CN102816251A - 一种高活性黄芪多糖及其药物组合物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种高活性黄芪多糖的制备方法，进一步，本发明涉及将黄芪多糖制成含黄芪多糖的药物组合物；由下述步骤组成：将黄芪药材粉碎后浸于CaO水溶液中，经超声提取，冷沉，离心，微滤，超滤，反渗透，喷雾干燥，即得黄芪多糖。利用本发明提取的黄芪多糖的活性高，产率高，而且本发明的工艺简单，具有省时、节能、高效、简便等优点，利于推广、开发和应用。
Description
技术领域
本发明属于天然药物领域，涉及一种从中药黄芪中分离制备高活性黄芪多糖的方法，本发明进一步涉及将本发明分离制备的黄芪多糖制成含黄芪多糖的药物组合物的方法。
背景技术
黄芪是我国重要的中药材品种之一，其药用部位为根，具有补气升阳、固表止汗、利水消肿、生津养血、行滞通痹、脱毒排脓、敛疮生肌等功效，是许多中药复方、成药和保健品的主要成分。我国药典规定，药用黄芪有两种：豆科植物膜荚黄芪Astragalus membraneceus(Fisch.)Bge.和蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao。
黄芪多糖是黄芪中重要的活性成分，天然黄芪中多糖含量约为5～12％左右，在国内外的研究和应用中，发现了它的多方面药理作用和临床功效。黄芪多糖具有较强的免疫促进作用，能提高正常及免疫功能低下小鼠网状内皮系统的吞噬功能，刺激细胞免疫，能增强小鼠巨噬细胞吞噬功能，促进抗体的形成，还能增加小鼠抗体生成，提高脾脏的重量和增加脾细胞数；黄芪多糖体内实验表明其可提高酸性酯酶染色阳性淋巴细胞比率，增强NK细胞活性等生物活性作用，对数种原因导致的缺氧小鼠可提高其耐缺氧能力，并能降低大鼠血小板粘附，减少血栓形成，安全无副作用。因此选择黄芪多糖作为本课题的研究方向。临床疗效也验证了此方的正确性，故确定了从黄芪中提取黄芪多糖并制成可溶性粉，口服液等中药组合物。
鸡传染性法氏囊炎和传染性支气管炎对养禽业造成极大的危害，是目前要重点防治的疾病。但是，使用西药效果不尽人意，存在疫苗保护率低、抗生素等化学药物的药物残留等缺点。目前兽药典并无明确规定出任何一种可以治疗鸡传染性法氏囊炎IBD和传染性支气管炎IB两种疾病的方剂。而从现有资料来看，中药治疗IBD、IB方剂都比较复杂，而且多局限于根据中药的药性拟订一个方剂，然后应用于临床治疗，仅凭经验判断或一些感性指标进行评价，没有大量实验数据及独创理论的支撑，缺乏不同药物组合的比较。中药的调整作用还表现为双向对肌体的调节作用，黄芪是一味经典的补气中药，味甘、性温，有补气升阳、固表止汗、脱毒排脓和生肌等功效。黄芪多糖是黄芪中重要的天然有效成分，黄芪多糖为纯天然药物黄芪的提取物，无残留、无污染，黄芪多糖粉、口服液也具有用药方便，用量容易控制等独特的优点而得到大量应用，且防治效果确切，因此具有良好的市场前景和推广应用价值。
黄芪多糖的提取方法对其生物活性影响较大。虽然涉及黄芪多糖提取分离方法的报道很多，但是方法设备及环境要求很高，方法比较复杂，成本高，不利于推广、开发和应用。而传统的黄芪多糖的分离提取工艺，大多采用简单的“水提醇沉法”，该法工艺落后，效率低下，长时间高温受热促使黄芪多糖发生分解，所得黄芪多糖的产率和生物活性均较低。
发明内容
针对现有技术的不足，提出本发明。本发明的目的在于提供一种黄芪多糖的产率和活性均较高的制备方法。本发明运用超声提取(省时、节能、高效)和在线高速离心(省时、简便易操作)、微滤(省时、无残留)、超滤(无残留)、反渗透(省时、高效)和喷雾干燥(省时、高效)技术，结合传统工艺的CaO碱水提取、冷沉，所得黄芪多糖的产率和活性都较高。进一步，将制备的黄芪多糖制成可溶性粉和口服液。
