CN101516407B

CN101516407B - 改善精氨酸酶水平/活性

Info

Publication number: CN101516407B
Application number: CN2007800348713A
Authority: CN
Inventors: H·H·施米茨; C·L·奎克-乌里贝; H·施勒特
Original assignee: University of California; Mars Inc
Current assignee: University of California; Mars Inc
Priority date: 2006-07-21
Filing date: 2007-07-20
Publication date: 2012-03-21
Anticipated expiration: 2027-07-20
Also published as: RU2012137517A; EP2068941A2; EP2438915A1; AU2007275561A1; CN101516407A; US20120015053A1; JP2010500973A; IL196480A0; RU2009106041A; WO2008011173A3; US20110257119A1; AU2007275561B2; EP2068941A4; WO2008011173A2; US20080021097A1; CA2657915A1; RU2469742C2

Abstract

本发明涉及用于治疗与升高的精氨酸酶水平和/或活性相关的病症的组合物及其使用方法，包括给予需要其的对象某些多酚类，例如黄烷醇、原花青素或其药学上可接受的盐或衍生物。

Description

改善精氨酸酶水平/活性

发明领域

本发明涉及包含某些多酚化合物的组合物以及治疗与升高的精氨酸酶水平和/或精氨酸酶活性相关的病症的方法，所述方法包括给予需要其的对象本文所述的某些多酚化合物。

发明背景

精氨酸酶是一种催化精氨酸水解为鸟氨酸和尿素的酶。鸟氨酸是脯氨酸(促进胶原和组织重塑(remodeling)的氨基酸)以及在细胞增殖中发挥作用的多胺的生物合成前体。精氨酸也是一氧化氮合酶(NOS)的底物，一氧化氮合酶催化由精氨酸合成一氧化氮(NO)和瓜氨酸。因此，精氨酸酶与NOS竞争共同的底物。

已知精氨酸酶在哺乳动物中至少存在两种同功酶(I型和II型)。I型精氨酸酶位于细胞溶质中并主要位于肝脏内，但在很多其他细胞类型中也有表达，而II型精氨酸酶位于线粒体内，并在肝脏以外组织中也有低水平遍在表达。I型和II型精氨酸酶都可被多种细胞因子和其他试剂诱导表达。

近来，升高的精氨酸酶水平/活性已显示与几种人类病理相关。因此，本领域需要调节/降低精氨酸酶水平/活性的方法。

申请人现已发现本文所述的化合物有效地降低精氨酸酶的基因表达(即，转录水平)和/或降低精氨酸酶活性(即，转录后水平)。因此，本文所述化合物有用于治疗与升高的精氨酸酶水平/活性相关的病症。

发明概述

本发明涉及用于治疗与升高的精氨酸酶水平和/或精氨酸酶活性相关的病症的组合物、产品和方法，该方法包括给予有需要其的对象本文所述的某些多酚化合物。

一方面中，本发明涉及包含本发明化合物的组合物，例如食品(包括宠物食品)、食品添加剂、膳食补充剂或药品。含有上述组合物以及标签和/或用于本文所述用途(例如降低精氨酸酶水平和/或活性)的说明书的包装产品在本发明范围内。

另一方面中，本发明涉及治疗与升高的精氨酸酶水平和/或活性相关的病症的方法，其包括给予需要其的对象有效量的本发明化合物。

再一方面中，本发明涉及降低精氨酸酶水平和/或活性的方法，其包括给予需要其的对象有效量的本发明化合物。

附图简述

图1示出了实时PCR分析，其显示黄烷醇降低人内皮细胞中精氨酸酶-2mRNA的表达。条形线(bar)表示三次独立试验的平均值±SD。各试验均进行三次重复。^＊p＜0.05(相对于溶剂对照)。

图2示出了黄烷醇代谢物和(-)-表北茶素减少人内皮细胞中精氨酸酶-2的活性。补充降低精氨酸酶表达的精氨酸酶抑制剂L-缬氨酸(10mM)或TNF-α+IL-1β(各500U/ml)用作阳性对照。条形线表示四次独立试验的平均值±SD；^＊p＜0.05(相对于溶剂对照)，^＊＊p＜0.01(相对于溶剂对照)。

图3示出了高黄烷醇水平的可可降低健康人的红细胞中的精氨酸酶活性(n＝10)；显示了摄入200ml含高水平黄烷醇的可可饮料或相应的含低水平黄烷醇的对照之前的时间点和摄入之后2小时和24小时的时间点。黑线表示0小时和24小时之后的平均值±SE，灰方框表示各数值。^＊p＜0.05。

发明详述

本申请中引用的所有专利、专利申请和参考文献均通过引用并入本文。如有任何不一致之处，以本发明公开为准。

本发明涉及用于治疗与升高的精氨酸酶水平和/或活性相关的病症的组合物、产品和方法，所述方法包括给予需要其的对象本文所述的某些多酚化合物。用于本发明的化合物包括某些黄烷醇(黄烷-3-醇)、原花青素(procyanidin)、或其药学上可接受的盐或衍生物。当此类化合物是天然来源时，其可以可可组分(cocoa component)的形式包含在组合物中，所述可可组分例如为可可粒或其碎片(fragment)、巧克力浆(chocolate liquor)、部分或完全脱脂的可可固体、可可提取物或其级分(fraction)。

