WO2017086421A1 - アルギナーゼ活性の測定方法、アルギナーゼ活性の検出キット、アルギナーゼ関連疾患検出キット、及びアルギナーゼの阻害剤又は活性剤のスクリーニング方法 - Google Patents

アルギナーゼ活性の測定方法、アルギナーゼ活性の検出キット、アルギナーゼ関連疾患検出キット、及びアルギナーゼの阻害剤又は活性剤のスクリーニング方法 Download PDF

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WO2017086421A1
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arginase
urea
reaction
solution
sample
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PCT/JP2016/084208
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Inventor
前野 恵美
Original Assignee
東京応化工業株式会社
田畑 泰彦
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring arginase activity, a kit for detecting arginase activity, a kit for detecting arginase-related diseases, and a method for screening an inhibitor or active agent for arginase.
  • the present application was filed on November 18, 2015 in Japanese Patent Application No. 2015-225939 filed in Japan, on January 29, 2016, in Japanese Patent Application No. 2016-015903 filed in Japan, on March 31, 2016, We claim priority based on PCT / JP2016 / 061637 filed with the World Intellectual Property Organization and Japanese Patent Application No. 2016-195933 filed in Japan on October 3, 2016. Incorporate.
  • Arginase is an enzyme located at the final stage of the urea cycle, converting L-arginine into L-ornithine and urea, and playing an important role in ammonium ion excretion from the body.
  • Arginase has two isoforms, type I and type II.
  • Type I is mainly present in the liver and plays an important role in the urea cycle.
  • Type II is present in organs including the kidney, and controls the concentrations of arginine and ornithine.
  • Arginase deficiency has been reported to cause serious symptoms such as neuropathy, dementia, and hyperammonemia, and measurement of arginase activity is essential for the study of urea metabolism.
  • arginase has been reported to have an anti-inflammatory action and an apoptosis (cell death) inhibitory effect of macrophages, and has recently been increasingly used as an index thereof.
  • Arginase activity was measured based on a series of enzymatic reactions in which arginase decomposes arginine into ornithine and urea, and urea further decomposes into ammonia and carbon dioxide by urease. 2) A production amount of urea, (3) a method by measurement of a production amount of ammonia, and the like (for example, see Patent Document 1).
  • Patent Document 1 the method for measuring the production amount of ornithine discloses a method for detecting ornithine by high performance liquid chromatography (HPLC), which requires a measuring instrument for HPLC, and further measures time. It takes.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the method for measuring the amount of ammonia produced requires an enzyme reaction with urease, and thus the operation becomes complicated.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a highly sensitive and simple method for measuring arginase activity.
  • a sample containing arginase and a solution containing a divalent cation are added to a reaction vessel to activate arginase, and a sample containing activated arginase is added to a reaction vessel.
  • a sample containing arginase and a solution containing a divalent cation are added to a reaction vessel to activate arginase, and a sample containing activated arginase is added to the reaction vessel.
  • a third aspect of the present invention is an arginase activity detection kit comprising an acidic solution containing ⁇ -isonitrosopropiophenone as a urea detection reagent.
  • a fourth aspect of the present invention comprises arginine, a solution containing a divalent cation, and an acidic solution having a pH of 1.0 or more and 4.0 or less containing a urea detection reagent, and detecting arginase activity It is a kit.
  • a fifth aspect of the present invention comprises an arginine, a solution containing a divalent cation, and an acidic solution having a pH of 1.0 or more and 4.0 or less containing a urea detection reagent. It is a kit.
  • a sixth aspect of the present invention is a screening method for an arginase inhibitor or activator, comprising a sample containing arginase and a divalent cation in a reaction vessel in the presence and absence of a test substance.
  • a solution to activate arginase adding an arginine solution to a sample containing activated arginase, performing an enzyme substrate reaction, and detecting a urea in the sample subjected to the enzyme substrate reaction
  • ⁇ -isonitrosopropiophenone as a reagent simultaneously performing enzyme deactivation and urea detection reaction, and detecting urea detected in the presence of the test substance in the absence of the test substance
  • the test substance is determined to be an inhibitor of arginase, and the urea detected in the presence of the test substance is not present in the presence of the test substance. If higher compared urea and detected in the lower, the test substance is a screening method characterized by comprising the step of determining that the active agents of arginase, a.
  • arginase activity can be measured with high sensitivity and ease.
  • FIG. 3 is a diagram showing the measurement results of arginase activity in Example 1. It is a figure which shows the measurement result of the arginase activity in the comparative example 1. 3 is an image showing the measurement results of arginase activity in Example 2. 6 is an image showing a measurement result of arginase activity in Comparative Example 2. It is a figure which shows the measurement result of arginase activity at the time of heating for 1 hour and 45 minutes in the urea detection reaction process in Example 3 to promote urea detection reaction.
  • the present invention adds a sample containing arginase and a solution containing a divalent cation to a reaction vessel to activate arginase, and a sample containing activated arginase. Adding an arginine solution and performing an enzyme substrate reaction; and adding an acidic solution containing a urea detection reagent to a pH of 1.0 or more and 4.0 or less to the sample subjected to the enzyme substrate reaction to deactivate the enzyme and And a step of simultaneously performing a detection reaction.
  • arginase activity can be measured with high sensitivity and ease.
  • FIG. 1 is a diagram showing a schematic configuration of a method for measuring arginase activity according to one embodiment.
  • a sample containing arginase is prepared and added to a reaction vessel together with a solution containing a divalent cation. Subsequently, in order to further increase the activity of arginase, incubation may be performed for about 10 minutes at a temperature at which the enzyme is not inactivated (for example, a temperature of 55 ° C. or higher and lower than 70 ° C.).
  • the sample containing arginase is not particularly limited.
  • body samples such as blood, saliva, tears, sweat, biological samples such as urine, suspensions of animal cells (eg, liver cells), animal cells A crushing liquid etc. are mentioned.
  • the sample containing arginase may be diluted with a buffer solution such as physiological saline or distilled water.
  • the divalent cation examples include Ca 2+ , Mg 2+ , Zn 2+ and Mn 2+ . Among these, Mn 2+ is preferable.
  • the solution containing the divalent cation is not particularly limited as long as the salt or hydrate containing the divalent cation is dissolved. Further, it may be diluted with a buffer solution such as physiological saline or distilled water.
  • the enzyme activity of arginase can be increased by adding a solution containing a divalent cation to a sample containing arginase.
  • the concentration of the divalent cation in the solution may be, for example, from 1 mM to 100 mM, from 3 mM to 50 mM, and from 5 mM to 30 mM.
  • the reaction vessel is not particularly limited as long as it can measure arginase activity, and examples thereof include glass, metal, and plastic.
  • limiting in particular in the shape of reaction container For example, a glass slide shape, a microplate shape, a disk shape etc. are mentioned. Among these, since it is possible to measure a large number of samples, a microplate shape is preferable.
  • the microplate include those in which an arbitrary number of wells are arranged. Examples of the number of wells include 24, 96, 384, 1,536, etc., per plate.
  • the reaction vessel may constitute a microchannel device having a fine channel. The size of the reaction vessel may be in a range applicable to the apparatus to be used.
  • the reaction temperature is preferably 20 ° C or higher and 45 ° C or lower, more preferably 30 ° C or higher and 40 ° C or lower, and most preferably 37 ° C or higher and 40 ° C or lower.
  • the reaction time is preferably from 30 minutes to 3 hours, particularly preferably 2 hours.
  • the pH during the reaction is preferably from 8.5 to 10.5, particularly preferably from 9.0 to 10.0.
  • the arginine solution is not particularly limited as long as it contains arginine (preferably L-arginine). It can be prepared by dissolving a salt or hydrate containing arginine in a solvent such as distilled water. Further, it may be diluted with a buffer solution such as physiological saline or distilled water.
  • the urea detection reagent is not particularly limited as long as urea can be detected.
  • ⁇ -diketone p-dimethylaminobenzaldehyde, xanthohydrol and the like can be mentioned. Of these, ⁇ -diketones are preferred.
  • the ⁇ -diketone include ⁇ -isonitrosopropiophenone and diacetyl monooxime. Of these, ⁇ -isonitrosopropiophenone is preferable.
  • the acidic solution having a pH of 1.0 or more and 4.0 or less is not particularly limited as long as the pH can be adjusted within the above range.
  • the acid that can be used include hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, nitric acid, salts and hydrates thereof, and the like.
  • a mixture of two or more of the above acids may be used. Further, it may be diluted with a buffer solution such as physiological saline or distilled water.
  • the enzyme By mixing the urea detection reagent and the acidic solution having a pH of 1.0 or more and 4.0 or less in advance, the enzyme can be deactivated and urea can be detected in one operation. it can. Moreover, the addition amount of a solution can be decreased and the variation in the addition amount of a urea detection reagent can be reduced. Moreover, an enzyme reaction and enzyme deactivation can fully be performed by combining the acidic solution containing a urea detection reagent and having a pH within the above range and the subsequent heating in the urea detection reaction promoting step.
  • An acidic solution having a pH of 1.0 or more and 4.0 or less containing the urea detection reagent can be prepared, for example, by the following method. First, a urea detection reagent, an acid, a salt or hydrate thereof, and a buffer solution such as physiological saline or distilled water are mixed if necessary. Furthermore, when the urea detection reagent is relatively difficult to dissolve in the acidic solution, it is preferable to heat at the time of mixing. By heating, the urea detection reagent can be completely dissolved, and an acidic solution having a pH of 1.0 or more and 4.0 or less containing the urea detection reagent can be prepared.
  • the concentration of the urea detection reagent in the solution is preferably 0.05% by weight or more and 1.00% by weight or less, more preferably 0.08% by weight or more and 0.70% by weight or less, and 0.10%. More preferably, it is at least 0.66% by weight.
  • the urea detection reaction may be promoted by incubating with heating after the addition of an acidic solution having a pH of 1.0 or more and 4.0 or less containing the urea detection reagent.
  • the heating temperature is preferably from room temperature to 100 ° C, particularly preferably from 90 ° C to 100 ° C. As heating time, it is 30 minutes or more, and 30 minutes or more and 12 hours or less are especially preferable. The heating temperature and the heating time can be appropriately adjusted according to the content of arginase. Moreover, by incubating with heating, the reaction by the urea detection reagent can be promoted, and detection can be performed earlier.
  • the detection of urea can be performed using a colorimetric method utilizing a reaction between urea and a urea detection reagent.
  • a colorimetric method utilizing a reaction between urea and a urea detection reagent.
