CN110742843B - 参灵草抗衰中药提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种参灵草抗衰中药提取物的制备方法，包括如下步骤：(1)、将包括如下重量份的原料药粉碎：人参40～60份、灵芝30～50份、冬虫夏草5～10份，熟地黄20～30份、茯苓20～30份、黄精20～30份、山药15～20份、山茱萸15～20份，然后混合均匀并加入适量溶剂浸泡得到浸泡液；(2)、对浸泡液进行低温超声提取、离心分离、微孔滤膜过滤、反渗透膜加压浓缩，得到精制提取液；(3)、将精制提取液干燥成粉末；或往精制提取液中添加适量1,3‑丙二醇、丁二醇或甘油。还提供了参灵草抗衰中药提取物、应用及化妆品。本发明的参灵草抗衰中药提取物，在抗衰老抗黑色素方面表现出显著的协同增效作用，同时具有促进细胞增殖，改善肤色、预防色斑的效果。

Description

参灵草抗衰中药提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于抗衰老化妆品技术领域，涉及一种参灵草抗衰中药提取物及其制备方法，在化妆品中的应用。

背景技术

随着年龄的增长，皮肤也会自然地衰老。现代科学研究证明，皮肤衰老是一个非常复杂的过程，受到多种因素的影响，例如自由基导致皮肤衰老。自由基是人体组织中许多生化反应的中间代谢产物，人体内的自由基总是处于不断产生和不断消除的动态平衡中，体内自由基过多可降低胶原蛋白的合成，促进胶原蛋白的降解，使皮肤弹性纤维发生紊乱，皮肤弹性降低，产生皱纹。皮肤衰老还同时伴随有多种皮肤症状，例如，皮肤肤色不均匀，肤色暗沉；皮肤黑色素沉积，色斑增多；皮肤松弛，毛孔粗大等。

为了保持皮肤年轻状态，抗皮肤衰老的化妆品深受开发者的重视和消费者的喜爱。人们选择使用含抗黑色素沉积的物质或含抗衰老活性物质的化妆品来延缓衰老。生物总黄酮，总多酚和总糖等活性物质均具有清除自由基，抗氧化的功能，因此具有抗衰老的功效，是有效的含抗衰老活性物质。同时总黄酮还可以扩张毛细血管、疏通微循环，有效的保护人体的造血系统；可以增强人体的免疫力，进一步协助抗衰老的作用。总多酚还能与VC、VE等种抗氧剂协同作用，还可预防紫外线破坏皮肤胶原蛋白的合成作用，保持皮肤弹性。现有技术中抗衰老的组分主要有对苯二酚(氢醌)、L-抗坏血酸(维生素C)、曲酸、超氧化物歧化酶(SOD)等化合物；抗黑色素沉积的组分主要有熊果苷。但这些活性物存在着诸多缺陷，如氢醌的刺激性非常大，维生素C和SOD非常不稳定，曲酸具有一定的刺激性和易变色性问题，因此，这些活性物质用于制备抗衰老和抗黑色素沉积的化妆品时，会带来上述副作用，安全性和稳定性欠佳，最终影响皮肤状态。

因此，开发抗衰老和抗黑色素沉积效果明显，且安全性、稳定性良好的抗衰老组分，以期制备性价比良好的抗衰老、抗黑色素沉积化妆品，已成为当前医药和化妆品行业的主要研究方向，具有非常好的发展前景。其中，中药在化妆品中的应用是很热门的研究方向之一。中国作为中药大国，中药在化妆品中的应用已经得到了飞速的发展。目前，将具有抗衰老等功效的中药提取物应用于化妆品可达到皮肤治疗和抗衰老的双重功效，而且具有功能多样、适用面广、安全等特性，因而日益受到重视。然而，现有技术中虽然有很多中药都或多或少被人们宣称可提高人体免疫力，或抗自由基，从而具有一定的抗衰老功效，但这些中药是否能够提取出足够量的有效抗衰老成分，使之添加在化妆品中能够产生良好的抗衰老效果，是不明确的。同时，现有的化妆品中加入的中药提取物大多为单味中药的提取物，抗衰老效果欠佳，且只能在一定程度上解决单一的皮肤问题。如何复配多组分的中药复方，通过何种提取方法能够最有效地提取出中药复方中的有效抗衰老抗黑色素活性成分，还有待深入研究。如果能在现有的中药提取物的基础上提高抗衰老和抗黑色素功效，即便是提高10％，则能够带来的实际应用价值和经济效益都是非常显著的。

因此，有必要继续开发具有抗衰老抗黑素功效的中药提取物，以克服现有技术中的上述技术缺陷。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种参灵草抗衰中药提取物的制备方法，以克服现有技术中的上述技术问题。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

参灵草抗衰中药提取物的制备方法，包括如下步骤：

(1)、将包括如下重量份的原料药粉碎：人参20～30份、灵芝20～40份、冬虫夏草5～10份，熟地黄10～20份、茯苓5～15份、黄精5～10份、山药5～15份、山茱萸5～15份，然后混合均匀并加入适量溶剂浸泡，得到浸泡液；