超声提取相对传统的水煎煮法，具有提取时间短、提取温度低等特点，可避免长时间高温对有效成分的破坏，且提取物有效成分含量高，杂质少，有利于提高后续的膜过滤的效率和膜的使用寿命。超声提取结合微孔过滤、超滤、反渗透技术可使黄芪多糖的产率和生物活性大幅度提高，远高于传统的水煎醇沉法所得黄芪多糖的产率和活性。并且本发明的提取工艺操作简单，周期短，有利于连续操作，传统的醇沉法中，醇沉前需要浓缩，醇沉后还需要回收乙醇，操作繁琐，效率低下，而超滤可以截留提取液中的高分子杂质，反渗透可以直接除去水分达到浓缩的作用，避免反复加热破坏黄芪多糖的活性。
本发明的提取黄芪多糖的步骤如下：
(1)将黄芪药材粉碎成直径为200～500μm的粗粉，按质量比，加5～10倍量1％CaO水溶液浸泡30～60min后进行超声提取；
(2)将黄芪提取液迅速冷却至室温，以8000～12000rpm在线高速离心，离心液再过微孔滤膜；
(3)收集滤过液，过超滤膜进行纯化；
(4)收集滤过液，过反渗透膜进行浓缩；
(5)收集截留液，喷雾干燥，得黄芪多糖。
其中，步骤(1)超声提取功率为20～60KHz，提取温度为40～80℃，提取时间为20～90min，提取次数为1～3次。超声提取的优势在于：提取时间短，无需加热等特点，可避免长时间高温对黄芪多糖的分解破坏，并且提取过程的能耗低，提取率高，杂质少，所提取的黄芪多糖纯度得以明显的提高。
步骤(2)中微孔滤膜的孔径大小为0.20～0.75μm，过膜压力为0.1～0.3MPa，过膜过程中不断加温水冲洗，加水量为黄芪多糖离心液的1～3倍。过微孔滤膜的作用在于：除去不溶性颗粒杂质，提高黄芪多糖的纯度，同时保护后面的超滤膜和反渗透膜，延长超滤膜和反渗透膜的使用寿命。微孔滤膜的孔径小于0.2μm时，过滤效率显著降低，过滤周期延长，生产成本升高；微孔滤膜的孔径大于0.75μm时，无法完全除去不溶性微粒杂质，增加了超滤膜的污染，减短了超滤膜的使用寿命。
步骤(3)中超滤膜的截留分子量为50000～200000道尔顿。超滤的作用在于：去除提取液中的高分子杂质，达到纯化的目的。本发明将分别采用截留分子量小于50000道尔顿的超滤膜、截留分子量为50000～200000道尔顿的超滤膜、截留分子量大于200000道尔顿的超滤膜纯化所得到的黄芪多糖进行活性比较，结果表明采用截留分子量为50000～200000道尔顿的超滤膜纯化所得黄芪多糖的活性相比其他两种膜纯化所得黄芪多糖的活性有显著性差异。具体实验见实施例4。
步骤(4)中反渗透膜的进膜压力1～20MPa。反渗透的作用在于：去除提取液中的水，使提取液不受热达到浓缩(收集流出的水分，可以再生利用)。
步骤(5)中喷雾干燥的进风温度为140～180℃，出风温度为70～90℃，雾化压力为30～50MPa。
与现有技术相比，本发明具有显著的优势：
(1)超声提取、冷沉、在线高速离心、微滤、超滤、反渗透和喷雾干燥技术的联合应用，具有明显的优势，显著提高了黄芪多糖的产率和生物活性。
(2)超声提取为低温提取过程，膜过滤为物理分离纯化过程，无需加热，避免多糖长时间受热分解而降低活性。
(3)可实现连续操作，方法简便，工艺周期短，降低了生产成本，有利于黄芪多糖的大规模生产使用。
将本发明所得到的黄芪多糖与传统的提取方法：水提醇沉、微波提取、乙醇回流提取所得到的黄芪多糖进行活性测定。结果表明本发明的黄芪多糖的活性相比传统方法提取的黄芪多糖活性有显著性差异。具体试验见实施例5。
按质量比，将黄芪多糖2～90％与药学上可接受的载体或辅料10～98％混合，按常规方法制成制剂。
所述含黄芪多糖的药物组合物，其特征在于：按质量比，将黄芪多糖30～80％与药学上课接受的载体或辅料20～70％混合。
前述含黄芪多糖的药物组合物，其特征在于：按质量比，将黄芪多糖3～8％与92～97％的口服液常规辅料混合，调节PH至5.0～7.0，按常规方法制成口服液。
前述含黄芪多糖的药物组合物，其特征在于：按质量比，将黄芪多糖50～90％与10～50％的粉剂常规辅料混合，按常规方法制成可溶性粉。
口服液常规辅料为抗氧化剂、防腐剂、PH调节剂及纯化水。
粉剂常规辅料为稀释剂、防腐剂。