  • the measuring device is not particularly limited as long as it can measure absorbance.
  • an absorptiometer spectrophotometer
  • a microplate reader etc. are mentioned.
  • the protein concentration in the sample may be measured to calibrate the measured value of arginase activity.
  • the protein concentration measurement method is not particularly limited, and examples thereof include an ultraviolet absorption method, a Bradford method (Coomassie blue method), a Lowry method (phenol reagent method), and a bicinchoninic acid method (BCA method).
  • the present invention adds a sample containing arginase and a solution containing a divalent cation to a reaction vessel to activate arginase, and a sample containing activated arginase. Adding an arginine solution to perform the enzyme substrate reaction, and adding an acidic solution containing ⁇ -isonitrosopropiophenone as a urea detection reagent to the sample subjected to the enzyme substrate reaction to inactivate the enzyme and detect urea And a step of simultaneously performing the reaction.
  • arginase activity can be measured with high sensitivity and ease.
  • the arginase activation step and the enzyme substrate reaction step may be performed in the same manner as in the above ⁇ Method for measuring arginase activity (1)>.
  • the pH of the acidic solution may be 4.0 or less, and a highly acidic solution that is difficult to measure with a pH meter of a glass electrode may be used.
  • the acid that can be used include hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, nitric acid, salts and hydrates thereof, and the like.
  • a mixture of two or more of the above acids may be used. Further, it may be diluted with a buffer solution such as physiological saline or distilled water.
  • the enzyme By mixing ⁇ -isonitrosopropiophenone and the acidic solution in advance, the enzyme can be deactivated and the urea can be detected in a single operation, so that the operation can be made more efficient. Moreover, the addition amount of a solution can be decreased and the variation in the addition amount of a urea detection reagent can be reduced. Further, by combining an acidic solution containing ⁇ -isonitrosopropiophenone as the urea detection reagent and the subsequent heating in the urea detection reaction promotion step, the enzyme reaction and enzyme deactivation can be sufficiently performed.
  • An acidic solution containing ⁇ -isonitrosopropiophenone as a urea detection reagent can be prepared, for example, by the following method. First, ⁇ -isonitrosopropiophenone, an acid, a salt or hydrate thereof, and, if necessary, a buffer solution such as physiological saline or distilled water are mixed. Furthermore, when ⁇ -isonitrosopropiophenone is relatively difficult to dissolve in an acidic solution, it is preferable to heat at the time of mixing. By heating, ⁇ -isonitrosopropiophenone can be completely dissolved, and an acidic solution containing ⁇ -isonitrosopropiophenone as the urea detection reagent can be prepared.
  • the concentration of the urea detection reagent in the solution is preferably 0.05% by weight or more and 1.00% by weight or less, more preferably 0.08% by weight or more and 0.70% by weight or less, and 0.10%. More preferably, it is at least 0.66% by weight.
  • the subsequent urea detection reaction promoting step may be performed in the same manner as in the above ⁇ Method for measuring arginase activity (1)>.
  • a measurement value calibration step may be provided, which may be performed in the same manner as the above ⁇ Method for measuring arginase activity (1)>.
  • the measurement method of the present embodiment can be efficiently measured using a small amount of sample and reagent. Further, conventionally, there has been a problem that the urea detection reagent discolors with time and the background becomes high. However, in the measurement method of the present embodiment, an acidic solution within the above pH range containing the urea detection reagent is previously stored. It is possible to make a measurement, and it is possible to measure in a state where the background is low with high sensitivity. Therefore, conventionally, measurement of several tens of samples is limited in one analysis, whereas the measurement method of the present embodiment can measure a large number of samples of several hundred samples or more.
  • the present invention provides a detection kit for arginase activity comprising an acidic solution comprising ⁇ -isonitrosopropiophenone as a urea detection reagent.
  • arginase activity can be detected with high sensitivity and ease.
  • the acidic solution contains ⁇ -isonitrosopropiophenone as a urea detection reagent.
  • the pH of the acidic solution may be 4.0 or less, and a highly acidic solution that is difficult to measure with a glass electrode pH meter may be used.
  • the acid that can be used include hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, nitric acid, salts and hydrates thereof, and the like.
  • a mixture of two or more of the above acids may be used. Further, it may be diluted with a buffer solution such as physiological saline or distilled water.
  • the enzyme can be deactivated and urea can be detected in one operation, thus improving the efficiency of the operation. Can do. Moreover, the addition amount of a solution can be decreased and the variation in the addition amount of a urea detection reagent can be reduced. In addition, by combining an acidic solution containing ⁇ -isonitrosopropiophenone as the urea detection reagent with heating for promoting the urea detection reaction, the enzyme reaction and enzyme deactivation can be sufficiently performed.
  • the present invention provides an arginase activity detection kit comprising a solution containing arginine, a divalent cation, and an acidic solution having a pH of 1.0 or more and 4.0 or less containing a urea detection reagent. .
  • arginase activity can be detected with high sensitivity and ease.
  • arginine is not particularly limited as long as it can be decomposed by arginase as a substrate, but is preferably L-arginine.
  • Arginine may be a salt or a hydrate.
  • arginine may be a powder or a solution diluted with an appropriate solvent (for example, a buffer solution such as physiological saline, distilled water, etc.).
  • examples of the divalent cation include the same ones as described above, and among these, Mn 2+ is preferable.
  • the solution containing the divalent cation is not particularly limited as long as the salt or hydrate containing the divalent cation is dissolved. Further, it may be diluted with a buffer solution such as physiological saline or distilled water.
  • the enzyme activity of arginase can be increased by adding a solution containing a divalent cation to a sample containing arginase.
  • the urea detection reagent is not particularly limited as long as urea can be detected, and is the same as that exemplified in the above ⁇ Method for measuring arginase activity (1)>. Is mentioned. Of these, ⁇ -isonitrosopropiophenone is preferable.
  • the acidic solution having a pH of 1.0 or more and 4.0 or less is not particularly limited as long as the pH can be adjusted within the above range.
  • the acid that can be used include hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, nitric acid, salts and hydrates thereof, and the like.
  • a mixture of two or more of the above acids may be used. Further, it may be diluted with a buffer solution such as physiological saline or distilled water.
  • the enzyme can be deactivated and the urea can be detected in a single operation, thereby improving the efficiency of the operation. be able to.
  • the addition amount of a solution can be decreased and the variation in the addition amount of a urea detection reagent can be reduced.
  • an enzyme reaction and enzyme deactivation can be sufficiently performed by combining an acidic solution containing a urea detection reagent and having a pH within the above range and heating for promoting the urea detection reaction.
  • the present invention provides an arginase-related disease detection kit comprising arginine, a solution containing a divalent cation, and an acidic solution having a pH of 1.0 or more and 4.0 or less containing a urea detection reagent. .
  • an arginase-related disease can be detected with high sensitivity and ease.
  • examples of the “arginase-related disease” include heart disease, systemic hypertension, pulmonary hypertension, ischemia reperfusion injury, peripheral vascular disease, peripheral arterial disease, subarachnoid hemorrhage, erectile dysfunction, autoimmunity Encephalomyelitis, chronic renal failure, gastrointestinal dysfunction, gastric cancer, decreased hepatic blood flow, insufficient hepatic blood flow, cerebral vasospasm, or combinations thereof.
  • arginine is not particularly limited in terms of origin as long as arginase can be decomposed as a substrate, but L-arginine is preferable.
  • Arginine may be a salt or a hydrate.
  • arginine may be a powder or a solution diluted with an appropriate solvent (for example, a buffer solution such as physiological saline, distilled water, etc.).
  • examples of the divalent cation include those described above, and among these, Mn 2+ is preferable.
  • the solution containing the divalent cation is not particularly limited as long as the salt or hydrate containing the divalent cation is dissolved. Further, it may be diluted with a buffer solution such as physiological saline or distilled water.
  • the enzyme activity of arginase can be increased by adding a solution containing a divalent cation to a sample containing arginase.
  • the urea detection reagent is not particularly limited as long as urea can be detected, and is exemplified in the above ⁇ Method for measuring arginase activity (1)>. The same thing is mentioned. Of these, ⁇ -isonitrosopropiophenone is preferable.
  • the acidic solution having a pH of 1.0 or more and 4.0 or less is not particularly limited as long as the pH can be adjusted to the above range.
  • the acid that can be used include hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, nitric acid, salts and hydrates thereof, and the like.
  • a mixture of two or more of the above acids may be used. Further, it may be diluted with a buffer solution such as physiological saline or distilled water.
  • the enzyme can be deactivated and the urea can be detected in a single operation, thereby improving the efficiency of the operation. be able to. Moreover, the addition amount of a solution can be decreased and the variation in the addition amount of a urea detection reagent can be reduced. Moreover, by making pH into the said range, an enzyme reaction and inactivation of an enzyme can fully be performed.
  • the present invention comprises a step of activating arginase by adding a sample containing arginase and a solution containing a divalent cation to a reaction vessel in the presence and absence of a test substance. Adding an arginine solution to a sample containing activated arginase and performing an enzyme substrate reaction; and an acid solution containing ⁇ -isonitrosopropiophenone as a urea detection reagent on the sample subjected to the enzyme substrate reaction.
  • the enzyme When the enzyme is deactivated and the urea detection reaction is performed simultaneously, and the urea detected in the presence of the test substance is lower than the urea detected in the absence of the test substance
  • the test substance is an inhibitor of arginase
  • the urea detected in the presence of the test substance is higher than the urea detected in the absence of the test substance.
  • the said test substance comprises a step of determining that the active agents of arginase, and provides a screening method.
  • an arginase inhibitor or activator can be screened easily.
  • a sample containing arginase is prepared in the presence and absence of a test substance, and added to a reaction vessel together with a solution containing a divalent cation. Subsequently, in order to further increase the activity of arginase, incubation may be performed for about 10 minutes at a temperature at which the enzyme is not inactivated (for example, a temperature of 55 ° C. or higher and lower than 70 ° C.).
  • the “test compound” is not particularly limited.
  • the sample containing arginase is not particularly limited, and examples thereof include those exemplified in the above ⁇ Method for measuring arginase activity (1)>.
  • the divalent cation examples include those similar to those exemplified in the above ⁇ Method for measuring arginase activity (1)>. Among these, Mn 2+ is preferable.
  • the solution containing the divalent cation is not particularly limited as long as the salt or hydrate containing the divalent cation is dissolved. Further, it may be diluted with a buffer solution such as physiological saline or distilled water.