本文所用的术语“黄烷醇”或“黄烷-3-醇”指下式的单体：

术语“原花青素”指由上式的单体单元构成的低聚化合物。

术语“可可组分”指衍生自可可豆的成分：例如可可粒及其碎片、巧克力浆、部分或完全脱脂的可可固体(例如饼或粉末)、含有黄烷醇和/或原花青素的可可提取物或其级分。

某些实施方式中，本发明涉及黄烷醇(例如(-)-表儿茶素和(+)-儿茶素)以及包含有效量的黄烷醇(例如(-)-表儿茶素和(+)-儿茶素)、或其药学上可接受的盐或衍生物(包括氧化产物、酯、甲基化衍生物和葡糖苷酸化(glucuronidated)衍生物的组合物，其中(在某些实施方式中)黄烷醇衍生物不是没食子酸化(gallated)衍生物)。可如下文所述制备这些衍生物。

在其它实施方式中，本发明涉及具有下式A_n的化合物以及包含有效量的该化合物、或其药学上可接受的盐或衍生物(包括氧化产物、酯、甲基化衍生物和葡糖苷酸化衍生物)的组合物：

其中

n是2-18的整数；

R和X各具有α或β立体化学；

R是OH或O-糖；

C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，单体单元的键合发生在C-4、C-6或C-8；

当任何C-4、C-6或C-8不键合于其他单体单元时，X、Y和Z独立地是氢或糖；以及

所述糖任选在任何位置(例如经由酯键)被酚结构部分(phenolicmoiety)所取代。

式A_n中的单体单元可经由4α→6、4β→6、4α→8和/或4β→8键结合。所述糖优选是单糖或二糖。所述糖可选自葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、木糖和阿拉伯糖。所述酚结构部分可选自咖啡酸、肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、没食子酸、羟基苯甲酸和芥子酸。原花青素衍生物可包括酯类，例如没食子酸酯；衍生有糖结构部分(例如单糖或二糖结构部分(例如β-D-葡萄糖))的化合物；葡糖苷酸化和甲基化衍生物以及氧化产物。在一些实施方式中，酯衍生物不是与没食子酸的酯。可如美国专利No.5,554,645所述制备氧化产物，该专利的相关部分通过引用纳入本文。酯类，例如没食子酸酯可使用已知的酯化反应制备，例如美国专利No.6,420,572所述的方法，该专利的公开内容通过引用纳入本文。甲基化衍生物(例如3’O-甲基-、4’O-甲基-和3’O，4’O-二甲基-衍生物)例如可按Cren-Olive等，2002，J.Chem.Soc.Perkin Trans.1，821-830和Donovan等，Journal of Chromatography B，726(1999)277-283中的描述所述制备，这些参考文献的内容均通过引用纳入本文。葡糖苷酸化产物可如以下文献所述制备：Yu等，“一种制备葡糖苷酸化物的新型和有效的方法(A novel and effective procedure for the preparation ofglucuronides)”，Organic Letters，2(16)(2000)2539-41，Spencer等，“表儿茶素的葡糖苷酸化和O-甲基化对神经元和成纤维细胞中过氧化氢诱导的细胞死亡的相反作用(Contrasting influences of glucuronidation andO-methylation of epicatechin on hydrogen peroxide-induced cell death inneurons and fibroblasts)”Free Radical Biology and Medicine 31(9)(2001)1139-46，这些参考文献的内容均通过引用纳入本文。葡糖苷酸化可发生在7、5和/或3’位。葡糖苷酸化产物的例子包括4’-O-甲基表儿茶素-O-β-D-葡糖苷酸(例如，4’-O-甲基-表儿茶素-7-O-β-D-葡糖苷酸)、3’-O-甲基-表儿茶素-O-β-D-葡糖苷酸(例如，3’-O-甲基-表儿茶素-5/7-O-β-D-葡糖苷酸)和表儿茶素-O-β-D葡糖苷酸(例如，表儿茶素-7-O-β-D-葡糖苷酸)。应注意本公开内容适用于本文所述的所有结构式。

另一种实施方式中，本发明涉及具有式A_n的化合物和包含有效量的该化合物、或其药学上可接受的盐或衍生物(包括氧化产物、酯、甲基化衍生物和葡糖苷酸化衍生物)的组合物：

其中

n是2-18的整数；

R和X各具有α或β立体化学；

R是OH；

C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，单体单元的键合发生在C-4、C-6和C-8；以及

当任何C-4、C-6或C-8不键合于其他单体单元时，X、Y和Z是氢。

有用于本发明产品和方法中的化合物的例子包括本文所述的式A_n化合物，其中整数n是3-18、2-12、3-12、2-5、4-12、5-12、4-10或5-10。一些实施方式中，整数n是2-4，例如2或3。本公开内容适用于本文所述式A_n的任何化合物。

使用方法

本发明涉及在需要其对象中治疗与升高的精氨酸酶水平和/或活性相关的病症的方法。

本文所用术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”指获得所需的病理学效果。该效果可以是预防性的，完全或部分防止病症/疾病/紊乱或其症状，防止易感染该疾病但尚未诊断为患有该疾病的对象中出现该疾病或疾病症状(例如，包括与原发性疾病相关或由其引起的疾病)；和/或可以是治疗性的，减缓病症/疾病/紊乱的进程(即，遏制其发展，使该疾病消退)，延长存活期，降低死亡风险，减少疾病引起的不良作用风险，和/或使与该病症/疾病/紊乱相关的发病率发生可检测的降低。