(2)、对步骤(1)的浸泡液进行低温超声提取，得到的超声提取液经离心分离、微孔滤膜过滤、反渗透膜加压浓缩，得到精制提取液；

(3)、将步骤(2)的精制提取液干燥成粉末，得到参灵草抗衰中药提取物；或往步骤(2)的精制提取液中添加适量植物来源的1,3-丙二醇、1,3丁二醇或甘油，得到参灵草抗衰中药提取物。

本领域技术人员很容易理解，所述植物来源的1,3-丙二醇、1,3丁二醇或甘油作为天然防腐剂及保湿剂使用，通常所述1,3-丙二醇、1,3丁二醇或甘油与所述精制提取液的质量比为1:(1～3)。优选地，本发明中，所述1,3-丙二醇、1,3丁二醇或甘油与所述精制提取液的质量比为1:(1～2)。

优选地，所述步骤(1)中，所述重量份的原料药包括：人参20～25份、灵芝30～34份、冬虫夏草8～10份，熟地黄10～12份、茯苓5～7份、黄精6～8份、山药5～8份、山茱萸5～7份。

进一步优选地，所述步骤(1)中，所述重量份的原料药包括：人参23份、灵芝34份、冬虫夏草8份，熟地黄12份、茯苓7份、黄精6份、山药5份、山茱萸5份。

在上述配方条件下，获得的参灵草抗衰中药提取物具有最优抗衰老效果。

优选地，所述步骤(1)中，所述溶剂为水或乙醇-水溶液；所述原料药与所述溶剂的质量比为1:(10～50)，浸泡1～3h。

优选地，所述低温超声提取步骤中，超声温度：25℃～50℃，超声频率为20～50kHz，单次超声时间：15min～30min；超声次数：3次～5次。

优选地，所述微孔滤膜过滤步骤采用0.1～1μm的微孔滤膜进行过滤，得到滤液L；所述反渗透膜加压浓缩步骤将所述滤液L通过反渗透膜在0.5～3MPa下浓缩至滤液L体积的20～50％。

优选地，所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分比为20～80％。

本发明的第二个目的是提供上述参灵草抗衰中药提取物的制备方法得到的参灵草提取物。

本发明的第三个目的是提供上述参灵草抗衰中药提取物的应用，用于制备抗衰老化妆品。

优选地，所述抗衰老化妆品由所述参灵草抗衰中药提取物及辅料组成，所述参灵草提取物的含量为1～40wt％，所述辅料的含量为60～99wt％。

根据本发明，本领域技术人员很容易理解，本发明所述的化妆品，不限制地可以为化妆水、面膜、精华、乳液、膏、霜等。所述霜包括面霜和眼霜。

本领域技术人员熟知，自然界的很多中药均或多或少具有一定的抗衰老、抗氧化作用。但由于中药种类众多，且各种中药的抗衰老作用程度不同，因此，想要制备高效的抗衰老提取物，仅通过简单的中药组合是难以实现的。

本发明的创新点在于，基于中药理论支持，以人参作为抗衰老的君药，起到主要的抗衰老功效，以灵芝、冬虫夏草、黄精作为臣药，佐以熟地黄、茯苓、山药、山茱萸，组合成复方，诸药合用，在本发明特定的提取工艺条件下，提取得到的参灵草提取物产生了优异的协同抗衰老和抗皱功效，同时具有改善肤色和防斑的功效。

与现有技术相比，本发明具有如下有益技术效果：

(1)、本发明的参灵草抗衰中药提取物，基于中药中君臣辅佐的理论，通过人参、灵芝、冬虫夏草，熟地黄、茯苓、黄精、山药、山茱萸组合成复方制备的参灵草抗衰中药提取物中活性物的含量高，具有很强的酪氨酸酶抑制作用和DPPH抑制作用，因此具有抗黑色素和抗衰老的功效，在抗衰老和抗黑色素方面表现出显著的协同增效效果；同时能促进细胞的增殖分化，从根本上阻止和逆转皮肤衰老，使肌肤保持最佳年轻生理，产生抗衰老抗皱的作用，从而协同提高抗衰功效。

(2)、本发明的参灵草抗衰中药提取物制备的化妆品具有优异的抗衰老、抗黑色素沉积、抗皱功效，和改善肤色、防斑效果。

附图说明

图1为参灵草抗衰中药提取物的紫外分光光谱。其中：

a曲线表示室温存储后的参灵草抗衰中药提取物的紫外分光光谱：b曲线表示45℃存储后的参灵草抗衰中药提取物的紫外分光光谱：c曲线表示日光照射后的存储后的参灵草抗衰中药提取物的紫外分光光谱。

图2为不同试验样品浓度时的细胞存活率柱形图。

图3为使用2、4、6、8周的志愿者肌肤弹性随使用时间的柱形图。

图4为1名女性志愿者使用前和使用8周后的眼周照片，(左图为使用前，右图为使用后)。

图5为1名女性志愿者使用前和使用8周后的眼周照片，(左图为使用前，右图为使用后)。

图6为1名男性志愿者使用前和使用8周后的眼周照片，(左图为使用前，右图为使用后)。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