  • the enzyme activity of arginase can be increased by adding a solution containing a divalent cation to a sample containing arginase.
  • the concentration of the divalent cation in the solution may be, for example, from 1 mM to 100 mM, from 3 mM to 50 mM, and from 5 mM to 30 mM.
  • the reaction vessel is not particularly limited as long as it can measure arginase activity, and examples thereof include the same as those exemplified in the above ⁇ Method for measuring arginase activity (1)>.
  • the shape of the reaction vessel is not particularly limited, and examples thereof include those exemplified in the above ⁇ Method for measuring arginase activity (1)>. Among these, since it is possible to measure a large number of samples, a microplate shape is preferable. Examples of the microplate include those in which an arbitrary number of wells are arranged. Examples of the number of wells include 24, 96, 384, 1,536, etc., per plate.
  • the reaction vessel may constitute a microchannel device having a fine channel. The size of the reaction vessel may be in a range applicable to the apparatus to be used.
  • the reaction temperature is preferably 20 ° C or higher and 45 ° C or lower, more preferably 30 ° C or higher and 40 ° C or lower, and most preferably 37 ° C or higher and 40 ° C or lower.
  • the reaction time is preferably from 30 minutes to 3 hours, particularly preferably 2 hours.
  • the pH during the reaction is preferably from 8.5 to 10.5, particularly preferably from 9.0 to 10.0.
  • the arginine solution is not particularly limited as long as it contains arginine (preferably L-arginine). It can be prepared by dissolving a salt or hydrate containing arginine in a solvent such as distilled water. Further, it may be diluted with a buffer solution such as physiological saline or distilled water.
  • the acidic solution contains ⁇ -isonitrosopropiophenone as a urea detection reagent.
  • the pH of the acidic solution may be 4.0 or less, and a highly acidic solution that is difficult to measure with a pH meter of a glass electrode may be used.
  • Examples of the acid that can be used include the same acids as those exemplified above in ⁇ Method for Measuring Arginase Activity (1)>. A mixture of two or more of the above acids may be used. Further, it may be diluted with a buffer solution such as physiological saline or distilled water.
  • an acidic solution containing ⁇ -isonitrosopropiophenone as the urea detection reagent By mixing in advance an acidic solution containing ⁇ -isonitrosopropiophenone as the urea detection reagent, enzyme deactivation and urea detection can be performed in a single operation, so that the operation can be made more efficient. Moreover, the addition amount of a solution can be decreased and the variation in the addition amount of a urea detection reagent can be reduced. In addition, by combining an acidic solution containing ⁇ -isonitrosopropiophenone as the urea detection reagent with heating for promoting the urea detection reaction, the enzyme reaction and enzyme deactivation can be sufficiently performed.
  • An acidic solution containing ⁇ -isonitrosopropiophenone as the urea detection reagent can be prepared by the following method, for example. First, ⁇ -isonitrosopropiophenone, an acid, a salt or hydrate thereof, and, if necessary, a buffer solution such as physiological saline or distilled water are mixed. Furthermore, when ⁇ -isonitrosopropiophenone is relatively difficult to dissolve in an acidic solution, it is preferable to heat at the time of mixing. By heating, ⁇ -isonitrosopropiophenone can be completely dissolved, and an acidic solution containing ⁇ -isonitrosopropiophenone as the urea detection reagent can be prepared.
  • the concentration of the urea detection reagent in the solution is preferably 0.05% by weight or more and 1.00% by weight or less, more preferably 0.08% by weight or more and 0.70% by weight or less, and 0.10%. More preferably, it is at least 0.66% by weight.
  • the urea detection reaction may be promoted by incubation with heating.
  • the heating temperature is preferably from room temperature to 100 ° C, particularly preferably from 90 ° C to 100 ° C.
  • heating time it is 30 minutes or more, and 30 minutes or more and 12 hours or less are especially preferable.
  • the heating temperature and the heating time can be appropriately adjusted according to the content of arginase.
  • the reaction by the urea detection reagent can be promoted, and detection can be performed earlier.
  • the detection of urea can be performed using a colorimetric method utilizing a reaction between urea and a urea detection reagent.
  • a colorimetric method utilizing a reaction between urea and a urea detection reagent.
  • the measuring device is not particularly limited as long as it can measure absorbance.
  • an absorptiometer spectrophotometer
  • a microplate reader etc. are mentioned.
  • the protein concentration in the sample may be measured to calibrate the measured value of arginase activity.
  • the method for measuring the protein concentration is not particularly limited, and examples thereof include the same methods as those exemplified above in ⁇ Method for Measuring Arginase Activity (1)>.
  • the screening method of the present embodiment can efficiently measure using a small amount of sample and reagent. Further, conventionally, there has been a problem that the urea detection reagent is discolored over time and the background becomes high. However, in the screening method of the present embodiment, an acidic solution in the above pH range containing the urea detection reagent is previously added. It is possible to make a measurement, and it is possible to measure in a state where the background is low with high sensitivity. Therefore, conventionally, measurement of several tens of samples is limited in one analysis, whereas the screening method of the present embodiment can measure a large number of samples of several hundred samples or more.
  • test substance is determined to be an inhibitor of arginase. can do.
  • the test substance is determined to be an arginase activator. be able to.
  • Example 1 Arginase activation step 20 ⁇ L of a mixed solution of 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 10 mM MnCl 2 was dispensed into a microplate using a multipipette. Subsequently, animal cells were disrupted using a mixed solution of 0.1% Triton X100 and Proteinase Inhibitor mixture to prepare a cell disruption solution as a sample containing arginase. Subsequently, 20 ⁇ L of the prepared cell disruption solution was added to the microplate by a multipipette. Subsequently, arginase was activated by incubation at 56 ° C. for 10 minutes.
  • the negative control (Negative control) was obtained by performing an enzyme substrate reaction and urea detection reaction using a cell disruption solution to which an arginase activity inhibitor was added, and a sample (Sample). ) Shows an enzyme substrate reaction and urea detection reaction using a cell disruption solution to which an arginase activity promoting factor and an arginase activity inhibiting factor were added.
  • the negative control (Negative control) was obtained by performing an enzyme substrate reaction and urea detection reaction using a cell disruption solution to which an arginase activity inhibitor was added, and a sample (Sample). ) Shows an enzyme substrate reaction and urea detection reaction using a cell disruption solution to which an arginase activity promoting factor and an arginase activity inhibiting factor were added.
  • the measured value of arginine activity of the sample was twice as high in Comparative Example 1 as compared to the measured value of arginine activity in the negative control, and was 5 times higher in Example 1. Further, in Comparative Example 1, no significant difference was obtained between the measured value of arginine activity in the control and the measured value of arginine activity in the sample, whereas in Example 1, it was significant under any condition. A difference was obtained. In the method for measuring arginase activity described in Comparative Example 1, it is presumed that the urea detection reagent changed color over time and the background increased. From the above, it was confirmed that the method for measuring arginase activity described in Example 1 has a low background and can measure arginase activity with high sensitivity.
  • Example 2 (1) Preparation of urea solution Using urea (manufactured by Nacalai Tesque), urea solutions were prepared so as to be 0, 5, 10, 20, 40, 80, and 160 ⁇ g / mL.
  • “mean” is a value obtained by calculating an average value of 8 wells at each of urea concentrations of 0, 5, 10, 20, 40, 80, and 160 ⁇ g / mL, and then dividing the average value by a standard deviation (average (Value / standard deviation) is calculated, and a value obtained by averaging the calculated seven average values / standard deviation is shown. “SD” indicates the standard deviation of the seven average values / standard deviation. Moreover, the image which image
  • Example 2 tended to have a smaller mean value compared to Comparative Example 2.
  • Comparative Example 2 the mean value varied throughout the heating time. Further, Example 2 tended to have a smaller SD value than Comparative Example 2 except for the sample heated for 8 hours. From the above, it has been clarified that the measurement method of the present invention can reduce variations in measured values.
  • Example 2 in Example 2, almost no discoloration of the urea detection reagent was observed in 8 hours, whereas in Comparative Example 2, discoloration of the urea detection reagent was confirmed in 8 hours. .
  • the ethanol solvent contained in the urea detection reagent evaporates during the dispensing operation, and the concentration of ⁇ -isonitrosopropiophenone increases, whereas in Example 2, It is presumed that the acidic solution containing the urea detection reagent is dispensed after being mixed in advance, and the ethanol solvent can be advanced to the next step without evaporating. Therefore, it was clarified that Comparative Example 2 which is a conventional measurement method has a high background, whereas the measurement method of the present invention has a low background and can detect arginase activity more accurately.
  • Example 3 (1) in arginase activation process microplate and dispensed in a multi pipetter 10 mM MnCl 2 solution by 20 [mu] L. Subsequently, RAW264 cells, which are mouse macrophages, were disrupted using a mixed solution of 0.1% Triton X100 and Proteinase Inhibitor mixture to prepare a cell disruption solution as a sample containing arginase. Subsequently, 20 ⁇ L of the prepared cell disruption solution was added to the microplate by a multipipette.
  • the control was obtained by performing an enzyme substrate reaction and urea detection reaction using a cell lysate to which nothing was added, and the positive control (Positive control) was IL- as an arginase activity promoter.
  • Samples (samples) that were subjected to enzyme substrate reaction and urea detection reaction using arginase were disrupted by adding arginase activity promoting factor (IL-4) and arginase activity inhibitory factors (LPS and IFN ⁇ ). Indicating those conducted enzyme substrate reaction and urea detection reaction by a liquid.
  • IL-4 arginase activity promoting factor
  • LPS and IFN ⁇ arginase activity inhibitory factors
  • an enzyme substrate L-arginine 40 ⁇ L + manganese chloride 20 ⁇ L
  • Samples (samples) that were subjected to enzyme substrate reaction and urea detection reaction using arginase were disrupted by adding arginase activity promoting factor (IL-4) and arginase activity inhibitory factors (LPS and IFN ⁇ ). Indicating those conducted enzyme substrate reaction and urea detection reaction by a liquid.
  • IL-4 arginase activity promoting factor
  • IFN ⁇ arginase activity inhibitory factors
  • the measured value of arginine activity in the control in Comparative Example 3 was about 75, whereas the measured value of arginine activity in the control in Example 3 was about 29 to 37 and 50 or less. From this, it is speculated that in the method for measuring arginase activity described in Comparative Example 3, the urea detection reagent was discolored as the reaction proceeded immediately after the mixing of the A reagent and B reagent, and the background increased.