本文所使用的“治疗与升高的精氨酸酶水平和/或活性相关的病症”指治疗哺乳动物(尤其人或牲畜(veterinary animal))中与精氨酸酶水平和/或精氨酸酶活性增加相关的病症/疾病/紊乱。此类病症/疾病/紊乱的例子为：溶血病(例如，镰状细胞性贫血、地中海贫血、溶血病相关的内皮功能障碍、溶血病相关的肺血管性高血压(pulmonary hypertension)；炎症(例如，难愈性(impaired)伤口愈合、手术后创伤、慢性下肢静脉性溃疡、慢性静脉功能不全、牙周炎、关节炎)；免疫病症/疾病(例如，韦格纳肉芽肿病、关节炎、手术后免疫功能障碍(例如癌症患者中)；呼吸系统/肺部疾病(例如，哮喘以及哮喘/呼吸病理相关的气道高反应性、囊性纤维化、气道壁增厚和气道重塑)；血管/心血管/心肺疾病，例如，与升高的精氨酸酶相关的原发性高血压、肺血管高压(例如肺动脉高压)、与升高的精氨酸酶相关的内皮功能障碍、心绞痛、脉管系统老化(包括年龄相关的心肌功能障碍和心力衰竭)；微循环功能障碍，例如，缺血再灌注损伤(例如在心脏微血管系统中)、冠状动脉功能障碍、脓毒症；肾功能障碍，例如，肾小球肾炎、肾功能不全(例如在血管阻力和/或血压易于升高的对象中)；糖尿病相关病症，例如糖尿病患者中(例如在糖尿病性神经病中)的微循环功能障碍、糖尿病性肾病/肾功能障碍、糖尿病足溃疡(包括在溃疡周围形成胼胝)、糖尿病患者的难愈性伤口愈合、糖尿病患者外周血管病中的微循环损害、糖尿病相关的性功能障碍；癌症，例如乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌；皮肤病，例如牛皮癣；神经病，例如抑郁症；性功能障碍，例如勃起功能障碍、阴茎佩罗尼样病、女性性功能障碍。

本发明涉及使用本文所述化合物治疗患有上述病症或具有该病症风险的对象。

本领域技术人员将选择测定精氨酸酶水平(即，mRNA表达，酶(蛋白)水平)/活性(即酶活)的已知方法，例如实施例中所述的方法。

某些实施方式中，本发明提供治疗与升高的精氨酸酶水平和/或活性相关的病症的方法，其包括给予需要其的哺乳动物(例如人)或牲畜有效量的黄烷醇(例如表儿茶素或儿茶素(例如，(-)-表儿茶素或(+)-儿茶素))、或其药学上可接受的盐或衍生物(包括氧化产物、酯、甲基化衍生物和葡糖苷酸化衍生物，其中所述黄烷醇衍生物不是没食子酸化衍生物)。

术语“牲畜”指由兽医照顾或护理的任何动物，包括伴侣动物(宠物)和家畜，例如，猫、狗和马。

某些实施方式中，本发明提供治疗与升高的精氨酸酶水平和/或活性相关的疾病的方法，其包括给予需要其的哺乳动物(例如人)或牲畜包含有效量的式A_n化合物或其药学上可接受的盐或衍生物(包括氧化产物、酯、甲基化衍生物和葡糖苷酸化衍生物)的组合物：

其中

n是2-18的整数；

R和X各具有α或β立体化学；

R是OH或O-糖；

所述糖任选在任何位置(例如通过酯键)被酚结构部分所取代。

例如，上述方法可包括使用化合物A_n或其药学上可接受的盐或衍生物(包括氧化产物、酯、甲基化衍生物和葡糖苷酸化衍生物)，其中R是OH，当任何C-4、C-6或C-8不键合于其他单体单元时，X、Y和Z是氢。合适的糖的例子如上文所述。酚结构部分的例子如上文所述。衍生物的例子如上文所述。

某些实施方式中，本发明提供治疗与升高的精氨酸酶水平和/或活性相关的病症的方法，其包括给予需要其的哺乳动物(例如人)或牲畜包含有效量的式A_n化合物或其药学上可接受的盐或衍生物(包括氧化产物、酯、甲基化衍生物和葡萄糖醛酸化衍生物)的组合物：

其中

n是2-18的整数；

R和X各具有α或β立体化学；

R是OH；

当任何C-4、C-6或C-8不键合于其他单体单元时，X、Y和Z是氢。

有用于本发明产品和方法中的化合物例子包括本文所述化合物，其中整数n是3-18、2-12、3-12、2-5、4-12、5-12、4-10或5-10。一些实施方式中，整数n是2-4，例如2或3。该公开内容适用于本文所述式A_n的任何化合物。

