细胞接种后约8天，肿瘤可触及时的小鼠)，设置低剂量FGK45.5治疗组、低剂量FGK45.5联合PPARδ抑制剂治疗组、PPARδ抑制剂单独治疗组和同型对照Rat IgG治疗组，采用与实施例2中图2a一致的治疗方案。在GSK3787最后一次注射后24小时(即最后一次FGK45.5注射后72小时)处死各组小鼠，取各组小鼠引流淋巴结细胞进行流式细胞仪检测和细胞计数。
结果如图4所示，在引流淋巴结中，低剂量FGK45.5联合PPARδ抑制剂组与单独应用FGK45.5组两组之间CD45+细胞的绝对数量基本一致，均明显高于PPARδ抑制剂组和Rat IgG对照组，PPARδ抑制剂的应用并没有改变引流淋巴结中CD45+细胞的绝对数(图4a)。其中CD19+细胞数在FGK45.5应用组显著高于Rat IgG对照组，低剂量FGK45.5与PPARδ抑制剂联合组CD19+细胞数略低于FGK45.5组，但是CD19细胞占CD45+细胞的比例在低剂量FGK45.5与PPARδ抑制剂联合组明显低于FGK45.5组。CD4+T与CD8+T细胞的细胞数和占CD45+细胞的比例在单独FGK45.5应用组、PPARδ抑制剂组和Rat IgG对照组是一致的，但是在低剂量FGK45.5与PPARδ抑制剂联合组CD4+T与CD8+T细胞的细胞数和占CD45+细胞的比例均明显高于单独应用FGK45.5组。CD11c+细胞的绝对数与比例在FGK45.5与PPARδ抑制剂联合组与FGK45.5组基本一致，两组均显著高于PPARδ抑制剂组和Rat IgG对照组，PPARδ抑制剂组和Rat IgG对照组的CD11c+细胞的绝对数与比例基本一致(图4b)。CD4/CD19细胞的比例在FGK45.5组、PPARδ抑制剂组和Rat IgG基本一致，但是在FGK45.5与PPARδ抑制剂联合组明显升高(图4c)，CD8/CD19在四个实验组的情况类似于CD4/CD19细胞在四个实验组的情况(图4d)。
考虑到M2巨噬细胞是肿瘤微环境中一个重要的抑制因子，根据报道PPARγ或PPARδ抑制剂有利于巨噬细胞从M2极化为M1，最初我们假设PPARγ或PPARδ抑制剂通过促进TAM从M2极化为M1可以增强抗CD40激动性抗体的治疗效果。但结果发现FGK45.5与PPARδ抑制剂联合治疗可显著降低肿瘤生长速度，而FGK45.5与PPARγ抑制剂联合治疗未见抗肿瘤作用。这些结果表明PPARδ抑制剂可能不是通过驱动TAM从M2极化到M1而增强小剂量抗CD40激动性抗体的抗肿瘤作用，而可能是通过其他机制。而且从上面结果来看，PPARδ抑制剂单独应用对CD4 T、CD8 T、CD19+B和CD11c+细胞的数量几乎没有影响，FGK45.5单独就可以引起淋巴结中CD19+B和CD11c+细胞的增多。PPARδ抑制剂可抑制引流淋巴结中FGK45.5引起的CD19+B细胞的数量与比例增加，而对FGK45.5引起的CD11c细胞数量和比例增加并没有影响。
上述结果说明PPARδ抑制剂促进低剂量FGK45.5的抗肿瘤作用很可能与其对B细胞的作用有关。
实施例5 PPARδ抑制剂减弱B细胞的免疫抑制作用从而增强FGK45.5的免疫治疗效果。
接下来，我们将重点放在PPARδ抑制剂是否通过影响B细胞来增强免疫治疗的作用上。首先，我们体外检测不同处理的荷瘤小鼠引流淋巴结中的B细胞是否具有抑制活化T细胞增殖的能力。纯化的正常小鼠CD4+T细胞在体外用2.5μM浓度的CFSE标记。将CFSE标记细胞重新悬浮于完全RPMI 1640培养基中至1×106/ml，并加入在4℃下用10μg/ml抗CD3ε抗体过夜包被的96孔平底板中。将从引流淋巴结纯化的B细胞与上述T细胞(1:1)在含有1μg/ml抗CD28单抗的上述96孔平底板中共培养72小时，并进行流式细胞术分析。CFSE标记T细胞的细胞增殖率采用公式：(1-实验组T细胞CFSE的MFI值/对照组无B细胞T细胞CFSE的MFI值)×100％计算。
结果发现来源于未经处理组荷瘤小鼠引流淋巴结的B细胞对CD4 T细胞具有抑制效应，经PPARδ抑制剂处理后荷瘤小鼠引流淋巴结B细胞的抑制作用减弱，FGK45.5处理不能降低B细胞的抑制作用(图5a)。这些结果告诉我们PPARδ抑制剂可能是通过减弱B细胞的免疫抑制作用从而增强FGK45.5的免疫治疗效果的。