  • Example 4 (1) in arginase activation process microplate and dispensed in a multi pipetter 10 mM MnCl 2 solution by 20 [mu] L. Subsequently, RAW264 cells, which are mouse macrophages, were disrupted using a mixed solution of 0.1% Triton X100 and Proteinase Inhibitor mixture to prepare a cell disruption solution as a sample containing arginase. Subsequently, 20 ⁇ L of the prepared cell disruption solution was added to the microplate by a multipipette.
  • the control was obtained by carrying out the enzyme substrate reaction and the urea detection reaction using a cell disruption solution to which nothing was added, and the positive control (Positive control) was IL- as an arginase activity promoter.
  • Samples (samples) that were subjected to enzyme substrate reaction and urea detection reaction using arginase were disrupted by adding arginase activity promoting factor (IL-4) and arginase activity inhibitory factors (LPS and IFN ⁇ ). Indicating those conducted enzyme substrate reaction and urea detection reaction by a liquid.
  • IL-4 arginase activity promoting factor
  • LPS and IFN ⁇ arginase activity inhibitory factors
  • an enzyme substrate L-arginine 40 ⁇ L + manganese chloride 20 ⁇ L
  • the preparation was added to the microplate to stop the enzyme reaction and start the urea detection reaction. Subsequently, the mixture was allowed to stand at room temperature for 10 minutes or 120 minutes for color development. Subsequently, the absorbance at 430 nm was measured using a microplate reader (Spectra Max i3, manufactured by Molecular Devices), but 0, 5, 10, 20, 40, 80, 160 ⁇ g / mL urea. A calibration curve could not be drawn with the solution.
  • a sample containing 4 types of arginase that is, a sample obtained by performing an enzyme substrate reaction and a urea detection reaction using a cell disruption solution to which nothing was added (Control), IL-4 as an arginase activity promoter Of the enzyme substrate reaction and urea detection reaction using the cell lysate added with (Positive control), cell lysate added with Lipopolysaccharide (LPS) and INTERFERON ⁇ (IFN ⁇ ) as arginase activity inhibitory factors That carried out enzyme substrate reaction and urea detection reaction (negative control (Negative control)), and arginase activity promoting factor (IL-4) and arginase activity inhibitory factor (LPS and IFN ⁇ )
  • LPS Lipopolysaccharide
  • IFN ⁇ INTERFERON ⁇
  • the prepared acidic solution containing the urea detection reagent has a storage period longer than 24 hours (for example, about several months). ) Can be used for measurement of arginase activity without any problem.
  • the acidic solution containing the urea detection reagent used in the method for measuring arginase activity described in Example 4 can be prepared in large quantities and stored for a long period of time. It was confirmed that arginase activity can be measured with low sensitivity and high sensitivity.
  • arginase activity can be measured with high sensitivity and ease.

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Abstract

本発明は、高感度で、容易且つ簡便なアルギナーゼ活性の測定方法を提供する。本発明のアルギナーゼ活性の測定方法は、反応容器に、アルギナーゼを含む試料と、2価のカチオンを含む溶液とを添加して、アルギナーゼを活性化する工程と、活性化されたアルギナーゼを含む試料に、アルギニン溶液を添加し、酵素基質反応を行う工程と、酵素基質反応を行った試料に、尿素検出試薬を含むpH1.0以上4.0以下の酸性溶液を添加し、酵素の失活及び尿素の検出反応を同時に行う工程と、を備える。

Description

アルギナーゼ活性の測定方法、アルギナーゼ活性の検出キット、アルギナーゼ関連疾患検出キット、及びアルギナーゼの阻害剤又は活性剤のスクリーニング方法
 本発明は、アルギナーゼ活性の測定方法、アルギナーゼ活性の検出キット、アルギナーゼ関連疾患検出キット、及びアルギナーゼの阻害剤又は活性剤のスクリーニング方法に関する。
 本願は、2015年11月18日に、日本に出願された特願2015-225939号、2016年1月29日に、日本に出願された特願2016-015903号、2016年3月31日、世界知的所有権機関に出願されたPCT/JP2016/061637号、及び2016年10月3日に、日本に出願された特願2016-195933号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
 アルギナーゼは、尿素回路の最終段階に位置する酵素であり、L-アルギニンをL-オルニチンと尿素に変換し、体内からのアンモニウムイオン排出に重要な役割を果たしている。また、アルギナーゼには、I型とII型という二つのアイソフォームが存在する。I型は主に肝臓に存在し、尿素回路での重要な機能を担っており、II型は腎臓をはじめとする臓器に存在し、アルギニン及びオルニチンの濃度を制御している。
 アルギナーゼの欠損は、神経障害、痴呆、高アンモニア血症といった重篤な症状を引き起こすといった報告もあり、アルギナーゼ活性の測定は尿素代謝系の研究に不可欠である。また、アルギナーゼはマクロファージの抗炎症作用及びアポトーシス(細胞死)抑制効果が報告されており、近年、その指標として利用されることが多くなっている。
 アルギナーゼの活性測定法としては、アルギナーゼがアルギニンをオルニチンと尿素とに分解し、さらに尿素はウレアーゼによってアンモニアと二酸化炭素とに分解される一連の酵素反応に基づき、(1)オルニチンの生成量、(2)尿素の生成量、(3)アンモニアの生成量の測定による方法等が挙げられる(例えば、特許文献1参照)。
特開昭63-59899号公報
 特許文献1において、(1)オルニチンの生成量を測定する方法では、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によりオルニチンを検出する方法が開示されており、HPLC用の測定機器が必要であり、さらに測定時間がかかる。また、(2)尿素の生成量を測定する方法では、市販の尿素検出用試薬が水難溶性であり、さらに操作が煩雑であるため、数十サンプルの測定が限界であり、サンプル量及び試薬量を多く必要とする。また、(3)アンモニアの生成量を測定する方法では、ウレアーゼによる酵素反応が必要となるため、操作が煩雑となる。
 本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、高感度且つ簡便なアルギナーゼ活性の測定方法を提供する。
 本発明の第1の態様は、反応容器に、アルギナーゼを含む試料と、2価のカチオンを含む溶液とを添加して、アルギナーゼを活性化する工程と、活性化されたアルギナーゼを含む試料に、アルギニン溶液を添加し、酵素基質反応を行う工程と、酵素基質反応を行った試料に、尿素検出試薬を含むpH1.0以上4.0以下の酸性溶液を添加し、酵素の失活及び尿素の検出反応を同時に行う工程と、を備えることを特徴とするアルギナーゼ活性の測定方法である。
 本発明の第2の態様は、反応容器に、アルギナーゼを含む試料と、2価のカチオンを含む溶液とを添加して、アルギナーゼを活性化する工程と、活性化されたアルギナーゼを含む試料に、アルギニン溶液を添加し、酵素基質反応を行う工程と、酵素基質反応を行った試料に、尿素検出試薬としてα-イソニトロソプロピオフェノンを含む酸性溶液を添加し、酵素の失活及び尿素の検出反応を同時に行う工程と、を備えることを特徴とするアルギナーゼ活性の測定方法である。
 本発明の第3の態様は、尿素検出試薬としてα-イソニトロソプロピオフェノンを含む酸性溶液を備えることを特徴とするアルギナーゼ活性の検出キットである。
 本発明の第4の態様は、アルギニンと、2価のカチオンを含む溶液と、尿素検出試薬を含むpH1.0以上4.0以下の酸性溶液と、を備えることを特徴とするアルギナーゼ活性の検出キットである。