需要治疗与升高的精氨酸酶水平和/或活性相关的病症的对象的例子对于本领域技术人员将是显而易见的。此类对象的例子是患有以下疾病或具有该疾病风险的对象：溶血病(例如，镰状细胞性贫血、地中海贫血、溶血病相关的内皮功能障碍、溶血病相关的肺血管性高血压(pulmonaryhypertension)；炎症(例如，难愈性伤口愈合、手术后创伤、慢性下肢静脉性溃疡、慢性静脉功能不全、牙周炎、关节炎)；免疫病症/疾病(例如，韦格纳肉芽肿病、关节炎、手术后免疫功能障碍(例如癌症患者中)；呼吸系统/肺部疾病(例如，哮喘以及哮喘/呼吸病理相关的气道高反应性、囊性纤维化、气道壁增厚和气道重塑)；血管/心血管/心肺疾病，例如，与升高的精氨酸酶相关的原发性高血压、肺血管高压(例如肺动脉高压)、与升高的精氨酸酶相关的内皮功能障碍、心绞痛、脉管系统老化(包括年龄相关的心肌功能障碍和心力衰竭)；微循环功能障碍，例如，缺血再灌注损伤(例如在心脏微血管系统中)、冠状动脉功能障碍、脓毒症；肾功能障碍，例如，肾小球肾炎、肾功能不全(例如在血管阻力和/或血压易于升高的对象中)；糖尿病相关病症，例如糖尿病患者中(例如在糖尿病性神经病中)的微循环功能障碍、糖尿病性肾病/肾功能障碍、糖尿病足溃疡(包括在溃疡周围形成胼胝)、糖尿病患者的难愈性伤口愈合、糖尿病患者外周血管病中的微循环损害、糖尿病相关的性功能障碍；癌症，例如乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌；皮肤病，例如牛皮癣；神经病，例如抑郁症；性功能障碍，例如勃起功能障碍、阴茎佩罗尼样病、女性性功能障碍。

本发明化合物可以可可组分的形式口服给予，所述可可组分例如为可可粒或其碎片、巧克力浆、部分或完全脱脂的可可固体(例如可可粉)、可可提取物或其级分，或者本发明化合物可独立于可可组分而加入。可制备可可组分以使可可多酚(CP)(黄烷醇和/或原花青素)的含量得以保留(preserved)。

一些实施方式中，本发明化合物可与其他精氨酸酶抑制剂联合施用，及/或增强对其他精氨酸酶抑制剂的反应性。精氨酸酶抑制剂的例子包括：(S)-(2-二羟硼基乙基)-L-半胱氨酸(BEC)、2(S)-氨基-6-二羟硼基己酸(ABH)、N^G-羟基-L-精氨酸(NOHA)、L-2-氨基-(4-(2’-羟基胍基)丁酸(nor-NOHA)和DL-α-二氟甲基鸟氨酸(DFMO)，及其药学上可接受的盐。这些另外的精氨酸酶抑制剂可局部给予或口服给予。

因此，以下用途包括在本发明范围内。上文定义的黄烷醇或其药学上可接受的盐或衍生物(包括氧化产物、酯、甲基化衍生物和葡糖醛酸衍生物，其中(一些实施方式中)所述衍生物不是没食子酸化衍生物)在制备药物、食品、保健(nutraceutical)或膳食补充剂中的用途，所述药物、食品、保健或膳食补充剂用于治疗与升高的精氨酸酶水平和/或活性相关的病症或上述对象。上文定义的式A_n化合物或其药学上可接受的盐或衍生物(包括氧化产物、酯、甲基化衍生物和葡糖醛酸衍生物)在制备药物、食品、保健或膳食补充剂中的用途，所述药物、食品、保健或膳食补充剂用于治疗与升高的精氨酸酶水平和/或活性相关的病症。

本领域技术人员使用本文提供的指导和本领域常识可确定所述有效量，例如通过考虑诸如给药剂量、基质、给药频率、给药途径等因素来确定。例如，有效量可以是在哺乳动物体内达到生理学相关浓度。这样的生理学相关浓度可以是至少20纳摩尔(nM)，优选至少约100nM，更优选至少约500nM。一种实施方式中，在哺乳动物(例如人)的血液中达到至少约1微摩尔。可使用例如Schroeter H.等，2006，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，103：1024-1029所述的方法测定被试者血液中的化合物(见下文实施例)。本文所定义的化合物的的给药量可以从约35毫克/天、40毫克/天或50毫克/天(例如，至约1000毫克/天)、或从约75毫克/天(例如，至约1000毫克/天)、或从约100-150毫克/天(例如，至约900毫克/天)、或从300毫克/天(例如，至约500毫克/天)。但是，给药量也可高于以上举例说明的量，因为给药范围的上限不是限制性因素。可按Adamson，G.E.等.，J.Ag.FoodChem.；1999；47(10)4184-4188中的描述来测定所述量。

所述给药可作为方案(regimen)持续进行，即进行一段有效时间，例如，每天给药、每月给药、每两月给药、每半年给药、每年给药或以其他给药方案给药，熟练的医师可确定所需的给药时间。可持续给药至少减少上述对象中精氨酸酶水平和/或活性和/或实现改进所需的一段时间。本发明组合物可每日给药，优选每天给药两次或三次，例如早上和晚上给药以在哺乳动物体内维持有效化合物的水平。为获得最有益的结果，可给予本发明组合物至少7天，或至少14天，或至少30天，或至少45天，或至少60天，或至少90天。可根据需要周期性重复这些方案。快速(acutely)给予本发明组合物从而可在数小时至数天内观察到效果时(例如通过口服给药或更快速的静脉给药)，本发明组合物也是有益的。

组合物和制剂

本发明组合物可作为食品(包括宠物食品)、食品添加剂、膳食添加剂或药物给予。

本文所用的“食品”是含有蛋白质、碳水化合物和/或脂肪的物质，其在有机体体内用于维持生长、修复和生命过程并提供能量。食品也可含有补充物质，例如矿物质、维生素和调味剂。参见《韦氏大学词典(Merriam-Webster′s Collegiate Dictionary)》，第10版，1993。术语食品包括适合人类及动物消费的饮料。本文所用的“食品添加剂”如FDA在21C.F.R.170.3(e)(1)中的定义，包括直接添加剂和间接添加剂。本文所用的“膳食补充剂”是意在补充膳食并带有或含有下述一种或多种膳食成分的产品(烟草除外)：维生素、矿物质、草药(herb)或其他植物制剂(botanical)、氨基酸、人们通过增加这些成分的每日摄入总量或浓度、代谢物、组成物、提取物或其组合而用来补充膳食的膳食物质。本文所用的“药物”指药品。参见《韦氏大学词典》，第10版，1993。药物也可称作药剂。可用本领域已知的方法制备上述组合物。