为了检验这一假设，接下来我们通过抗体清除B16荷瘤小鼠的B细胞来进一步评价在FGK45.5与PPARδ抑制剂联合方案中PPARδ抑制剂的作用：
对部分B16荷瘤小鼠，先用抗CD19抗体清除B细胞，再分别用Rat IgG或FGK45.5或FGK45.5联合PPARδ抑制剂(GSK3787)治疗，观察肿瘤生长情况；分别用Rat IgG、FGK45.5或FGK45.5联合PPARδ抑制剂治疗作为对照。以上各组中Rat IgG、FGK45.5和PPARδ抑制剂(GSK3787)的使用剂量和使用方案均按与实施例2中图2a一致的方案进行。
CD19+B细胞清除实验：在B16细胞接种后第6、7和15天，腹腔注射荷瘤小鼠250μg抗CD19抗体(克隆1d3)，经FACS检测B细胞的清除率应在90％以上。实验结果发现：单纯清除B细胞组与对照IgG治疗组肿瘤生长情况相似，说明单独清除B细胞对B16肿瘤无治疗作用，而清除B细胞可显著提高FGK45.5对B16肿瘤的治疗效果。更重要的是，清除B细胞联合FGK45.5与FGK45.5联合PPARδ组对B16肿瘤的治疗效果基本一致。更值得注意的是，清除B细胞条件下，FGK45.5与FGK45.5联合PPARδ抑制剂组对B16肿瘤的治疗效果基本一致，PPARδ抑制剂失去了增强FGK45.5抗肿瘤效果的作用(图5b)。
这些结果说明，在B16肿瘤模型中，B细胞是FGK45.5治疗的免疫抑制因素，PPARδ抑制剂通过抑制B细胞的免疫抑制作用增强了低剂量FGK45.5的抗肿瘤作用。
实施例6 PPARδ抑制剂联合抗PD-1抗体对B16荷瘤小鼠的治疗作用
从以上结果，我们预测在B16荷瘤小鼠模型中清除B细胞或PPARδ抑制剂的使用也会增强其他免疫治疗药物的效果。
为了验证这种可能性，我们检测了PPARδ抑制剂或清除B细胞联合抗PD-1抗体对B16荷瘤小鼠的治疗作用。
同一荷瘤小鼠分别用抗PD-1抗体、清除B细胞联合抗PD-1抗体、抗PD-1抗体联合PPARδ抑制剂(于B16细胞注射第7～16天按附图2a中标示的剂量(300nmol)腹腔注射GSK3787，每日1次。)治疗，以清除B细胞(如实施例5记载“CD19+B细胞清除实验”)和对照IgG处理组(同型对照大鼠IgG注射方案同实施例1)为对照，共5个平行组(n＝8/组)。
抗PD-1抗体的使用方法为：从肿瘤细胞接种小鼠后第8天开始，腹腔注射荷瘤小鼠抗PD-1抗体(克隆RMP1-14)，每次200μg，每4天1次，共注射4次。
我们发现单用抗PD-1抗体对B16肿瘤有适中的治疗作用(反应率为4/8)，但清除B细胞或应用PPARδ抑制剂可进一步提高抗PD-1抗体治疗B16肿瘤的效果(反应率均为7/8)(图6)。
实施例7 PPARδ抑制剂降低CD19+CD24hiIgDlo/-B细胞的增殖。
基于以上结果，我们推测，荷瘤或FGK45.5治疗引起引流淋巴结和肿瘤内B细胞的某些改变，从而导致引流淋巴结和肿瘤内B细胞对免疫治疗的抑制作用。
为了验证这一假设，我们采用实施例4中的实验方案，各组在GSK3787最后一次注射后24小时(即最后一次FGK45.5注射后72小时)处死小鼠，对从荷瘤小鼠淋巴结分离的B细胞进行了各种表面标志分析，以期确定具有免疫抑制功能的B细胞亚群的表面标志及不同处理对具有抑制性功能的B细胞亚群的影响。
根据已知的关键发育表型及调节性B细胞的表面标志，如CD24、CD38、CD138或IgD等，我们发现不同处理组中CD19+CD24hiIgDlo/-B细胞的群体发生变化：
在最后一次GSK3787注射完成后的第24小时取不同处理组小鼠的肿瘤引流淋巴结，以天然未荷瘤小鼠的同部位淋巴结作为对照，将上述各淋巴结碾磨成单细胞悬液，对不同淋巴结的细胞经多种荧光标记抗体染色后做流式细胞术分析。