原料药预处理

原料药水洗三次去污，有效去除泥沙和灰尘等杂质。

取人参，润透，切薄片，干燥。

取灵芝，洗净，晾干或低温干燥。

取鲜地黄，徐徐烘焙，至内部变黑，约八成干，捏成团状，得到生地黄，照酒炖法(2015版《中华人民共和国药典》一部，附录IID)炖至酒吸尽，取出，晾晒至外皮黏液稍干时，切厚片或块，干燥，即得熟地黄。

取茯苓，浸泡、洗净，除去杂质，润后稍蒸，即时切厚片晒干。取切好的茯苓置盘内喷水少许，微润加朱砂细粉，撒布均匀，并随时翻动，至外面挂匀朱砂为度，取出晾干即得。

取黄精，除去杂质，洗净，干燥，加黄酒拌匀，密闭，炖至酒被吸进，色泽黑润时取出，稍凉，切厚片，干燥。

取山药，除去杂质，大小分开，洗净，润透，切厚片，干燥，筛去碎屑。

取山茱萸，除去杂质及残留核，洗净，晒干。

上述原料也可购买药房市售产品。

参灵草抗衰中药提取物配方

参灵草抗衰中药提取物配方如表1所示。

表1参灵草抗衰中药提取物配方

实施例1、参灵草抗衰中药提取物的制备

本实施例采用配方1制备参灵草抗衰中药提取物，包括如下步骤：

(1)、将配方量的各原料药粉碎至颗粒，过200～400目筛后，搅拌混合均匀得到混合颗粒，然后加入质量比为1:10的乙醇水溶液(乙醇的体积百分比为50％)，浸泡2小时，得到浸泡液；

(2)、对步骤(1)的浸泡液进行超声提取，超声频率为30kHz，超声温度：30℃，超声时间为30min，超声次数：3次；超声提取液经离心处理(离心速度3000rpm，离心时间20分钟)，取上层清液，即为超声提取液；

(3)、步骤(2)的超声提取液用0.5μm的微孔滤膜过滤，得到的滤液L经反渗透膜在1.5MPa压力下浓缩至滤液L体积的50％，在40℃蒸发去除乙醇，得到精制提取液；

(4)、往步骤(3)的精制提取液中添加植物来源的1,3-丙二醇，所述精制提取液与所述1,3-丙二醇的质量比1:2，所得的中药提取液即为无防腐剂添加纯植物的参灵草抗衰中药提取物。

也可将步骤(3)的精制提取液干燥，得到粉末状的参灵草抗衰中药提取物，存储。

实施例2、参灵草抗衰中药提取物的制备

本实施例采用配方2来制备参灵草抗衰中药提取物，包括如下步骤：

(1)、将配方量的各原料药粉碎至颗粒，过200～400目筛后，搅拌混合均匀得到混合颗粒，然后加入质量比为1:20的去离子水，浸泡3小时，得到浸泡液；

(2)、对步骤(1)的浸泡液进行超声提取，控制超声频率为50kHz，超声温度：45℃，超声时间为30min，超声次数：5次，超声提取液经离心处理(离心速度3000rpm，离心时间20分钟)取上层清液，即为超声提取液；

(3)、步骤(2)的超声提取液用1μm的微孔滤膜过滤，得到的滤液L经反渗透膜在2MPa压力下浓缩至滤液L体积的20％，得到精制提取液；

(4)、往步骤(3)的精制提取液中添加植物来源1,3-丁二醇，所述精制提取液与所述1,3-丁二醇的质量比1:1，所得的中药提取液即为无防腐剂添加纯植物的参灵草抗衰中药提取物。

也可将步骤(3)的精制提取液干燥，得到粉末状的参灵草抗衰中药提取物，存储。

实施例3、参灵草抗衰中药提取物的制备

本实施例采用配方3来制备参灵草抗衰中药提取物，包括如下步骤：

(1)、将配方量的各原料药粉碎至颗粒，过200～400目筛后，搅拌混合均匀得到混合颗粒，然后加入质量比为1:20的乙醇水溶液(乙醇的体积百分比为70％)，浸泡1小时，得到浸泡液；

(2)、对步骤(1)的浸泡液进行超声提取，超声频率为40kHz，超声温度：25℃，超声时间为15min，超声次数：3次，超声提取液经离心处理(离心速度3000rpm，离心时间20分钟)，取上层清液，即为超声提取液；

(3)、步骤(2)的超声提取液用0.5μm的微孔滤膜过滤，得到的滤液L经反渗透膜在1.5MPa压力下浓缩至滤液L体积的50％，在48℃蒸发去除乙醇，得到精制提取液；

(4)、往步骤(3)的精制提取液中添加植物来源1,3-丙二醇，所述精制提取液与所述1,3-丙二醇的质量比1:1.5，所得的中药提取液即为无防腐剂添加纯植物的参灵草抗衰中药提取物。

也可将步骤(3)的精制提取液干燥，得到粉末状的参灵草抗衰中药提取物，存储。

以上实施例1-3最终制备得到的中药提取液的质量相当，约为750～800g。

对比例1、单组份提取物的制备

采用配方1中的人参100g进行提取，加入质量比为1:10的乙醇水溶液(乙醇的体积百分比为50％)进行提取，其他制备方法同实施例1，得到的精制提取液添加植物来源的1,3-丙二醇，得到人参提取液。或将得到的精制提取液直接干燥得到人参提取物。