 本発明の第5の態様は、アルギニンと、2価のカチオンを含む溶液と、尿素検出試薬を含むpH1.0以上4.0以下の酸性溶液と、を備えることを特徴とするアルギナーゼ関連疾患検出キットである。
 本発明の第6の態様は、アルギナーゼの阻害剤又は活性剤のスクリーニング方法であって、被検物質存在下及び非存在下において、反応容器に、アルギナーゼを含む試料と、2価のカチオンを含む溶液とを添加して、アルギナーゼを活性化する工程と、活性化されたアルギナーゼを含む試料に、アルギニン溶液を添加し、酵素基質反応を行う工程と、酵素基質反応を行った試料に、尿素検出試薬としてα-イソニトロソプロピオフェノンを添加し、酵素の失活及び尿素の検出反応を同時に行う工程と、被検物質の存在下において検出された尿素が、被検物質の非存在下において検出された尿素と比較して低かった場合に、前記被検物質はアルギナーゼの阻害剤であると判定し、被検物質の存在下において検出された尿素が、被検物質の非存在下において検出された尿素と比較して高かった場合に、前記被検物質はアルギナーゼの活性剤であると判定する工程と、を備えることを特徴とするスクリーニング方法である。
 本発明によれば、高感度且つ簡便にアルギナーゼ活性を測定することができる。
一実施形態のアルギナーゼ活性の測定方法の概略構成を示す図である。 実施例1におけるアルギナーゼ活性の測定結果を示す図である。 比較例1におけるアルギナーゼ活性の測定結果を示す図である。 実施例2におけるアルギナーゼ活性の測定結果を示す画像である。 比較例2におけるアルギナーゼ活性の測定結果を示す画像である。 実施例3における尿素検出反応工程において1時間45分加熱して尿素検出反応を促進させた際のアルギナーゼ活性の測定結果を示す図である。 実施例3における尿素検出反応工程において2時間15分加熱して尿素検出反応を促進させた際のアルギナーゼ活性の測定結果を示す図である。 比較例3における尿素検出試薬と酸性溶液とを酵素失活及び尿素検出反応工程の直前に混合し、酵素失活及び尿素検出反応工程において室温で10分間静置して発色させた際のアルギナーゼ活性の測定結果を示す図である。 比較例3における尿素検出試薬と酸性溶液とを酵素失活及び尿素検出反応工程の直前に混合し、酵素失活及び尿素検出反応工程において室温で120分間静置して発色させた際のアルギナーゼ活性の測定結果を示す図である。 実施例4における調製から24時間後の尿素検出試薬を含む酸性溶液を用いて、尿素検出反応工程において1時間45分加熱して尿素検出反応を促進させた際のアルギナーゼ活性の測定結果を示す図である。 実施例4における調製から24時間後の尿素検出試薬を含む酸性溶液を用いて、尿素検出反応工程において2時間15分加熱して尿素検出反応を促進させた際のアルギナーゼ活性の測定結果を示す図である。
<アルギナーゼ活性の測定方法(1)>
 一実施形態において、本発明は、反応容器に、アルギナーゼを含む試料と、2価のカチオンを含む溶液とを添加して、アルギナーゼを活性化する工程と、活性化されたアルギナーゼを含む試料に、アルギニン溶液を添加し、酵素基質反応を行う工程と、酵素基質反応を行った試料に、尿素検出試薬を含むpH1.0以上4.0以下の酸性溶液を添加し、酵素の失活及び尿素の検出反応を同時に行う工程と、を備える、アルギナーゼ活性の測定方法を提供する。
 本実施形態の測定方法によれば、高感度且つ簡便にアルギナーゼ活性を測定することができる。
 本実施形態の測定方法について、図を参照しながら説明する。図1は、一実施形態のアルギナーゼ活性の測定方法の概略構成を示す図である。
[アルギナーゼ活性化工程]
 まず、アルギナーゼを含む試料を調製し、2価のカチオンを含む溶液と共に反応容器に添加する。続いて、アルギナーゼの活性をより高めるために、酵素が失活しない程度の温度(例えば、55℃以上70℃未満の温度等)で、10分程度インキュベートしてもよい。
 アルギナーゼを含む試料としては、特別な限定はないが、例えば血液、唾液、涙液、汗等の体液、尿などの生体試料、動物細胞(例えば、肝臓細胞等)の懸濁液、動物細胞の破砕液等が挙げられる。アルギナーゼを含む試料は、生理食塩水等の緩衝液又は蒸留水等で希釈されたものであってもよい。
 2価のカチオンとしては、例えばCa2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+等が挙げられる。中でも、Mn2+であることが好ましい。2価のカチオンを含む溶液としては、上記2価のカチオンを含む塩又は水和物等が溶解したものであればよく、特別な限定はない。さらに、生理食塩水等の緩衝液又は蒸留水等で希釈されたものであってもよい。アルギナーゼを含む試料に、2価のカチオンを含む溶液を添加することにより、アルギナーゼの酵素活性を高めることができる。
 溶液中の2価のカチオンの濃度としては、例えば1mM以上100mM以下であってよく、3mM以上50mM以下であってよく、5mM以上30mM以下であってよい。
 反応容器としては、アルギナーゼ活性を測定することができるものであれば、特別な限定はなく、例えばガラス、金属、プラスチック等が挙げられる。反応容器の形状には、特に制限はなく、例えばスライドガラス状、マイクロプレート状、円盤状等が挙げられる。
 中でも、多数の試料を測定することが可能であることから、マイクロプレート状であることが好ましい。マイクロプレートとしては、任意の数のウェルが配置されているものが挙げられる。ウェルの数としては、プレート1枚当たり、例えば、24、96、384、1,536個等が挙げられる。反応容器は、微細な流路を備えたマイクロ流路デバイスを構成していてもよい。反応容器のサイズは、使用する装置に適用できる範囲であれば構わない。
[酵素基質反応工程]
 次に、活性化されたアルギナーゼを含む試料に、基質としてアルギニン溶液を添加し、酵素基質反応を行う。反応温度は、20℃以上45℃以下が好ましく、30℃以上40℃以下がより好ましく、37℃以上40℃以下が最も好ましい。反応時間は、30分以上3時間以下が好ましく、2時間が特に好ましい。反応時のpHは、pH8.5以上10.5以下が好ましく、pH9.0以上10.0以下が特に好ましい。
 アルギニン溶液としては、アルギニン(好ましくは、L-アルギニン)を含む溶液であればよく、特別な限定はない。アルギニンを含む塩又は水和物を蒸留水等の溶媒に溶解することで調製することができる。さらに、生理食塩水等の緩衝液又は蒸留水等で希釈されたものであってもよい。
[酵素失活及び尿素検出反応工程]
 次に、酵素基質反応を行った試料に、尿素検出試薬を含むpH1.0以上4.0以下の酸性溶液を添加し、酵素の失活及び尿素の検出反応を同時に行う。
尿素検出試薬としては、尿素を検出できるものであれば、特別な限定はない。例えば、α-ジケトン、p-ジメチルアミノベンツアルデヒド、キサントヒドロール等が挙げられる。中でも、α-ジケトンが好ましい。α-ジケトンとしては、例えば、α-イソニトロソプロピオフェノン、ジアセチルモノオキシム等が挙げられる。中でも、α-イソニトロソプロピオフェノンが好ましい。
 pH1.0以上4.0以下の酸性溶液としては、pHを上記範囲に調整できるものであれば特別な限定はない。使用可能な酸としては、例えば塩酸、リン酸、硫酸、硝酸、それらの塩又は水和物等が挙げられる。上記酸を2種類以上混合したものでもよい。さらに、生理食塩水等の緩衝液又は蒸留水等で希釈されたものであってもよい。
 上記尿素検出試薬及び上記pH1.0以上4.0以下の酸性溶液を予め混合しておくことにより、酵素の失活及び尿素の検出を1回の作業で行えるため、作業を効率化することができる。また、溶液の添加量を少なくすることができ、さらに尿素検出試薬の添加量のばらつきを低減することができる。また、尿素検出試薬を含み、pHが上記範囲内である酸性溶液と、続く尿素検出反応促進工程における加熱とを組み合わせることにより、酵素反応及び酵素の失活を十分に行うことができる。
 上記尿素検出試薬を含むpH1.0以上4.0以下の酸性溶液は、例えば以下のような方法で調製することができる。まず、尿素検出試薬と、酸、それらの塩又は水和物と、必要であれば生理食塩水等の緩衝液又は蒸留水等とを混合する。さらに、尿素検出試薬が酸性溶液に比較的溶解しにくい場合、混合時に加熱することが好ましい。加熱することで、尿素検出試薬を完全に溶解させることができ、上記尿素検出試薬を含むpH1.0以上4.0以下の酸性溶液を調製することができる。
 溶液中の尿素検出試薬の濃度は、0.05重量%以上1.00重量%以下であることが好ましく、0.08重量%以上0.70重量%以下であることがより好ましく、0.10重量%以上0.66重量%以下であることがさらに好ましい。
[尿素検出反応促進工程]
 上記尿素検出試薬を含むpH1.0以上4.0以下の酸性溶液の添加後に、加熱しながらインキュベートすることで尿素検出反応を促進させてもよい。加熱温度としては、室温以上100℃以下が好ましく、90℃以上100℃以下が特に好ましい。加熱時間としては、30分以上であり、30分以上12時間以下が特に好ましい。加熱温度及び加熱時間はアルギナーゼの含有量に応じて、適宜調節することができる。また、加熱しながらインキュベートすることで、尿素検出試薬による反応を促進し、より早く検出を行うことができる。
 尿素の検出は、尿素と尿素検出試薬との反応を利用した比色法を用いて行うことができる。反応が進み、十分に発色したら、測定装置にセットして吸光度を測定する。測定装置としては、吸光度を測定できるものであれば、特別な限定はない。例えば、吸光光度計(分光光度計)、マイクロプレートリーダー等が挙げられる。
[測定値校正工程]
 さらに、試料内のタンパク質濃度を測定し、アルギナーゼ活性の測定値を校正してもよい。
 タンパク質濃度の測定方法としては、特別な限定はなく、例えば紫外吸収法、Bradford法(クマシーブルー法)、Lowry法(フェノール試薬法)、ビシンコニン酸法(BCA法)等が挙げられる。
 試料内のタンパク質濃度を測定し、測定値を校正することで、より正確なアルギナーゼ活性の測定値を得ることができる。
<アルギナーゼ活性の測定方法(2)>
 一実施形態において、本発明は、反応容器に、アルギナーゼを含む試料と、2価のカチオンを含む溶液とを添加して、アルギナーゼを活性化する工程と、活性化されたアルギナーゼを含む試料に、アルギニン溶液を添加し、酵素基質反応を行う工程と、酵素基質反応を行った試料に、尿素検出試薬としてα-イソニトロソプロピオフェノンを含む酸性溶液を添加し、酵素の失活及び尿素の検出反応を同時に行う工程と、を備える、アルギナーゼ活性の測定方法を提供する。
 本実施形態の測定方法によれば、高感度且つ簡便にアルギナーゼ活性を測定することができる。
 本実施形態の測定方法において、アルギナーゼ活性化工程及び酵素基質反応工程については、上述の<アルギナーゼ活性の測定方法(1)>と同様に行えばよい。
[酵素失活及び尿素検出反応工程]
 次に、酵素基質反応を行った試料に、尿素検出試薬としてα-イソニトロソプロピオフェノンを含む酸性溶液を添加し、酵素の失活及び尿素の検出反応を同時に行う。
 酸性溶液のpHは4.0以下であればよく、ガラス電極のpHメーターでは計測することが難しい酸性度の強い溶液を用いてもよい。使用可能な酸としては、例えば塩酸、リン酸、硫酸、硝酸、それらの塩又は水和物等が挙げられる。上記酸を2種類以上混合したものでもよい。さらに、生理食塩水等の緩衝液又は蒸留水等で希釈されたものであってもよい。
 α-イソニトロソプロピオフェノン及び上記酸性溶液を予め混合しておくことにより、酵素の失活及び尿素の検出を1回の作業で行えるため、作業を効率化することができる。