抗氧化剂含有亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠，依地酸二钠的一种或几种；防腐剂含有苯甲酸、苯甲酸钠、对羟基苯甲酸酯类、山梨酸、山梨酸钾的一种或几种；PH调节剂含有盐酸、乳酸、磷酸及其盐、乙酸及其盐、氢氧化钠的一种或几种；稀释剂含有麦芽糊精、可溶性淀粉、葡萄糖的一种或几种。
附图说明
附图为本发明提取黄芪多糖的工艺流程图
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。
本发明提取黄芪多糖方法：
实施例1：
称取黄芪药材10g，粉碎成直径为300μm的粗粉，加10倍量1％CaO水溶液浸泡60min；超声提取3次(功率60Kw，温度60℃)，每次30min，合并提取液，迅速冷却至室温，以12000rpm离心，离心液过0.22μm的微孔滤膜，过膜压力为0.3MPa，过膜过程中不断加温水冲洗，加水量为黄芪多糖离心液的3倍，滤过液过截留分子量为200000道尔顿的超滤膜，超滤液再以10MPa的压力过反渗透膜进行浓缩(收集流出的水分，返回提取罐再利用)，经喷雾干燥(喷雾干燥的进风温度为160℃，出风温度为80℃，雾化压力为40MPa)，即得黄芪多糖0.95g。
实施例2：
称取黄芪药材5g，粉碎成直径为200μm的粗粉，加8倍量1％CaO水溶液浸泡30min；超声提取2次(功率20Kw，温度40℃)，每次60min，合并提取液，迅速冷却至室温，以10000rpm离心，离心液过0.45μm的微孔滤膜，过膜压力为0.2MPa，过膜过程中不断加温水冲洗，加水量为黄芪多糖离心液的2倍，滤过液过截留分子量为100000道尔顿的超滤膜，超滤液再以15MPa的压力过反渗透膜进行浓缩(收集流出的水分，返回提取罐再利用)，经喷雾干燥(喷雾干燥的进风温度为180℃，出风温度为90℃，雾化压力为30MPa)，即得黄芪多糖0.41g。
实施例3：
称取黄芪药物饮片20g，粉碎成直径为500μm的粗粉，加5倍量1％CaO水溶液浸泡40min；超声提取1次(功率40Kw，温度80℃)，每次90min，合并提取液，迅速冷却至室温，以8000rpm离心，离心液过0.75μm的微孔滤膜，过膜压力为0.1MPa，过膜过程中不断加温水冲洗，加水量为黄芪多糖离心液的1倍，滤过液过截留分子量为50000道尔顿的超滤膜，超滤液再以20MPa的压力过反渗透膜进行浓缩(收集流出的水分，返回提取罐再利用)，经喷雾干燥(喷雾干燥的进风温度为140℃，出风温度为70℃，雾化压力为50MPa)，即得黄芪多糖1.57g。
实施例4：黄芪多糖生物活性测定试验(一)
1.实验材料：
动物：选用昆明小白鼠，雌雄各半，体重为18-20g，购于中国医科大学动物实验中心。
药物：选择不同截留分子量的超滤膜，其他步骤均按照实施例1所述的方法制备得到的不同黄芪多糖：①截留分子量小于50000道尔顿的超滤膜纯化所得到的黄芪多糖、②截留分子量为50000～200000道尔顿的超滤膜纯化所得到的黄芪多糖、③截留分子量大于200000道尔顿的超滤膜纯化所得到的黄芪多糖；生理盐水。
2.试验方法：
取健康小白鼠，分成四组，每组8只，均为雌雄各半，给药组每鼠腹腔注射供试品，对照组每鼠腹腔注射生理盐水，连续注射7日，每日1次，于最后一次注射24小时后，将动物处死，称体重，取脾称，计算平均脾指数。(脾指数＝脾重(mg)/体重(mg)，平均脾指数＝组内脾指数总和/组内动物数)实验结果见表1。
3.实验结果：
②组与对照组和其他给药组比较，P＜0.05，均具有显著性差异。
表1不同截留分子量的超滤膜纯化所得黄芪多糖的活性测定结果
实施例5：黄芪多糖生物活性测定试验(二)
1.实验材料：
动物：选用昆明小白鼠，雌雄各半，体重为18-20g，购于中国医科大学动物实验中心。
药物：①实施例1制备的黄芪多糖、②实施例2制备的黄芪多糖、③实施例3制备的黄芪多糖、④水提醇沉法制备的黄芪多糖、⑤微波提取法制备的黄芪多糖、⑥乙醇回流法制备的黄芪多糖；生理盐水。
2.试验方法：
取健康小白鼠，分成五组，每组8只，均为雌雄各半，给药组每鼠腹腔注射供试品，对照组每鼠腹腔注射生理盐水，连续注射7日，每日1次，于最后一次注射24小时后，将动物处死，称体重，取脾称，计算平均脾指数。(脾指数＝脾重(mg)/体重(mg)，平均脾指数＝组内脾指数总和/组内动物数)实验结果见表2。