本发明组合物可含有载体、稀释剂或赋形剂。取决于预期的用途，可对载体、稀释剂或赋形剂进行选择使其适于人或牲畜使用，适于食品、添加剂、膳食补充剂或药物用途。所述组合物可任选含有另外的精氨酸酶抑制剂。同样取决于用途，本领域技术人员可选择本发明化合物的纯度。例如，用于制备药物剂型时，应选择商业可得的尽可能纯的化合物，而制备食品、添加剂或补充剂时，可使用纯度较低的化合物或化合物的混合物(例如植物提取物)。

本发明化合物可以是“分离或纯化的”，即，它可以从与其天然共存的化合物中分离(例如，当该化合物是天然来源时)，或者它可以是合成的，在任一种情况下，污染化合物和/或杂质的水平不显著影响或减损所述化合物的有效性。例如，“分离及纯化的B2二聚体”通过商业上可利用的纯化和分离技术从可能与之一起存在于自然界(例如在可可豆中)中的B5二聚体中分离出。此类化合物尤其适于药物应用。

化合物也可纯度更低，即“基本纯的”，即其可具有通过可利用的纯化、分离和/或合成技术所能达到的最高均质性，但不需要从类似的(like)化合物中分离。本文所用的“类似的化合物”是具有相同聚合度的化合物。例如，“基本纯的二聚体”指二聚体混合物(例如，B2和B5，如可发生于可可提取物级分中的情况)。虽然较不适于药物应用，此类“基本纯的”化合物可用于食品、食品添加剂和膳食补充剂应用。

一些实施方式中，本发明化合物的纯度是至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％。此类化合物尤其适于药物应用。

可口服给予含有本发明化合物的药物(任选与其他精氨酸酶抑制剂联合)。本文所用的“口服给予(给药)”包括通过口给药，并包括舌下或口腔(bucal)给药。本领域技术人员将能够确定合适的给药方式以最大程度地递送本发明化合物。因此，适于通过口给药的各类剂型在本发明范围内，包括固体、液体和半固体剂型，例如片剂、胶囊、明胶胶囊(gelcaps)、散装(bulk)或单位剂量粉末或颗粒、乳剂、混悬剂、糊剂或凝胶剂(jellies)。缓释剂型也在本发明范围内。合适的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂是本领域普遍已知的，并可由本领域技术人员容易地确定。例如，片剂可包含有效量的本发明化合物和任选的载体，例如山梨糖醇、乳糖、纤维素或磷酸二钙。

可使包含本文所述化合物和任选其它精氨酸酶抑制剂的食品适于人或牲畜使用，包括用作宠物食品。所述食品可能不是甜食(confectionery)，例如可以是饮料(例如可可风味的饮料)。甜食，例如身份标准(standardof identity，SOI)巧克力或非SOI巧克力，例如牛奶巧克力、甜巧克力、半甜巧克力(包括黑巧克力)、低脂巧克力和糖果(可以是涂有巧克力的糖果)都在本发明范围内。其他例子包括烘焙产品(例如，核仁巧克力饼(brownie)、烘焙点心、曲奇、饼干)、调味料、格兰诺拉麦片饼(granolabar)、太妃糖(toffee chew)、代餐棒(meal replacement bar)、涂抹在面包或饼干上的食品(spread)、糖浆、粉末饮料混合物(powder beveragemix)、可可或巧克力风味的饮料、布丁、米饼、米混合物(rice mix)、香薄荷酱(savory sauce)等。如果需要，所述食品可以是巧克力或可可风味的。食品产品可以是含有坚果(例如花生、核桃、杏仁和榛子)的巧克力和糖果棒，例如格兰诺拉麦片饼。对食品进行设计，以递送有效量的本文所述化合物。

用于本发明的化合物可以是天然来源(例如源自可可豆或本领域技术人员已知的其他天然来源)的或者可以是合成的。本领域技术人员可基于用途和/或可获得性或成本来选择天然多酚或合成多酚。

本发明化合物可以可可组分的形式包含在组合物中。例如，本发明化合物可以可可成分(例如包含在巧克力中的巧克力浆)形式包含在本发明组合物中，或者本发明化合物可独立于可可成分而加入，例如作为提取物、提取物级分、分离和纯化的单独化合物、汇集的提取物级分或合成制备的化合物。术语“可可成分(cocoa ingredient)”指含有可可固体的物质，其衍生自无壳可可粒，例如巧克力浆和部分或完全脱脂的可可固体(例如饼或粉)。可按授予Romanczyk等的美国专利5,554,645和6,670,390以及授予Hammerstone等的美国专利6,627,232中的描述进行提取和纯化，这些专利均通过引用纳入本文。