采用配方1中的灵芝100g进行提取，加入质量比为1:10的乙醇水溶液(乙醇的体积百分比为50％)进行提取，其他制备方法同实施例1，得到的精制提取液添加植物来源的1,3-丙二醇，得到灵芝提取液。或将得到的精制提取液直接干燥得到灵芝提取物。

采用配方1中的冬虫夏草100g进行提取，加入质量比为1:10的乙醇水溶液(乙醇的体积百分比为50％)进行提取，其他制备方法同实施例1，得到的精制提取液添加植物来源的1,3-丙二醇，得到冬虫夏草提取液。或将得到的精制提取液直接干燥得到冬虫夏草提取物。

采用配方1中的熟地黄100g进行提取，加入质量比为1:10的乙醇水溶液(乙醇的体积百分比为50％)进行提取，其他制备方法同实施例1，得到的精制提取液添加植物来源1,3-丙二醇，得到熟地黄提取液。或将得到的精制提取液直接干燥得到熟地黄提取物。

采用配方1中的茯苓100g进行提取，加入质量比为1:10的乙醇水溶液(乙醇的体积百分比为50％)进行提取，其他制备方法同实施例1，得到的精制提取液添加植物来源的1,3-丙二醇，得到茯苓提取液。或将得到的精制提取液直接干燥得到茯苓提取物。

采用配方1中的黄精100g进行提取，加入质量比为1:10的乙醇水溶液(乙醇的体积百分比为50％)进行提取，其他制备方法同实施例1，得到的精制提取液添加植物来源的1,3-丙二醇，得到黄精提取液。或将得到的精制提取液直接干燥得到黄精提取物。

采用配方1中的山药100g进行提取，加入质量比为1:10的乙醇水溶液(乙醇的体积百分比为50％)进行提取，其他制备方法同实施例1，得到的精制提取液添加植物来源的1,3-丙二醇，得到山药提取液。或将得到的精制提取液直接干燥得到山药提取物。

采用配方1中的山茱萸100g进行提取，加入质量比为1:10的乙醇水溶液(乙醇的体积百分比为50％)进行提取，其他制备方法同实施例1，得到的精制提取液添加植物来源的1,3-丙二醇，得到山茱萸提取液。或将得到的精制提取液直接干燥得到山茱萸提取物。

对比例2、采用常规方法制备参灵草中药抗衰提取物

采用常规方法制备参灵草抗衰中药提取物，具体方法如下：

配方1的原料药粉碎混合后，加入质量比为1:40的去离子水，直接熬煮3个小时，过滤，滤液加入适量体积百分比为50％的乙醇水溶液进行醇沉，过滤，蒸发乙醇，得到精制提取液；往所述精制提取液中加入适量的1,3-丙二醇，所述精制提取液与所述1,3-丙二醇的质量比1:2，得到参灵草抗衰中药提取物；或，将所述精制提取液干燥，得到粉末状的参灵草抗衰中药提取物。

实施例4、中药提取物活性物检测

(一)、中药活性物-总黄酮含量的检测方法

根据中国药典第一部P30，参照药典山楂叶中总黄酮测定法进行总黄酮的检测。

(1)、总黄酮对照品溶液的制备。

精密称取在120℃干燥至恒重的对照品(芦丁)25mg，置50ml量瓶中，加乙醇适量，超声处理使溶解，放冷，加乙醇至刻度，摇匀。精密量取20ml，置50ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得总黄酮对照品溶液(每1ml中含无水芦丁0.2mg)。

(2)、标准曲线的制备。

精密量取步骤(1)制备的对照品溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml，分别置于25ml量瓶中，各加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加10wt％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液(4.3g氢氧化钠溶于100mL水中)10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟。以不加对照品的相应试剂为空白，采用紫外-可见分光光度法(参考附录ⅤA)，在500nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

(3)、总黄酮含量的测定法。

分别取等量的实施例1-3的中药提取物和对比例2的提取物，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷加热回流提取至提取液无色，弃去三氯甲烷液，药渣挥去三氯甲烷，加甲醇继续提取至无色(约4小时)，提取液蒸干，残渣加稀乙醇溶解，并转移至50ml量瓶中，加稀乙醇(529mL乙醇用水定容至1L)至刻度，摇匀，作为供试品储备液。

取供试品储备液，过滤，精密量取续滤液5ml，置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。精密量取2ml，置25ml量瓶中，加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加10wt％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液(4.3g氢氧化钠溶于100mL水中)10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，得到供试品溶液。采用紫外-可见分光光度法，在500nm的波长处测定供试品溶液的吸光度。

总黄酮量以无水芦丁计，将无水芦丁标品配置成不同浓度标液，测量其吸光值，绘标准曲线，将测得的样品溶液吸光值代入标曲的公式中，得出样品中的芦丁含量。

(二)、中药活性物-总多酚含量的检测方法

总多酚根据GB/T 8313-2008(第二法)进行检测。

(三)、中药活性物-总糖含量的检测方法

依据硫酸苯酚法检测样品中总糖含量。

(1)、标准曲线的制备。

精密称取葡萄糖标准溶液0.025g，用去离子水定容至500ml。分别吸取0ml，0.2ml，0.4ml，0.6ml，0.8ml，1.0ml，1.2ml，1.4ml，1.6ml，1.8ml于25ml比色管中，加水至2.0ml。精密加6wt％苯酚溶液1ml，摇匀，用直形移液管迅速垂直加浓硫酸5ml，摇匀，冷却30min。在490nm波长测定吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