また、溶液の添加量を少なくすることができ、さらに尿素検出試薬の添加量のばらつきを低減することができる。また、上記尿素検出試薬としてα-イソニトロソプロピオフェノンを含む酸性溶液と、続く尿素検出反応促進工程における加熱とを組み合わせることにより、酵素反応及び酵素の失活を十分に行うことができる。
 尿素検出試薬としてα-イソニトロソプロピオフェノンを含む酸性溶液は、例えば以下のような方法で調製することができる。まず、α-イソニトロソプロピオフェノンと、酸、それらの塩又は水和物と、必要であれば生理食塩水等の緩衝液又は蒸留水等とを混合する。さらに、α-イソニトロソプロピオフェノンが酸性溶液に比較的溶解しにくい場合、混合時に加熱することが好ましい。加熱することで、α-イソニトロソプロピオフェノンを完全に溶解させることができ、上記尿素検出試薬としてα-イソニトロソプロピオフェノンを含む酸性溶液を調製することができる。
 溶液中の尿素検出試薬の濃度は、0.05重量%以上1.00重量%以下であることが好ましく、0.08重量%以上0.70重量%以下であることがより好ましく、0.10重量%以上0.66重量%以下であることがさらに好ましい。
 続く、尿素検出反応促進工程については、上述の<アルギナーゼ活性の測定方法(1)>と同様に行えばよい。また、本実施形態の測定方法において、測定値校正工程を備えていてもよく、上述の<アルギナーゼ活性の測定方法(1)>と同様に行えばよい。
 本実施形態の測定方法は、上記に示したとおり、少量の試料及び試薬を用いて、効率的に測定することが可能である。また、従来では、尿素検出試薬が経時的に変色し、バックグラウンドが高くなってしまう問題があったが、本実施形態の測定方法では、尿素検出試薬を含む上記pH範囲内の酸性溶液を予め作り置きすることができ、さらに感度良くバックグラウンドが低い状態で測定することが可能である。よって、従来では、一度の分析において、数十サンプルの測定が限界であったのに対し、本実施形態の測定方法では、数百サンプル以上の多数の試料を測定することができる。
<アルギナーゼ活性の検出キット(1)>
 一実施形態において、本発明は、尿素検出試薬としてα-イソニトロソプロピオフェノンを含む酸性溶液を備える、アルギナーゼ活性の検出キットを提供する。
 本実施形態の検出キットによれば、高感度且つ簡便にアルギナーゼ活性を検出することができる。
 本実施形態の検出キットにおいて、酸性溶液は、尿素検出試薬としてα-イソニトロソプロピオフェノンを含む。
 本実施形態の検出キットにおいて、酸性溶液のpHは4.0以下であればよく、ガラス電極のpHメーターでは計測することが難しい酸性度の強い溶液を用いてもよい。使用可能な酸としては、例えば塩酸、リン酸、硫酸、硝酸、それらの塩又は水和物等が挙げられる。上記酸を2種類以上混合したものでもよい。さらに、生理食塩水等の緩衝液又は蒸留水等で希釈されたものであってもよい。
 上記尿素検出試薬としてα-イソニトロソプロピオフェノンを含む酸性溶液が予め調製された状態であることにより、酵素の失活及び尿素の検出を1回の作業で行えるため、作業を効率化することができる。また、溶液の添加量を少なくすることができ、さらに尿素検出試薬の添加量のばらつきを低減することができる。また、上記尿素検出試薬としてα-イソニトロソプロピオフェノンを含む酸性溶液と、尿素検出反応を促進させるための加熱とを組み合わせることにより、酵素反応及び酵素の失活を十分に行うことができる。
<アルギナーゼ活性の検出キット(2)>
 一実施形態において、本発明は、アルギニンと、2価のカチオンを含む溶液と、尿素検出試薬を含むpH1.0以上4.0以下の酸性溶液と、を備える、アルギナーゼ活性の検出キットを提供する。
 本実施形態の検出キットによれば、高感度且つ簡便にアルギナーゼ活性を検出することができる。
 本実施形態の検出キットにおいて、アルギニンは基質としてアルギナーゼが分解可能であるものであれば、由来等に関して、特別な限定はないが、L-アルギニンであることが好ましい。また、アルギニンは、塩又は水和物であってもよい。さらに、アルギニンは粉末であってもよく、適用な溶媒(例えば、生理食塩水等の緩衝液、蒸留水等)等で希釈した溶液であってもよい。
 本実施形態の検出キットにおいて、2価のカチオンとしては、例えば上述したものと同様のものが挙げられ、中でも、Mn2+であることが好ましい。2価のカチオンを含む溶液としては、上記2価のカチオンを含む塩又は水和物等が溶解したものであればよく、特別な限定はない。さらに、生理食塩水等の緩衝液又は蒸留水等で希釈されたものであってもよい。アルギナーゼを含む試料に、2価のカチオンを含む溶液を添加することにより、アルギナーゼの酵素活性を高めることができる。
本実施形態の検出キットにおいて、尿素検出試薬としては、尿素を検出できるものであれば、特別な限定はなく、上述の<アルギナーゼ活性の測定方法(1)>において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、α-イソニトロソプロピオフェノンが好ましい。
本実施形態の検出キットにおいて、pH1.0以上4.0以下の酸性溶液としては、pHを上記範囲に調整できるものであれば特別な限定はない。使用可能な酸としては、例えば塩酸、リン酸、硫酸、硝酸、それらの塩又は水和物等が挙げられる。上記酸を2種類以上混合したものでもよい。さらに、生理食塩水等の緩衝液又は蒸留水等で希釈されたものであってもよい。
 上記尿素検出試薬を含むpH1.0以上4.0以下の酸性溶液が予め調製された状態であることにより、酵素の失活及び尿素の検出を1回の作業で行えるため、作業を効率化することができる。また、溶液の添加量を少なくすることができ、さらに尿素検出試薬の添加量のばらつきを低減することができる。また、尿素検出試薬を含み、pHが上記範囲内である酸性溶液と、尿素検出反応を促進させるための加熱とを組み合わせることにより、酵素反応及び酵素の失活を十分に行うことができる。
<アルギナーゼ関連疾患検出キット>
 一実施形態において、本発明は、アルギニンと、2価のカチオンを含む溶液と、尿素検出試薬を含むpH1.0以上4.0以下の酸性溶液と、を備える、アルギナーゼ関連疾患検出キットを提供する。
 本実施形態のアルギナーゼ関連疾患検出キットによれば、高感度且つ簡便にアルギナーゼ関連疾患を検出することができる。
 本明細書において、「アルギナーゼ関連疾患」としては、例えば心疾患、全身性高血圧症、肺高血圧症、虚血再灌流傷害、末梢血管疾患、末梢動脈疾患、くも膜下出血、勃起機能不全、自己免疫性脳脊髄炎、慢性腎不全、胃腸運動障害、胃癌、肝血流量減少、肝血流量不足(insufficient hepatic blood flow)、脳血管攣縮、又はそれらの組み合わせ等が挙げられる。
 本実施形態のアルギナーゼ関連疾患検出キットにおいて、アルギニンは基質としてアルギナーゼが分解可能であるものであれば、由来等に関して、特別な限定はないが、L-アルギニンであることが好ましい。また、アルギニンは、塩又は水和物であってもよい。さらに、アルギニンは粉末であってもよく、適用な溶媒(例えば、生理食塩水等の緩衝液、蒸留水等)等で希釈した溶液状であってもよい。
 本実施形態のアルギナーゼ関連疾患検出キットにおいて、2価のカチオンとしては、例えば上述したものと同様のものが挙げられ、中でも、Mn2+であることが好ましい。2価のカチオンを含む溶液としては、上記2価のカチオンを含む塩又は水和物等が溶解したものであればよく、特別な限定はない。さらに、生理食塩水等の緩衝液又は蒸留水等で希釈されたものであってもよい。アルギナーゼを含む試料に、2価のカチオンを含む溶液を添加することにより、アルギナーゼの酵素活性を高めることができる。
 本実施形態のアルギナーゼ関連疾患検出キットにおいて、尿素検出試薬としては、尿素を検出できるものであれば、特別な限定はなく、上述の<アルギナーゼ活性の測定方法(1)>において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、α-イソニトロソプロピオフェノンが好ましい。
 本実施形態のアルギナーゼ関連疾患検出キットにおいて、pH1.0以上4.0以下の酸性溶液としては、pHを上記範囲に調整できるものであれば特別な限定はない。使用可能な酸としては、例えば塩酸、リン酸、硫酸、硝酸、それらの塩又は水和物等が挙げられる。上記酸を2種類以上混合したものでもよい。さらに、生理食塩水等の緩衝液又は蒸留水等で希釈されたものであってもよい。
 上記尿素検出試薬を含むpH1.0以上4.0以下の酸性溶液が予め調製された状態であることにより、酵素の失活及び尿素の検出を1回の作業で行えるため、作業を効率化することができる。また、溶液の添加量を少なくすることができ、さらに尿素検出試薬の添加量のばらつきを低減することができる。また、pHを上記範囲内にすることにより、酵素反応及び酵素の失活を十分に行うことができる。
<アルギナーゼの阻害剤又は活性剤のスクリーニング方法>
 一実施形態において、本発明は、被検物質存在下及び非存在下において、反応容器に、アルギナーゼを含む試料と、2価のカチオンを含む溶液とを添加して、アルギナーゼを活性化する工程と、活性化されたアルギナーゼを含む試料に、アルギニン溶液を添加し、酵素基質反応を行う工程と、酵素基質反応を行った試料に、尿素検出試薬としてα-イソニトロソプロピオフェノンを含む酸性溶液を添加し、酵素の失活及び尿素の検出反応を同時に行う工程と、被検物質の存在下において検出された尿素が、被検物質の非存在下において検出された尿素と比較して低かった場合に、前記被検物質はアルギナーゼの阻害剤であると判定し、被検物質の存在下において検出された尿素が、被検物質の非存在下において検出された尿素と比較して高かった場合に、前記被検物質はアルギナーゼの活性剤であると判定する工程と、を備える、スクリーニング方法を提供する。
 本実施形態のスクリーニング方法によれば、簡便にアルギナーゼの阻害剤又は活性剤をスクリーニングすることができる。
[アルギナーゼ活性化工程]
 まず、被検物質存在下及び非存在下において、アルギナーゼを含む試料を調製し、2価のカチオンを含む溶液と共に反応容器に添加する。続いて、アルギナーゼの活性をより高めるために、酵素が失活しない程度の温度(例えば、55℃以上70℃未満の温度等)で、10分程度インキュベートしてもよい。
 本実施形態のスクリーニング方法において、「被験化合物」としては特別な限定はなく、例えば、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物ライブラリー、ペプチドライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞(微生物、植物細胞、動物細胞)の抽出液及び培養上清、精製又は部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物又は動物由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリー等が挙げられる。 
 アルギナーゼを含む試料としては、特別な限定はなく、上述の<アルギナーゼ活性の測定方法(1)>において例示されたものと同様のものが挙げられる。
 2価のカチオンとしては、上述の<アルギナーゼ活性の測定方法(1)>において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、Mn2+であることが好ましい。2価のカチオンを含む溶液としては、上記2価のカチオンを含む塩又は水和物等が溶解したものであればよく、特別な限定はない。さらに、生理食塩水等の緩衝液又は蒸留水等で希釈されたものであってもよい。アルギナーゼを含む試料に、2価のカチオンを含む溶液を添加することにより、アルギナーゼの酵素活性を高めることができる。