本发明组合物中的可可黄烷醇和/或原花青素可以通过含有这些化合物的可可成分来提供，或者通过包含巧克力来提供，所述巧克力可以是牛奶巧克力、甜巧克力或半甜巧克力，优选黑巧克力，以及低脂巧克力。可使用常规的可可加工程序来制备所述可可成分，但优选使用Kealey等的美国专利6,015,913所述方法制备。或者，为了提高可可多酚水平，可使用由发酵系数为275或更小的可可豆制备的巧克力浆和可可固体。这些成分的可可多酚含量高于用常规可可加工方法(例如焙烧)获得的含量，并高于完全发酵的可可豆。可使用常规技术从上述成分制备巧克力，或使用以下文献中描述的用于在巧克力制备期间中保留可可多酚的改进方法来制备巧克力：国际申请No.PCT/US99/05414(公开号为WO99/45788)，其相应美国专利(美国专利No.6,194,020)，这些专利的相关部分通过引用纳入本文。通过下述非传统方法中的至少一种制备的巧克力在本文称为“具有保留量的可可多酚的巧克力”：(i)从发酵不充分或未发酵的可可豆制备可可成分；(ii)在可可成分制备过程期间保留可可多酚；和(iii)在巧克力制备过程期间保留可可多酚。此类非传统方法可用于制备其他含有可可组分的产品(食品，例如饮料、膳食补充剂)，所述产品设计为增强水平的黄烷醇和/或原花青素。

也可使用合成的原花青素，并用本领域已知的方法制备，例如美国专利6,420,572、6,156,912和6,864,377中描述的方法，这些专利的相关部分均通过引用纳入本文。

可以单次摄入(在食品的情况中)或单剂量(在药物或膳食补充剂的情况中)提供日有效量的本发明化合物。例如，甜食(例如巧克力)可提供至少约100毫克/摄入(例如150-200、200-400毫克/摄入)。

可使用本领域已知的方法制备含有本发明化合物并任选含有另一种精氨酸酶抑制剂的膳食补充剂，所述膳食补充剂可含有例如营养素，如磷酸二钙、硬脂酸镁、硝酸钙、维生素和矿物质。

制品，例如含有本发明组合物(例如，食品、膳食补充剂、药物)和标签的包装产品也在本发明范围内，所述标签显示本发明化合物的存在或增强量的本发明化合物，或指导使用本发明组合物用于治疗与升高的精氨酸酶水平和/或活性相关的病症。所述包装产品可含有本发明组合物和降低精氨酸酶水平和/或活性的使用说明书。所述标签和/或使用说明书可提及本申请所述的任何使用方法。

本发明还涉及制备包含本文所述的任何组合物的制品的方法、包装该组合物以获得制品的方法，以及说明、指导或促进该组合物/制品用于本文所述的任何用途的方法。此类说明、指导或促进包括广告。

以下非限制性实施例进一步描述本发明。

实施例

实施例1：可可黄烷醇体内和体外降低精氨酸酶活性和精氨酸酶水平

材料和方法

材料：除非另有说明，化学品购自Sigma(Deisenhofen，德国)。代谢物混合物共计含有总黄烷醇2.6μmol/L，其由(-)-表儿茶素(0.1μmol/l)和儿茶素(0.4μmol/l)以及黄烷醇代谢物表儿茶素-7-β-D-葡糖苷酸(0.25μmol/l)、4′-O-甲基-表儿茶素(0.2μmol/l)、4′-O-甲基-表儿茶素-β-D-葡糖苷酸(1.7μmol/l)组成。各黄烷醇的浓度相当于摄入含有高水平黄烷醇的可可饮料(917mg)后两小时的血浆浓度(Schroeter H.等，2006，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，103：1024-1029，通过引用纳入本文)。

研究规程：在有10个健康志愿者的组中测定高水平或低水平黄烷醇(包括低聚物，组成示于下表a中)的可可饮料的影响。排除标准是吸烟、高血压、糖尿病和终末期肾衰竭。两天中，在摄入高水平黄烷醇(902.1mg)饮料或作为对照的低水平黄烷醇(36.4mg)饮料之前、之后2小时和24小时测定精氨酸酶活性。高水平黄烷醇饮料含有单体至十聚体形式的黄烷醇和原花青素，如下表b所示。在早上即12小时禁食期后研究这些个体。为避免累加效应，各次研究之间以大于6天的清除(wash-out)期相隔。

表a：可可饮料的组成

矿物质

表b：CP组成

细胞培养：人脐带静脉内皮细胞购自Promo Cell，(海德堡，德国)，最多传至两代。

定量基因表达分析：在

(Roche Diagnostics，Mannheim，德国)上进行实时RT-PCR，反应总体积为20μl，含有2μl cDNA、2μl快速启动反应混合物SYBR Green I、1.6μl 25mM MgCl₂、2μl各5pmol/μl引物和10.4μl H₂O。HepG2细胞、人肝细胞系用作阳性对照。对于阴性对照，使用同样的RNA制备但省略反转录步骤。循环步骤结束之后，使样品经历温度梯度(ramp)，同时连续进行荧光监控，用于熔融曲线分析。对于每一种PCR产物(除引物二聚体之外)，通过特定熔融温度处的熔融曲线分析，获得单一的狭窄峰，通过琼脂糖凝胶电泳仅观察到预期大小的单条带，表明进行了特异性扩增而无显著的副产物。相应地对样品定量(LightCycler分析软件，版本3.5)，使用持家基因GAPDH作为标准品。