结果显示，B细胞群中CD19+CD24hiIgDlo/-B细胞在天然小鼠中的比例最少，荷瘤小鼠引流淋巴结中CD19+CD24hiIgDlo/-B细胞亚群的比例明显升高，FGK治疗组这群细胞的比例有进一步升高的趋势，而PPARδ抑制剂单独治疗组这群B细胞的比例明显减少，FGK和PPARδ抑制剂联合治疗组这群细胞的比例与FGK治疗组相比明显减少(图7a,b)；并且，与CD19+CD24loIgDhi B细胞群相比，CD19+CD24hiIgDlo/-B细胞表达更高的PPARδ(图7c)；肿瘤因素可以促进CD19+CD24hiIgDlo/-B细胞PPARδ的表达，但FGK45.5刺激并未导致CD19+CD24hiIgDlo/-B细胞PPARδ的表达发生明显变化(图7d)。
并且流式细胞术检测发现肿瘤因素和FGK均可以促进CD19+CD24hiIgDlo/-B细胞Ki67的表达，而PPARδ抑制剂可以降低这两种因素引起的CD19+CD24hiIgDlo/-B细胞Ki67的表达增加(图7e,f)，但CD19+CD24loIgDhi B细胞群的增殖并不受各种处理因素的影响(图7g)。
实施例8 PPARδ抑制剂降低CD19+CD24hiIgDlo/-B细胞的抑制功能。
为了评估CD19+CD24hiIgDlo/-B细胞的功能调节特性，我们采用实施例4中的实验方案，各组在GSK3787最后一次注射后24小时(即最后一次FGK45.5注射后72小时)处死小鼠，用流式细胞术从不同处理的荷瘤小鼠引流淋巴结细胞中分离出CD19+CD24hiIgDlo/-B细胞和CD19+CD24loIgDhi B细胞群，纯化的正常小鼠CD4+T细胞在体外用2.5μM浓度的CFSE标记。将CFSE标记细胞重新悬浮于完全RPMI 1640培养基中至1×106/ml，并加入在4℃下用10μg/ml抗CD3ε抗体过夜包被的96孔平底板中。将从引流淋巴结纯化的B细胞与上述T细胞(1:1)在含有1μg/ml抗CD28单抗的上述96孔平底板中共培养72小时，并进行流式细胞术分析。CFSE标记T细胞的细胞增殖率采用公式：(1-实验组T细胞CFSE的MFI值/对照组无B细胞T细胞CFSE的MFI值)×100％计算。
当CD4+T细胞与CD19+CD24hiIgDlo/-B细胞一起培养时，活化T细胞的增殖受到抑制，肿瘤因素可以增加小鼠引流淋巴结CD19+CD24hiIgDlo/-B细胞的抑制功能，FGK对荷瘤小鼠引流淋巴结CD19+CD24hiIgDlo/-B细胞的抑制功能并没有明显影响，而GSK可以降低荷瘤小鼠引流淋巴结CD19+CD24hiIgDlo/-B细胞的抑制功能(图8a)。而在T细胞与CD19+CD24loIgDhi B细胞群的共培养体系中，CD19+CD24loIgDhi B细胞群对活化T细胞增殖是促进而不是抑制作用(图8b)。
综合以上结果，我们发现：CD19+CD24hiIgDlo/-B细胞表达更高的PPARδ,具有免疫抑制功能；PPARδ抑制剂主要通过降低肿瘤和FGK45.5引起的CD19+CD24hiIgDlo/-B细胞的增殖、降低肿瘤引起的CD19+CD24hiIgDlo/-B细胞抑制功能增加，从而在动物整体水平上降低CD19+CD24hiIgDlo/-B细胞的免疫抑制效应、促进免疫刺激抗体或免疫检查点抗体对肿瘤的免疫治疗作用。
需要注意的是，上述具体实施例是示例性的，本领域技术人员可以在本发明公开内容的启发下想出各种解决方案，而这些解决方案也都属于本发明的公开范围并落入本发明的保护范围之内。本领域技术人员应该明白，本发明说明书及其附图均为说明性而并非构成对权利要求的限制。本发明的保护范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.PPARδ抑制剂联合免疫治疗药物在抗肿瘤药物中的制药应用，其中，所述肿瘤优选为黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、食管癌、大肠癌、结肠癌、淋巴瘤、脑瘤、肉瘤、子宫颈癌、前列腺癌、膀胱癌、骨肉瘤、头颈癌、肾细胞癌或胃癌。
2.如权利要求1所述的制药应用，其特征在于，所述免疫治疗药物为免疫激动剂或免疫检查点抑制剂；
优选所述免疫激动剂为针对OX40、4-1BB(CD137)、CD27、GITR、CD28和ICOS等共刺激分子的激动剂；