 溶液中の2価のカチオンの濃度としては、例えば1mM以上100mM以下であってよく、3mM以上50mM以下であってよく、5mM以上30mM以下であってよい。
 反応容器としては、アルギナーゼ活性を測定することができるものであれば、特別な限定はなく、上述の<アルギナーゼ活性の測定方法(1)>において例示されたものと同様のものが挙げられる。反応容器の形状には、特別な限定はなく、上述の<アルギナーゼ活性の測定方法(1)>において例示されたものと同様のものが挙げられる。
 中でも、多数の試料を測定することが可能であることから、マイクロプレート状であることが好ましい。マイクロプレートとしては、任意の数のウェルが配置されているものが挙げられる。ウェルの数としては、プレート1枚当たり、例えば、24、96、384、1,536個等が挙げられる。反応容器は、微細な流路を備えたマイクロ流路デバイスを構成していてもよい。反応容器のサイズは、使用する装置に適用できる範囲であれば構わない。
[酵素基質反応工程]
 次に、活性化されたアルギナーゼを含む試料に、基質としてアルギニン溶液を添加し、酵素基質反応を行う。反応温度は、20℃以上45℃以下が好ましく、30℃以上40℃以下がより好ましく、37℃以上40℃以下が最も好ましい。反応時間は、30分以上3時間以下が好ましく、2時間が特に好ましい。反応時のpHは、pH8.5以上10.5以下が好ましく、pH9.0以上10.0以下が特に好ましい。
 アルギニン溶液としては、アルギニン(好ましくは、L-アルギニン)を含む溶液であればよく、特別な限定はない。アルギニンを含む塩又は水和物を蒸留水等の溶媒に溶解することで調製することができる。さらに、生理食塩水等の緩衝液又は蒸留水等で希釈されたものであってもよい。
[酵素失活及び尿素検出反応工程]
 次に、酵素基質反応を行った試料に、尿素検出試薬としてα-イソニトロソプロピオフェノンを含む酸性溶液を添加し、酵素の失活及び尿素の検出反応を同時に行う。
 酸性溶液は、尿素検出試薬としてα-イソニトロソプロピオフェノンを含む。
 酸性溶液のpHは4.0以下であればよく、ガラス電極のpHメーターでは計測することが難しい酸性度の強い溶液を用いてもよい。使用可能な酸としては、上述の<アルギナーゼ活性の測定方法(1)>において例示されたものと同様のものが挙げられる。上記酸を2種類以上混合したものでもよい。さらに、生理食塩水等の緩衝液又は蒸留水等で希釈されたものであってもよい。
 上記尿素検出試薬としてα-イソニトロソプロピオフェノンを含む酸性溶液を予め混合しておくことにより、酵素の失活及び尿素の検出を1回の作業で行えるため、作業を効率化することができる。また、溶液の添加量を少なくすることができ、さらに尿素検出試薬の添加量のばらつきを低減することができる。また、上記尿素検出試薬としてα-イソニトロソプロピオフェノンを含む酸性溶液と、尿素検出反応を促進させるための加熱とを組み合わせることにより、酵素反応及び酵素の失活を十分に行うことができる。
 上記尿素検出試薬としてα-イソニトロソプロピオフェノンを含む酸性溶液は、例えば以下のような方法で調製することができる。まず、α-イソニトロソプロピオフェノンと、酸、それらの塩又は水和物と、必要であれば生理食塩水等の緩衝液又は蒸留水等とを混合する。さらに、α-イソニトロソプロピオフェノンが酸性溶液に比較的溶解しにくい場合、混合時に加熱することが好ましい。加熱することで、α-イソニトロソプロピオフェノンを完全に溶解させることができ、上記尿素検出試薬としてα-イソニトロソプロピオフェノンを含む酸性溶液を調製することができる。
 溶液中の尿素検出試薬の濃度は、0.05重量%以上1.00重量%以下であることが好ましく、0.08重量%以上0.70重量%以下であることがより好ましく、0.10重量%以上0.66重量%以下であることがさらに好ましい。
[尿素検出反応促進工程]
 上記尿素検出試薬としてα-イソニトロソプロピオフェノンを含む酸性溶液の添加後に、加熱しながらインキュベートすることで尿素検出反応を促進させてもよい。加熱温度としては、室温以上100℃以下が好ましく、90℃以上100℃以下が特に好ましい。加熱時間としては、30分以上であり、30分以上12時間以下が特に好ましい。加熱温度及び加熱時間はアルギナーゼの含有量に応じて、適宜調節することができる。また、加熱しながらインキュベートすることで、尿素検出試薬による反応を促進し、より早く検出を行うことができる。
 尿素の検出は、尿素と尿素検出試薬との反応を利用した比色法を用いて行うことができる。反応が進み、十分に発色したら、測定装置にセットして吸光度を測定する。測定装置としては、吸光度を測定できるものであれば、特別な限定はない。例えば、吸光光度計(分光光度計)、マイクロプレートリーダー等が挙げられる。
[測定値校正工程]
 さらに、試料内のタンパク質濃度を測定し、アルギナーゼ活性の測定値を校正してもよい。
 タンパク質濃度の測定方法としては、特別な限定はなく、上述の<アルギナーゼ活性の測定方法(1)>において例示されたものと同様のものが挙げられる。
 試料内のタンパク質濃度を測定し、測定値を校正することで、より正確なアルギナーゼ活性の測定値を得ることができる。
 本実施形態のスクリーニング方法は、上記に示したとおり、少量の試料及び試薬を用いて、効率的に測定することが可能である。また、従来では、尿素検出試薬が経時的に変色し、バックグラウンドが高くなってしまう問題があったが、本実施形態のスクリーニング方法では、尿素検出試薬を含む上記pH範囲内の酸性溶液を予め作り置きすることができ、さらに感度良くバックグラウンドが低い状態で測定することが可能である。よって、従来では、一度の分析において、数十サンプルの測定が限界であったのに対し、本実施形態のスクリーニング方法では、数百サンプル以上の多数の試料を測定することができる。
[判定工程]
 次に、被検物質の存在下において検出された尿素が、被検物質の非存在下において検出された尿素と比較して低かった場合に、前記被検物質はアルギナーゼの阻害剤であると判定することができる。
 一方、被検物質の存在下において検出された尿素が、被検物質の非存在下において検出された尿素と比較して高かった場合に、前記被検物質はアルギナーゼの活性剤であると判定することができる。
 以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
[実施例1]
(1)アルギナーゼ活性化工程
 マイクロプレートに、50mM Tris-HCl(pH7.5)及び10mM MnClの混合液を20μLずつマルチピペッターで分注した。続いて、0.1%TritonX100及びProteinase Inhibitor mixtureの混合液を用いて、動物細胞を破砕して、アルギナーゼを含む試料として細胞破砕液を調製した。
続いて、マイクロプレートに、調製した細胞破砕液をマルチピペッターで20μLずつ添加した。続いて、56℃で10分間インキュベートして、アルギナーゼを活性化した。
(2)酵素基質反応工程
 続いて、マイクロプレートに、基質として0.5Mアルギニン溶液(pH9.7)を40μLずつマルチピペッターで添加した。37℃で2時間インキュベートし、酵素基質反応を行った。
(3)酵素失活及び尿素検出反応工程
 酸混合液(リン酸:濃硫酸:水=1:3:7(体積比))に、1/10量のα-イソニトロソプロピオフェノン(9質量%、100%エタノールに溶解)を添加して、95℃で30分以上加熱溶解し、尿素検出試薬を含む酸性溶液を調製した。続いて、マイクロプレートに、調製した尿素検出試薬を含む酸性溶液をマルチピペッターで180μLずつ添加した。続いて、一晩常温でインキュベートした。続いて、95℃で1時間45分加熱した。続いて、予め、0、5、10、20、40、80、160μg/mLの尿素溶液で検量線を引いたマイクロプレートリーダー(モレキュラーデバイス(Molecular Devices)社製、Spectra Max i3)を用いて、アルギナーゼを含む試料の540nmでの吸光度を測定した。さらに、予めBCA protein assayにより測定した、アルギナーゼを含む試料のタンパク質濃度を用いて、測定値を校正した。結果を図2に示す。
図2中、コントロール(Control)は何も添加していない細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったもの、ポジティブコントロール(Positive control)はアルギナーゼ活性促進因子を添加した細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったもの、ネガティブコントロール(Negative control)はアルギナーゼ活性抑制因子を添加した細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったもの、サンプル(Sample)はアルギナーゼ活性促進因子及びアルギナーゼ活性抑制因子を添加した細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったものを示す。
[比較例1]
(1)酵素基質反応工程
 アルギニンバッファー(BioAssay Systems社製、QuantiChrom(登録商標) Arginase Assay Kit(DARG-200))と、Mn溶液(BioAssay Systems社製、QuantiChrom(登録商標) Arginase Assay Kit(DARG-200))とを4:1で混合し、5倍濃縮の基質バッファーを調製した。続いて、マイクロプレートに、実施例1と同様の方法を用いて調製した細胞破砕液を40μLずつ分注した。続いて、マイクロプレートに、5倍濃縮の基質バッファーを10μLずつ分注した。また、ブランクとして、5倍濃縮の基質バッファーを分注せず細胞破砕液のみを含むウェルも準備した。37℃で2時間インキュベートし、酵素基質反応を行った。
(2)酵素失活及び尿素検出反応工程
 A試薬(BioAssay Systems社製、QuantiChrom(登録商標) Arginase Assay Kit(DARG-200))とB試薬(BioAssay Systems社製、QuantiChrom(登録商標) Arginase Assay Kit(DARG-200))とを、1:1で混合し、尿素検出試薬を調製した。続いて、マイクロプレートに、尿素検出試薬を200μLずつ添加して、酵素反応を停止し、尿素検出反応を開始した。このとき、ブランクに5倍濃縮の基質バッファーを10μL添加した。続いて、室温で60分間インキュベートした。続いて、予め、0、5、10、20、40、80、160μg/mLの尿素溶液で検量線を引いたマイクロプレートリーダー(モレキュラーデバイス(Molecular Devices)社製、Spectra Max i3)を用いて、アルギナーゼを含む試料の430nmでの吸光度を測定した。結果を図3に示す。
図3中、コントロール(Control)は何も添加していない細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったもの、ポジティブコントロール(Positive control)はアルギナーゼ活性促進因子を添加した細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったもの、ネガティブコントロール(Negative control)はアルギナーゼ活性抑制因子を添加した細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったもの、サンプル(Sample)はアルギナーゼ活性促進因子及びアルギナーゼ活性抑制因子を添加した細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったものを示す。