精氨酸酶活性：通过差速离心从静脉血中分离红细胞，分离后立即根据相应方法(Corraliza I.M.等，1994，J.Immunol.Methods 174：231-235)测定精氨酸酶活性。裂解HUVEC细胞并与10mM MnCl₂于55℃温育10分钟。然后加入1体积的0.5M L-精氨酸，37℃温育60分钟。通过加入800μl酸混合物(H₂SO₄∶H₃PO₄∶H₂O＝1∶3∶7)终止反应，加入50μl 9％α异亚硝基苯丙酮(ISPF)并96℃加热45分钟后，540nm处比色定量测定尿素。产生的尿素的量用蛋白质标准化之后，用作精氨酸酶活性的指标。对于红细胞中蛋白质浓度的测定，将裂解物1∶100稀释。按照Brown和Cohen(Brown G.W.，Jr.和Cohen，P.P.，1959，J.Biol.Chem.234：1769-1774)方法的改良方法(Ensunsa J.L.等.，2004，Exp.Biol.Med.(Maywood)229：1143-1153)在从冷冻组织块制备的肾脏匀浆中测定精氨酸酶活性。

GAPDH活性：将冷冻的肾脏组织决在10体积的冰冷缓冲液(10mMTris，pH 7.4，0.25M蔗糖，0.5mM EDTA)中匀浆，并于4℃以10,000x g离心30分钟。按照Bergmeyer(Bergmeyer H.U.，1972，《酶学分析方法(Methods of enzymatic analysis)》，第2版，Weinheim：VerlagChemie1；466-467)所述方法测定所得到的上清液中的GAPDH活性。

动物研究：从Charles River Laboratories(Wilmington，MA，美国)处获得10只雄性断奶Sprague-Dawley大鼠。大鼠独立饲养在悬吊的不锈钢笼子中，在控制温度(23℃)和光照周期(14-10小时光照-黑暗周期)的室中。6天适应期之后，将其分为两组(每组n＝5)，给予基础饲料两天，自由采食，然后给予对照饲料4天，期间喂食(5小时/天)。然后将动物随机分配到两个饮食组之一，限制采食(黑暗周期中5小时/天：早12点-5点)，基于纯化的蛋白蛋白的饲粮，该饲粮含有59.5％果糖，0％或4％的可可粉，持续28天。两组均允许随意饮用通过不锈钢给水系统提供的水。详细的饮饲组成见表1。用于该研究的可可的黄烷醇和原花青素水平特别高，含有11.0mg/g表儿茶素、2.8mg/g儿茶素和43.0mg/g原花青素。28天研究期结束时，2小时禁食后处死大鼠。用二氧化碳麻醉动物，快速切离肾脏，称重并存贮于-80℃直至分析。实验规程在实施前已获得加利福尼亚大学(戴维斯)动物使用和护理委员会的批准，并由学校兽医办公室(the Office of theCampus Veterinarian)管理。

统计学分析：数值报告为平均值±SD。利用弱化的(impaired)学生t测验进行统计学分析，p＜0.05认为显著。

结果

用黄烷醇代谢物处理减少HUVEC中精氨酸酶-2mRNA的表达

用实时PCR调查人内皮细胞中精氨酸酶-2mRNA的表达水平。用于该体外研究的黄烷醇代谢物组成和浓度相当于如方法部分所述摄入高水平黄烷醇可可后两小时的人血浆黄烷醇浓度，共计2.6μmol/L总黄烷醇，其中4′-O-甲基-表儿茶素-β-D-葡糖苷酸是主要组分(Schroeter H.等，2006，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，103：1024-1029，通过引用纳入本文)。

24小时孵育后，黄烷醇代谢物处理导致精氨酸酶-2mRNA表达降低，此外观察到孵育2小时后2.6和7.8μmol/L黄烷醇引起早期反应(图1)。与黄烷醇代谢物获得的结果一致，(-)-表儿茶素处理在24小时孵育后也导致精氨酸酶-2mRNA表达降低，但在30分钟或2小时未观察到短期影响。

(-)-表儿茶素和黄烷醇代谢物降低HUVEC中的精氨酸酶活性

在表儿茶素或黄烷醇代谢物混合物的存在下培养细胞，如方法部分所述检测精氨酸酶-2活性。如图2所示，(-)-表儿茶素处理在48小时时降低了精氨酸酶-2活性。对照细胞中的精氨酸酶活性是6.9±0.4μmol尿素x mg蛋白质^-1x h^-1，而在(-)-表儿茶素(30μM(-)-表儿茶素)处理的细胞中精氨酸酶活性剂量依赖性降低至3.3±0.2μmol尿素x mg蛋白质^-1x h^-1，与用TNF-α和IL-1β攻击的(已知该处理引起精氨酸酶表达降低(Suchek C.V.等.，2004，Curr.Mol.Med.，4：763-775))细胞中的反应(3.7±0.6μmol尿素x mg蛋白质^-1x h^-1)相当。用黄烷醇代谢物的混合物处理同样以浓度依赖性方式降低了精氨酸酶的活性。

以含有高水平黄烷醇的可可为基础的饲粮体内降低精氨酸酶活性

动物实验提供了关于黄烷醇介导的对精氨酸酶活性影响的进一步数据。对大鼠喂食含有59.5％(w/w)果糖作为碳水化合物来源，有或没有4％(w/w)富含黄烷醇的可可(表1)，含有(-)-表儿茶素及其低聚物的饲粮。这种含有高水平黄烷醇的可可的饮食干预降低了肾脏中的精氨酸酶活性，而作为对照的GAPDH活性未受影响(表2)。