(2)、样品的制备和检测。

称取样品0.025g，置于100ml容量瓶中(根据样品需要，部分不易溶解的样品可以用0.1mol/L的NaOH调节pH＝10)，超声30min，用0.45um尼龙滤头过滤，去掉初滤液，吸取0.2ml滤液至25ml比色管中，加水至2.0ml，精密加6％苯酚溶液1ml，摇匀，用直形移液管迅速垂直加浓硫酸5ml，摇匀，冷却30min，在490nm波长测定吸光度。

与标准曲线对比，计算总糖含量。

(四)、检测结果

活性组分含量检测结果如表2所示。

表2、活性组分含量

由表2的数据可知，实施例1-3提取得到的中药提取液中均含有较多的活性组分，明显高于对比例2采用现有常规方法提取的中药提取液的活性物含量，说明采用本发明的配方及特定的提取方法得到的参灵草抗衰中药提取物中活性物含量更高。

实施例5、抑制酪氨酸酶的作用的比较

(一)、抑制酪氨酸酶的作用

本实施例中，采用蘑菇酪氨酸酶与L-酪氨酸反应的方法测试酪氨酸酶活性。其中：蘑菇酪氨酸酶购买自索莱宝生物科技；L-酪氨酸购买自生工生物工程有限公司；普通96孔酶标板采购自Corning公司；阳性对照药物熊果苷粉末购买自阿拉丁试剂。

待测样本制备：分别取适量的实施例1制备的中药提取液用去离子水稀释8倍，16倍，32倍和64倍，得到经稀释的待测样本10-1、10-2、10-3、10-4，体积浓度分别为12.5％、6.25％、3.13％、1.56％。

磷酸盐缓冲液(PBS)：pH＝6.8；L-酪氨酸溶液：浓度为0.5mg/mL；蘑菇酪氨酸酶：浓度为600U/mL；熊果苷水溶液：浓度为5mg/mL。

对照组和试验组具体条件如下：

阴性对照组：取100μL PBS，加入40μL L-酪氨酸溶液，25μL蘑菇酪氨酸酶，补加PBS至200μL，37℃水浴30min后，测定475nm波长下的吸光度，计为A1。

空白对照组一：取100μL PBS，加入40μL L-酪氨酸溶液，补加PBS至200μL，37℃水浴30min后，测定475nm波长下的吸光度，计为A2。

待测试验组一至四：分别取100μL PBS，加入25μL蘑菇酪氨酸酶，分别加入35μL待测样本10-1、10-2、10-3、10-4，37℃水浴30min后，加入40μL L-酪氨酸溶液，然后立即开始计时，测定反应20min时475nm波长下的吸光度，计为A3-1、A3-2、A3-3、A3-4。

阳性对照组：取100μL PBS，25μL蘑菇酪氨酸酶，以及35μL熊果苷水溶液，37℃水浴30min后，加入40μL L-酪氨酸溶液，然后立即开始计时，测定反应20min时475nm波长下的吸光度，计为A3-5。

空白对照组二至六：待测试验组一至四，及阳性对照组中，不加25μL蘑菇酪氨酸酶，补加PBS至200μL，37℃水浴30min后，测定475nm波长下的吸光度，计为A4-1、A4-2、A4-3、A4-4、A4-5。

抑制率计算公式：抑制率(％)＝[(A1-A2)-(A3-A4)]/(A1-A2)×100％。

采用上述相同的方法，对比实施例2-3制备的中药提取液，对比例1制备的8组单组份中药提取液，及阳性对照药物熊果苷进行检测，并计算酪氨酸酶抑制率，结果如表3至表5所示。

表3不同浓度的实施例1待测样本、阳性对照组的酪氨酸酶抑制率

稀释浓度(％)	12.5	6.25	3.13	1.56	阳性对照组
						酪氨酸酶抑制率(％)	96	95	76	65	93

由表3的数据可知，实施例1制备的中药提取液在稀释16倍后，对蘑菇酪氨酸酶的抑制率达到95％，仍然大于常规用药浓度为5mg/mL的熊果苷的抑制率93％，说明本发明的参灵草抗衰中药提取物具有优异的酪氨酸酶抑制率，具有优异的抗黑色素沉积的作用。使用时，提高参灵草抗衰中药提取物的体积浓度至12.5％，提高的酪氨酸酶抑制率相对较小，因此，从经济上来说，使用稀释16倍的参灵草抗衰中药提取物即能够达到很好的抑制率，又能兼顾经济性。