3.实验结果：
①②③组与对照组和其他给药组比较，P＜0.05，均具有显著性差异。
表2不同提取方法制备黄芪多糖的活性测定结果
本发明黄芪多糖口服液制备方法
实施例1：
称取黄芪多糖3.0g，苯甲酸钠0.5g，加纯化水使之溶解，用氢氧化钠调节pH值至6.0，补加纯化水至100ml，分装，即得药品。
实施例2：
称取黄芪多糖8.0g，山梨酸钾0.3g，依地酸二钠0.02g，加纯化水使之溶解，用氢氧化钠调节pH值至7.0，补加纯化水至100ml，分装，即得药品。
本发明黄芪多糖粉制备方法
实施例1：
称取黄芪多糖50.0g，麦芽糊精49.5g，苯甲酸钠0.5g，混合均匀，分装，即得药品。
实施例2：
称取黄芪多糖80.0g，可溶性淀粉19.5g，山梨酸钾0.5g，混合均匀，分装，即得药品。
Claims (12)
1.一种制备黄芪多糖的方法，其特征在于包括下述步骤：
(1)将黄芪药材粉碎成直径为200～500μm的粗粉，按质量比，加5～10倍量1％CaO水溶液浸泡30～60min后进行超声提取；
(2)将黄芪提取液迅速冷却至室温，以8000～12000rpm在线高速离心，离心液再过微孔滤膜；
(3)收集滤过液，过超滤膜进行纯化；
(4)收集滤过液，过反渗透膜进行浓缩；
(5)收集截留液，喷雾干燥，得黄芪多糖。
其中，步骤(1)超声提取功率为20～60KHz，提取温度为20～80℃，提取时间为20～90min，提取次数为1～3次。
步骤(2)中微孔滤膜的孔径大小为0.20～0.75μm，过膜过程中不断加温水冲洗，加水量为黄芪多糖离心液的1～3倍。
步骤(3)中超滤膜的截留分子量为50000～200000道尔顿。
步骤(5)中喷雾干燥的进风温度为140～180℃，出风温度为70～90℃，雾化压力为30～50MPa。
2.根据权利要求1所述的制备黄芪多糖的方法，其特征在于微孔滤膜的孔径大小为0.22～0.75μm。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于微孔滤膜的孔径大小为0.22～0.45μm。
4.根据权利要求1所述的制备黄芪多糖的方法，其特征在于超滤膜的截留分子量为80000～180000道尔顿。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于超滤膜的截留分子量为100000～160000道尔顿。
6.一种含黄芪多糖的药物组合物，其特征在于：按质量比，将权利要求1～5任一项制备的黄芪多糖2～90％与药学上可接受的载体或辅料10～98％混合，按常规方法制成制剂。
7.根据权利要求6所述的含黄芪多糖的药物组合物，其特征在于：按质量比，将黄芪多糖30～80％与药学上可接受的载体或辅料20～70％混合。
8.根据权利要求6所述的含黄芪多糖的药物组合物，其特征在于：按质量比，将黄芪多糖3～8％与92～97％的口服液常规辅料混合，调节PH至5.0～7.0，按常规方法制成口服液。
9.根据权利要求6所述的含黄芪多糖的药物组合物，其特征在于：按质量比，将黄芪多糖50～90％与10～50％的粉剂常规辅料混合，按常规方法制成可溶性粉。
10.根据权利要求8所述的口服液常规辅料为抗氧化剂、防腐剂、PH调节剂及纯化水。
11.根据权利要求9所述的粉剂常规辅料为稀释剂、防腐剂。
12.根据权利要求10或权利要求11所述的抗氧化剂含有亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、依地酸二钠的一种或几种；防腐剂含有苯甲酸、苯甲酸钠、对羟基苯甲酸酯类、山梨酸、山梨酸钾的一种或几种；PH调节剂含有盐酸、乳酸、磷酸及其盐、乙酸及其盐、氢氧化钠的一种或几种；稀释剂含有麦芽糊精、可溶性淀粉、葡萄糖的一种或几种。
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