含有高水平黄烷醇的可可降低人红细胞中的精氨酸酶活性

用含有高水平黄烷醇的可可饮料和相应含有低水平黄烷醇的对照饮料在健康人(n＝10)中进行的体内研究中，摄入200mL可可饮料之前、摄入后2小时和24小时检测精氨酸酶活性。与对照(3.9±0.4μmol尿素x mg蛋白质^-1x h^-1)相比，摄入含有高水平黄烷醇的可可饮料2小时后精氨酸酶活性稍有减少(平均值：3.4±0.4μmol尿素x mg蛋白质^-1x h^-1；p＜0.05)。但摄入含有高水平黄烷醇的可可饮料24小时后精氨酸酶活性减少较多(3.0±0.3μmol尿素x mg蛋白质^-1x h^-1；p＜0.05)。摄入含有低水平黄烷醇的饮料2小时后精氨酸酶活性也稍有减少(3.3±0.4vs.3.7±0.4μmol尿素x mg蛋白质^-1x h^-1；p＜0.05)，而摄入饮料24小时后精氨酸酶活性与对照相比未受显著影响(3.5±0.5μmol尿素x mg蛋白质^-1x h^-1；p＝n.s.)(图3)。

Claims

1.选自以下的化合物在制备治疗选自糖尿病相关病症的与升高的精氨酸酶水平和/或精氨酸酶活性相关的病症的组合物中的用途，所述糖尿病相关病症选自糖尿病性神经病、糖尿病性肾病、糖尿病性肾功能障碍、糖尿病足溃疡、糖尿病患者的难愈性伤口愈合和糖尿病相关的性功能障碍：表儿茶素、儿茶素、其药学上可接受的盐和其选自酯、氧化产物、衍生有糖结构部分的化合物、甲基化衍生物和葡糖苷酸化衍生物的衍生物，其中所述衍生物不是没食子酸化衍生物；和具有式A_n的高分子化合物、其药学上可接受的盐和其选自酯、氧化产物、衍生有糖结构部分的化合物、甲基化衍生物和葡糖苷酸化衍生物的衍生物；其中所述甲基化衍生物是3’O-甲基-、4’O-甲基-或3’O，4’O-二甲基-衍生物，且其中葡糖苷酸化发生在7、5和/或3’位：

其中

n是2-18的整数；

R和X各具有α或β立体化学；

R是OH、O-糖或O-没食子酸；

当任何C-4、C-6或C-8不键合于其他单体单元时，X、Y和Z是氢或糖；以及

所述糖任选被酚结构部分所取代。

2.如权利要求1所述的用途，其中所述化合物是表儿茶素和/或其药学上可接受的盐。

3.如权利要求1所述的用途，其中所述衍生物是甲基化衍生物或葡糖苷酸化衍生物，且其中所述甲基化衍生物是3’O-甲基-、4’O-甲基-或3’O，4’O-二甲基-衍生物，且其中葡糖苷酸化发生在7、5和/或3’位。

4.如权利要求3所述的用途，其中所述衍生物选自3’-O-甲基-(+)儿茶素、3’-O-甲基-(-)-表儿茶素、4’-O-甲基-(+)-儿茶素、4’-O-甲基-(-)-表儿茶素、3’-O-，4’-O-二甲基-(+)-儿茶素和3’-O-，4’-O-二甲基-(-)-表儿茶素、4’-O-甲基表儿茶素-O-β-D-葡糖苷酸、3’-O-甲基-表儿茶素-O-β-D-葡糖苷酸和表儿茶素-O-β-D葡糖苷酸。

5.如权利要求4所述的用途，其中所述衍生物选自4’-O-甲基-表儿茶素-7-O-β-D-葡糖苷酸、3’-O-甲基-表儿茶素-5/7-O-β-D-葡糖苷酸和表儿茶素-7-O-β-D-葡糖苷酸。

6.如权利要求1所述的用途，其中所述化合物是式A_n的高分子化合物或其药学上可接受的盐，其中R是OH，X、Y和Z选自单体单元A或氢。

7.如权利要求6所述的用途，其中n为2-10。

8.如权利要求7所述的用途，其中相邻的单体单元在位置(4β→6)和/或(4β→8)处结合。

9.如权利要求1所述的用途，其中所述组合物是药物组合物。

10.如权利要求1或6所述的用途，其中所述组合物是食品、宠物食品、饮料、膳食补充剂、甜食或巧克力。

11.如权利要求1所述的用途，其中以可可提取物、可可提取物级分或可可固体形式提供所述化合物。

12.如权利要求10所述的用途，其中所述可可固体是可可粉或非碱化可可固体。

13.选自以下的化合物在制备治疗选自溶血病、肺动脉高压、囊性纤维化和微循环障碍的与升高的精氨酸酶水平和/或精氨酸酶活性相关的病症的药物中的用途：表儿茶素、儿茶素、其药学上可接受的盐和其选自酯、氧化产物、衍生有糖结构部分的化合物、甲基化衍生物和葡糖苷酸化衍生物的衍生物，其中所述衍生物不是没食子酸化衍生物；和具有式A_n的高分子化合物、其药学上可接受的盐和其选自酯、氧化产物、衍生有糖结构部分的化合物、甲基化衍生物和葡糖苷酸化衍生物的衍生物；其中所述甲基化衍生物是3’O-甲基-、4’O-甲基-或3’O，4’O-二甲基-衍生物，且其中葡糖苷酸化发生在7、5和/或3’位：

其中

n是2-18的整数；

R和X各具有α或β立体化学；

R是OH、O-糖或O-没食子酸；

当任何C-4、C-6或C-8不键合于其他单体单元时，X、Y和Z是氢或糖；并且

所述糖任选在任何位置被酚结构部分所取代。