表4、实施例1-3的中药提取液在稀释浓度为6.25％时的酪氨酸酶抑制率

由表4的数据可知，与阳性对照组比较，实施例1-3制备的中药提取液均具有良好的酪氨酸酶抑制率，说明在实施例1-3的配方含量和制备条件下，均能够制备得到酪氨酸酶抑制率高的参灵草抗衰中药提取物。同时，由表4的数据可知，稀释相同的倍数时，实施例1-3制备的中药提取液的酪氨酸酶抑制率相当，说明本发明制备的参灵草抗衰中药提取物具有相对稳定的含量和功效。且实施例1-3的中药提取液的酪氨酸酶抑制率明显比对比例2高，总体上提高约45.2％～53.2％，说明本发明的配方在本发明特定的提取工艺条件下得到的中药提取液的酪氨酸酶抑制率更高。

表5对比例1的8组单组份中药提取液的酪氨酸酶抑制率

由表3和表5的数据对比可知，等量的单组份提取物的酪氨酸酶抑制率均明显低于本发明的复配的中药提取液的酪氨酸酶抑制率，其中，实施例1-3的酪氨酸酶抑制率达到酪氨酸酶抑制率最高的人参组的1.5-1.58倍，即提高了50％～58％，说明本发明的配方采用中药理论指导，通过本发明的制备方法提取得到的参灵草抗衰中药提取物在蘑菇酪氨酸酶的抑制方面产生了显著的协同增效作用。

实施例6、清除DPPH自由基的作用

测试方法：DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)分析方法：依据DPPH自由基具有单电子，在含有自由基的化学反应中作为一种监测反应的物质，用以抗氧化成分的体外抗氧化性评价。本实施例中，DPPH、维生素C均采购于索莱宝生物科技。DPPH配制成浓度0.25mmol/L的DPPH水溶液，维生素C配制成25μg/mL的维生素C水溶液。

具体测试方法如下：

空白对照组一：100μL蒸馏水室温避光孵育30min，在517nm测量吸光度，计为B1。

阴性对照组：3.9ml DPPH水溶液，100μL蒸馏水，室温避光孵育30min，在517nm测量吸光度，计为B2。

待测试验组一至四：3.9ml DPPH水溶液，分别加入100μL实施例1的待测样本10-1、10-2、10-3和10-4，室温避光孵育30min，在517nm测量吸光度，分别计为B3-1、B3-2、B3-3和B3-4。

阳性对照组：3.9mlDPPH水溶液，100μL维生素C水溶液，室温避光孵育30min，在517nm测量吸光度，计为B3-5。

空白对照组二至六：待测试验组一至四，及阳性对照组中，不加DPPH水溶液，室温避光孵育30min，在517nm测量吸光度，计为B4-1、B4-2、B4-3、B4-4和B4-5。

抑制率计算公式：抑制率(％)＝[(B1-B 2)-(B3-B4)]/(B1-B2)×100％

采用上述相同的方法，对比实施例2-3制备的参灵草提取液，对比例1-8制备的提取液，和维生素C水溶液进行检测，并计算DPPH抑制率，结果如表6至表8所示。

表6不同浓度的实施例1待测样本、阳性对照组的DPPH抑制率

稀释浓度(％)	12.5	6.25	3.13	1.56	阳性对照组
						DPPH抑制率(％)	98	97	77	68	95

由表6的数据可知，实施例1制备的中药提取液在稀释16倍后，DPPH抑制率达到97％，仍然大于浓度为25μg/mL的维生素C水溶液的抑制率95％，说明本发明的参灵草抗衰中药提取物具有优异的抗自由基的作用，即具有优异的抗衰老功效。使用时，提高参灵草提取物的稀释浓度至12.5％，提高的DPPH抑制率相对较小，因此，从经济上来说，使用稀释16倍的参灵草抗衰中药提取物即能够达到很好的抑制率，又能兼顾经济性。

表7、实施例1-3的中药提取液在稀释浓度为6.25％时的DPPH抑制率

由表7的数据可知，与阳性对照组比较，实施例1-3制备的中药提取液均具有良好的DPPH抑制率，说明在实施例1-3的配方含量和制备条件下，均能够制备得到DPPH抑制率高的参灵草抗衰中药提取物。同时，由表7的数据可知，稀释相同的倍数时，实施例1-3制备的参灵草抗衰中药提取物的DPPH抑制率相当，说明本发明制备的参灵草抗衰中药提取液具有相对稳定的含量和功效。且实施例1-3中药提取液的DPPH抑制率明显比对比例2高，总体上提高约31.3％～44.8％，说明本发明的配方在本发明特定的提取工艺条件下得到的提取液的DPPH抑制率更高。

表8对比例1的8组单组份中药提取液的DPPH抑制率

由表7和表8的数据对比可知，等量的单组份提取物的DPPH抑制率均明显低于本发明复配的中药提取液的DPPH抑制率，其中，实施例1-3的DPPH抑制率为DPPH抑制率最高的人参组的DPPH抑制率的1.40～1.54倍，即提高了40～54％，说明本发明的配方采用中药理论指导，通过本发明的制备方法提取得到的参灵草抗衰中药提取物在DPPH的抑制方面产生了显著的协同增效作用。

实施例7、安全性测试

根据安全性试验方法，测试实施例1～3制备的中药提取液的安全性，斑贴试验皮肤不良反应分级标准如表9所示。

表9：斑贴试验皮肤不良反应分级标准

皮肤不良反应	分级
		无反应	0
淡红斑	1
		红斑、浸润、丘疹	2
红斑、水肿、丘疹、水疱	3
		红斑、水肿、大疱	4

结果显示，经48小时和72小时试验，测试的局部皮肤与未测试皮肤相比并未出现淡红斑敏，红肿等现象。实施例1～3制备的中药提取液的分级均为0级。说明本发明的参灵草抗衰中药提取物不会引皮肤过敏，安全性好。