优选所述免疫激动剂为CD40激动剂；
优选所述免疫检查点抑制剂选自PD-1抑制剂、PDL1抑制剂、TIM3抑制剂、LAG3抑制剂、CD47抑制剂；优选免疫检查点抑制剂选自抗PD-1抗体、抗PDL1抗体、抗TIM3抗体、抗LAG3抗体、抗CD47抗体和抗CTLA-4抗体；
优选免疫检查点抑制剂为抗PD-1抗体。
3.如权利要求2所述的制药应用，其特征在于，所述CD40激动剂选自抗CD40激动性抗体、CD40L蛋白、CD40L蛋白的表达载体，或其片段、衍生物、多聚体；
优选所述CD40L蛋白为重组CD40L蛋白；
优选CD40激动剂为抗CD40激动性抗体。
4.如前述权利要求之一所述的制药应用，其特征在于，所述PPARδ抑制剂是能够抑制PPARδ的化合物、或者能够抑制PPARδmRNA作用的核酸分子、或者能靶向分解PPARδ的分子；
优选所述核酸分子为siRNA或者shRNA；
优选所述PPARδ抑制剂是GSK3787。
5.一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于：包含分别制剂后组合包装的PPARδ抑制剂和免疫治疗药物，或者PPARδ抑制剂和免疫治疗药物混合后制成的制剂；
优选所述肿瘤为黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、食管癌、大肠癌、结肠癌、淋巴瘤、脑瘤、肉瘤、子宫颈癌、前列腺癌、膀胱癌、骨肉瘤、头颈癌、肾细胞癌或胃癌；
优选所述肿瘤为黑色素瘤。
6.如权利要求5所述的抗肿瘤药物组合物，其特征在于：所述PPARδ抑制剂是能够抑制PPARδ的化合物、或者能够抑制PPARδmRNA作用的核酸分子、或者能靶向分解PPARδ的分子；
优选所述核酸分子为siRNA或者shRNA；优选所述PPARδ抑制剂是GSK3787。
7.如权利要求5或6所述的抗肿瘤药物组合物，其特征在于：所述免疫治疗药物为免疫激动剂或免疫检查点抑制剂；
优选所述免疫激动剂为针对OX40、4-1BB(CD137)、CD27、GITR、CD28和ICOS等共刺激分子的激动剂；
优选所述免疫激动剂为CD40激动剂；
优选所述免疫检查点抑制剂选自PD-1抑制剂、PDL1抑制剂、TIM3抑制剂、LAG3抑制剂、CD47抑制剂；优选免疫检查点抑制剂选自抗PD-1抗体、抗PDL1抗体、抗TIM3抗体、抗LAG3抗体、抗CD47抗体和抗CTLA-4抗体。
8.如权利要求5所述的抗肿瘤药物组合物，其特征在于：还包含可接受的药用载体，制成各种药学上可接受的制剂；
优选所述制剂为注射剂、靶向制剂或纳米制剂。
9.PPARδ抑制剂联合免疫治疗药物在治疗肿瘤中的应用，其特征在于，向患者施用低剂量免疫治疗药物疗程期间也施用PPARδ抑制剂以增强免疫治疗效果、减少免疫治疗药物的副作用或避免增加免疫治疗药物剂量；
所述免疫治疗药物为免疫激动剂或免疫检查点抑制剂；
所述PPARδ抑制剂是能够抑制PPARδ的化合物、或者能够抑制PPARδmRNA作用的核酸分子、或者能靶向分解PPARδ的分子；
优选所述核酸分子为siRNA或者shRNA；优选所述PPARδ抑制剂是GSK3787。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：
所述免疫激动剂为针对OX40、4-1BB(CD137)、CD27、GITR、CD28和ICOS等共刺激分子的激动剂；
优选所述免疫激动剂为CD40激动剂；
所述免疫检查点抑制剂选自PD-1抑制剂、PDL1抑制剂、TIM3抑制剂、LAG3抑制剂、CD47抑制剂；优选免疫检查点抑制剂选自抗PD-1抗体、抗PDL1抗体、抗TIM3抗体、抗LAG3抗体、抗CD47抗体和抗CTLA-4抗体；
优选免疫检查点抑制剂为抗PD-1抗体。
CN202110288214.3A 2021-02-08 2021-03-17 PPARδ抑制剂联合免疫治疗药物在制备抗肿瘤药物中的应用 Pending CN112972688A (zh)

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