实施例8、稳定性测试

根据稳定性测试方法，将实施例1～3的中药提取液分别储存于45℃，恒温箱保存条件、室温(25℃，阴凉通风)条件或(25℃，阳光直射)条件下2个月，用紫外分光光度仪测试光谱如图1所示，并检测其活性组分含量及清除DPPH自由基的能力。

结果表明：本发明的参灵草抗衰中药提取物具有良好的稳定性，45℃恒温保存2个月，颜色略变浅，活性成分基本没变化，依然保持较高的DPPH抑制率。无论是常温还是阳光直射，参灵草抗衰中药提取液的颜色不变，活性成分基本不变，说明本发明的参灵草抗衰中药提取物具有良好的稳定性。

实施例9、成纤维细胞模型测试

(一)主要试剂与仪器

人真皮成纤维细胞(HDF-a)购自美国ScienCell公司；培养基DMEM(用于培养HDF-a细胞)购自Gibco(Cat#10100147)；胎牛血清(FBS)、人Ⅰ型胶原蛋白(Col-I)ELISA试剂盒购自美国eBiosience公司；CCK-8采购自Dojindo。

(二)HDF-a细胞毒性的测定

试验样品配制：血清DMEM培养基配制的不同质量浓度中药提取液(配制成浓度12.5％、6.25％、3.13％、1.56％、0.78％)，备用。

空白对照组样品：DMEM培养基。

HDF-a人真皮成纤维细胞在含质量分数为10％FBS的DMEM培养基正常培养，细胞长到90％密度时，将其按照5×10⁴个/mL密度，接种于96孔培养板中，继续于培养箱中培养6h,待细胞完全贴壁后,加入100μL待测试验样品和对照组样品，每组设3个平行复孔，孵育24h。随后按照说明书加入CCK试剂孵育2h，在450nm处测量吸光度OD。

细胞存活率＝检测组的OD值/对照组的OD值×100％

不同试验样品浓度时的细胞存活率柱形图如图2所示。

由图2可以看出，当体系中参灵草抗衰中药提取液的稀释浓度不超过6.25％时，对细胞没有细胞毒性，反而具有一定的细胞增殖作用，说明本发明的参灵草抗衰中药提取液在稀释浓度不超过6.25％时能够有效促进细胞增殖。在稀释浓度为6.25％时，其细胞存活率最大，即具有最大的细胞增殖作用，细胞活力最大。

(三)参灵草抗衰中药提取物对HDF-a细胞分泌Col-I的影响

HDF-a人真皮成纤维细胞在含质量分数为10％FBS的DMEM培养基正常培养，细胞长到90％密度时，将其按照5×10⁴个/mL密度，接种于96孔培养板。每孔含6.25％血清DMEM培养基和对照组100μL，于37℃，5％CO₂培养箱中培养。24h后，3000r/min离心20min，取上清液用于Ⅰ型胶原蛋白(Col-I)的测试。

按照ELISA试剂盒说明书，依次与生物素标记抗体、HRP标记链霉亲和素、显色底物和终止液作用。以空白孔调零，在终止后15min内，在450nm波长处测量OD值。根据标准品的浓度及对应的OD值，计算出标准曲线的回归方程，再根据样本的OD值计算对应的Col-Ⅰ分泌量，最终浓度为实际测定的Col-Ⅰ分泌量乘以稀释倍数，结果如表10和表11所示。

表10实施例1-3、对比例2及空白对照组的Col-Ⅰ分泌量

由表10的数据可知，稀释浓度为6.25％时，实施例1-3及对比例2的中药提取液的Col-Ⅰ分泌量均远大于空白对照组的Col-Ⅰ分泌量，实施例1-3的Col-Ⅰ分泌量比空白对照组增加了31％～39％。

表11对比例1的8组单组份中药提取液的Col-Ⅰ分泌量

由表10和表11的数据对比可知，稀释浓度为6.25％时，实施例1-3的Col-Ⅰ分泌量均远大于等质量的单组分提取液的Col-Ⅰ分泌量，实施例1-3的Col-Ⅰ分泌量为Col-Ⅰ分泌量最高的冬虫夏草组的1.17-1.15倍，说明实施例1-3的8组分的复配能够有效提高最终提取液促进的Col-Ⅰ分泌，促进组织细胞的增殖，从而显著提高抗衰老效果。

本发明的参灵草抗衰中药提取物，不仅通过协同抑制酪氨酸酶和DDPH产生抗黑色素和抗衰的功效，还能够通过有效促进组织细胞的增殖，从而协同提高抗衰老效果。

实施例10：临床检验

(一)、制备测试使用的脸部护肤品

抗皱面霜配方：

实施例1的中药提取液10份；

油相：甘油硬脂酸柠檬酸酯2.5份、甘油辛酸酯0.5份、十六十八混合醇4份、棕仁脂1份、乳木果油1份、蜂蜡1.5份、甘油三(乙基己酸)酯7份、氢化聚异丁烯8份、聚二甲基硅氧烷2份、环聚二甲基硅氧烷3份、维生素E 0.5份；

水相：甘油5份、汉生胶0.1份、透明质酸0.1份、加水至100份；

防腐剂适量。

抗皱面霜的制备包括如下步骤：

(1)、将油相加热至75～80℃，混合均匀；

(2)、加水相加热至75～80℃，分散均匀透明；

(3)、将步骤(1)的油相加入到步骤(2)的水相中，均质5～10分钟，料体乳化均匀，得到乳化液；

方(4)、将步骤(3)的乳化液降温至45℃，加入配方量的实施例1的中药提取液，及适量防腐剂，搅拌均匀，即得抗皱面霜。

抗衰老精华素华配方：实施例1的中药提取液10份、透明质酸钠0.4份、甘油5份、1,3丙二醇3份、尿囊素0.1份、β-葡聚糖1份、甜菜碱2份、海藻糖2份，防腐剂适量。

抗衰老精华素华的制备方法包括如下步骤：

(1)、将除防腐剂和提取液外的其他组分混合，并加热至75～80℃，搅拌均匀透明；

(2)、降温至45℃，加入实施例1的中药提取液，及适量防腐剂，搅拌均匀，即得抗衰老精华素。

(二)、测试方法

选择志愿者15人，年龄在30岁以上，有一定的面部细纹及皮肤松弛现象。

目标人群早晚两次，使用抗衰老精华素和抗皱面霜按摩脸部至吸收后，连续使用8周。采用皮肤弹性测试仪MPA 580(CK公司)检测肌肤弹性及对比外观变化，志愿者肌肤弹性随使用时间的柱形图如图3所示。

(三)测试结果

由图3可知，选取的15个志愿者中，随着平均使用时间的增加，面部皮肤的弹性值逐渐增加。与使用前比较，在使用2、4、6、8周时，弹性分别增加了9％、16％、19％、21％。说明本发明的抗衰老精华素和抗皱面霜，能够有效提高皮肤的弹性，从而具有抗衰老功效。

其中2名女性志愿者使用前后实例对比图如图4和图5所示，1名男性志愿者使用前后实例对比图如图6所示。由图4至图6所示，志愿者在使用本发明的抗衰老精华素和抗皱面霜8周后，眼部皱纹得到明显改善，皮肤色斑、暗沉的现象明显减弱，皮肤变得更加紧致和水润。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (9)

1.参灵草抗衰中药提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)、将由如下重量份的组分组成的原料药粉碎：人参20～30份、灵芝20～40份、冬虫夏草5～10份，熟地黄10～20份、茯苓5～15份、黄精5～10份、山药5～15份、山茱萸5～15份，然后混合均匀并加入适量溶剂浸泡，得到浸泡液；

(2)、对步骤(1)的浸泡液进行低温超声提取，得到的超声提取液经离心分离、微孔滤膜过滤、反渗透膜加压浓缩，得到精制提取液；

(3)、将步骤(2)的精制提取液干燥成粉末，得到参灵草抗衰中药提取物；或往步骤(2)的精制提取液中添加适量植物来源的1,3-丙二醇、1,3-丁二醇或甘油，得到参灵草抗衰中药提取物；

所述低温超声提取步骤中，超声温度：25℃～50℃，超声频率为20～50kHz，单次超声时间：15min～30min；超声次数：3次～5次。

2.根据权利要求1所述的参灵草抗衰中药提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述重量份的原料药为：人参20～25份、灵芝30～34份、冬虫夏草8～10份，熟地黄10～12份、茯苓5～7份、黄精6～8份、山药5～8份、山茱萸5～7份。

3.根据权利要求2所述的参灵草抗衰中药提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述重量份的原料药为：人参23份、灵芝34份、冬虫夏草8份，熟地黄12份、茯苓7份、黄精6份、山药5份、山茱萸5份。

4.根据权利要求1所述的参灵草抗衰中药提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述溶剂为水或乙醇水溶液；所述原料药与所述溶剂的质量比为1:(10～50)，浸泡1～3h。

5.根据权利要求1所述的参灵草抗衰中药提取物的制备方法，其特征在于，所述微孔滤膜过滤步骤采用0.1～1μm的微孔滤膜进行过滤，得到滤液L；所述反渗透膜加压浓缩步骤将所述滤液L通过反渗透膜在0.5～3MPa下浓缩至滤液L体积的20～50％。

6.权利要求1-5中任一项所述的参灵草抗衰中药提取物的制备方法得到的参灵草抗衰中药提取物。

7.权利要求6所述的参灵草抗衰中药提取物的应用，其特征在于，用于制备具有美白和抗衰老功效的化妆品。

8.根据权利要求7所述的参灵草抗衰中药提取物的应用，其特征在于，所述具有美白和抗衰老化妆品由所述参灵草抗衰中药提取物及辅料组成，所述参灵草抗衰中药提取物的含量为1～40wt％，所述辅料的含量为60～99wt％。

9.根据权利要求8所述的参灵草抗衰中药提取物的应用，其特征在于，所述具有美白和抗衰老化妆品包括化妆水、面膜、精华、乳液、膏和霜。

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