 図2及び図3から、ネガティブコントロールのアルギニン活性の測定値に対して、サンプルのアルギニン活性の測定値が、比較例1では2倍であるのに対し、実施例1では5倍と高かった。また、比較例1では、コントロールでのアルギニン活性の測定値と、サンプルでのアルギニン活性の測定値との間に有意差が得られないのに対し、実施例1ではどの条件の間においても有意差が得られた。比較例1に記載のアルギナーゼ活性の測定方法では、経時的に尿素検出試薬が変色し、バックグラウンドが高くなったと推察される。
 以上のことから、実施例1に記載のアルギナーゼ活性の測定方法では、バックグラウンドが低く、高感度でアルギナーゼ活性を測定できることが確かめられた。
[実施例2]
(1)尿素溶液の調製
 尿素(ナカライテスク社製)を用いて、0、5、10、20、40、80、160μg/mLとなるように尿素溶液を調製した。
(2)尿素検出試薬を含む酸性溶液の調製
 酸混合液(リン酸:濃硫酸:水=1:3:7(体積比))に、1/10量のα-イソニトロソプロピオフェノン(9質量%、100%エタノールに溶解)を添加して、95℃で30分以上加熱溶解し、尿素検出試薬を含む酸性溶液を調製した。
(3)尿素検出反応工程
 1枚のマイクロプレートに、(1)で調製した異なる濃度の尿素溶液を各20μLずつ、マンガン溶液20μLずつ、アルギニン溶液40μLずつ、各8ウェルずつ(合計56ウェル×1枚)、マルチピペッターで添加した。続いて、マイクロプレートに、(2)で調製した尿素検出試薬を含む酸性溶液を各180μLずつマルチピペッターで添加した。続いて、95℃で2、3、4、5、6、8時間加熱した。続いて、マイクロプレートリーダー(モレキュラーデバイス(Molecular Devices)社製、Spectra Max i3)を用いて、540nmでの吸光度を測定した。結果を表1に示す。
表1において、「mean」はまず0、5、10、20、40、80、160μg/mLの尿素濃度それぞれにおける8ウェルの平均値を算出後、該平均値を標準偏差で割った値(平均値/標準偏差)を算出し、さらに算出された7つの平均値/標準偏差を平均した値を示している。また、「SD」は前記7つの平均値/標準偏差の標準偏差を示す。
また、8時間加熱したマイクロプレート中の溶液の液色を撮影した画像を図4Aに示す。
[比較例2]
(1)尿素溶液の調製
 尿素(ナカライテスク社製)を用いて、実施例2の(1)と同様の方法により、0、5、10、20、40、80、160μg/mLとなるように尿素溶液を調製した。
(2)尿素検出反応工程
 1枚のマイクロプレートに、(1)で調製した異なる濃度の尿素溶液を各20μLずつ、マンガン溶液20μLずつ、アルギニン溶液40μLずつ、各8ウェルずつ(合計56ウェル×1枚)、マルチピペッターで添加した。続いて、マイクロプレートに、酸混合液(リン酸:濃硫酸:水=1:3:7(体積比))を各162μLずつマルチピペッターで添加した。続いて、尿素検出試薬としてα-イソニトロソプロピオフェノン(9質量%、100%エタノールに溶解)を18μLずつマルチピペッターで添加した。95℃で2、3、4、5、6、8時間加熱した。続いて、マイクロプレートリーダー(モレキュラーデバイス(Molecular Devices)社製、Spectra Max i3)を用いて、540nmでの吸光度を測定した。結果を表1に示す。
また、8時間加熱したマイクロプレート中の溶液の液色を撮影した画像を図4Bに示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 表1から、実施例2は比較例2に対して、meanの値が小さい傾向であった。一方、比較例2はmeanの値が、加熱時間を通してばらついていた。また、実施例2は比較例2に対して、8時間加熱したものを除いて、SDの値も小さい傾向であった。
 以上のことから、本発明の測定方法では、測定値のばらつきを低減できることが明らかとなった。
 また、図4A及び図4Bから、実施例2においては、8時間ではほとんど尿素検出試薬の変色が見られないのに対し、比較例2においては、8時間において尿素検出試薬の変色が確認された。これは、比較例2では、尿素検出試薬に含まれるエタノール溶媒が分注作業中に蒸発してしまい、α-イソニトロソプロピオフェノンの濃度が濃くなってしまうのに対し、実施例2では、尿素検出試薬を含む酸性溶液を予め混合した後に分注しており、エタノール溶媒が蒸発することなく次の工程へ進めることができるためであると推察される。
よって、従来の測定方法である比較例2ではバックグラウンドが高いのに対し、本発明の測定方法では、バックグラウンドが低く、アルギナーゼ活性をより正確に検出できることが明らかとなった。
[実施例3]
(1)アルギナーゼ活性化工程
 マイクロプレートに、10mM MnCl溶液を20μLずつマルチピペッターで分注した。続いて、0.1%TritonX100及びProteinase Inhibitor mixtureの混合液を用いて、マウスマクロファージであるRAW264細胞を破砕して、アルギナーゼを含む試料として細胞破砕液を調製した。続いて、マイクロプレートに、調製した細胞破砕液をマルチピペッターで20μLずつ添加した。
(2)酵素基質反応工程
 続いて、マイクロプレートに、基質として0.5Mアルギニン溶液(pH9.7)を40μLずつマルチピペッターで添加した。37℃で2時間インキュベートし、酵素基質反応を行った。
(3)酵素失活及び尿素検出反応工程
 酸混合液(リン酸:濃硫酸:水=1:3:7(体積比))に、1/10量のα-イソニトロソプロピオフェノン(9質量%、100%エタノールに溶解)を添加して、95℃で30分以上加熱溶解し、尿素検出試薬を含む酸性溶液を調製した。続いて、マイクロプレートに、調製した尿素検出試薬を含む酸性溶液をマルチピペッターで180μLずつ添加した。続いて、一晩常温でインキュベートした。続いて、95℃で1時間45分、又は2時間15分加熱した。続いて、予め、0、5、10、20、40、80、160μg/mLの尿素溶液で検量線を引いたマイクロプレートリーダー(モレキュラーデバイス(Molecular Devices)社製、Spectra Max i3)を用いて、アルギナーゼを含む試料の540nmでの吸光度を測定した。さらに、予めBCA protein assayにより測定した、アルギナーゼを含む試料のタンパク質濃度を用いて、測定値を校正した。結果を図5A及び図5Bに示す。
 図5A及び図5B中、コントロール(Control)は何も添加していない細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったもの、ポジティブコントロール(Positive control)はアルギナーゼ活性促進因子としてIL-4を添加した細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったもの、ネガティブコントロール(Negative control)はアルギナーゼ活性抑制因子としてLipopolysaccharide(LPS)及びINTERFERON γ(IFNγ)を添加した細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったもの、サンプル(Sample)はアルギナーゼ活性促進因子(IL-4)及びアルギナーゼ活性抑制因子(LPS及びIFNγ)を添加した細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったものを示す。
[比較例3]
(1)酵素基質反応工程
 マイクロプレートに、実施例3と同様の方法を用いて調製した細胞破砕液を20μLずつ、及び酵素基質(L-アルギニン40μL+塩化マンガン20μL)溶液を60μLずつ分注した。また、ブランクとして、酵素基質溶液のみを含むウェルと、塩化マンガンのみ含むウェルも準備した。37℃で60分間インキュベートし、酵素基質反応を行った。
(2)酵素失活及び尿素検出反応工程
 続いて、A試薬(1.8M 硫酸中10mM o-フタルジアルデヒド及び0.4% ポリオキシエチレン(23)ラウリルエーテル(w/v))とB試薬(3.6M 硫酸中1.3mM プリマキン二リン酸塩、0.4% ポリオキシエチレン(23)ラウリルエーテル(w/v)、及び130mM ホウ酸)とを、1:1で混合し、尿素検出試薬を調製した。続いて、マイクロプレートに、A試薬及びB試薬の混合後ただちに尿素検出試薬を180μLずつ添加して、酵素反応を停止し、尿素検出反応を開始した。続いて、室温で10分間、又は120分間静置し、発色させた。続いて、予め、0、5、10、20、40、80、160μg/mLの尿素溶液で検量線を引いたマイクロプレートリーダー(モレキュラーデバイス(Molecular Devices)社製、Spectra Max i3)を用いて、アルギナーゼを含む試料の430nmでの吸光度を測定した。結果を図6A及び図6Bに示す。
 図6A及び図6B中、コントロール(Control)は何も添加していない細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったもの、ポジティブコントロール(Positive control)はアルギナーゼ活性促進因子としてIL-4を添加した細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったもの、ネガティブコントロール(Negative control)はアルギナーゼ活性抑制因子としてLipopolysaccharide(LPS)及びINTERFERON γ(IFNγ)を添加した細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったもの、サンプル(Sample)はアルギナーゼ活性促進因子(IL-4)及びアルギナーゼ活性抑制因子(LPS及びIFNγ)を添加した細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったものを示す。
 図5A及び図5Bから、加熱時間が1時間45分である場合と、2時間15分である場合とで、各試料のアルギニン活性の測定値に大きな差はなかった。
 また、図6A及び図6Bから、発色時間が10分である場合と、120分である場合とで、各試料のアルギニン活性の測定値に大きな差はなかった。
 一方、ネガティブコントロールのアルギニン活性の測定値に対して、サンプルのアルギニン活性の測定値が、比較例3では約2.4~2.6倍であるのに対し、実施例3では約2.9~3.3倍と高かった。
 また、比較例3でのコントロールでのアルギニン活性の測定値が約75であるのに対し、実施例3でのコントロールでのアルギニン活性の測定値は約29~37と50以下であった。
 このことから、比較例3に記載のアルギナーゼ活性の測定方法では、A試薬及びB試薬の混合直後から反応が進むことで尿素検出試薬が変色し、バックグラウンドが高くなったと推察される。
 以上のことから、実施例3に記載のアルギナーゼ活性の測定方法では、一度の測定で多数の試料を測定する等、測定までの試料の待ち時間を要する場合であっても、バックグラウンドが低く、高感度でアルギナーゼ活性を測定できることが確かめられた。
[実施例4]
(1)アルギナーゼ活性化工程
 マイクロプレートに、10mM MnCl溶液を20μLずつマルチピペッターで分注した。続いて、0.1%TritonX100及びProteinase Inhibitor mixtureの混合液を用いて、マウスマクロファージであるRAW264細胞を破砕して、アルギナーゼを含む試料として細胞破砕液を調製した。続いて、マイクロプレートに、調製した細胞破砕液をマルチピペッターで20μLずつ添加した。
(2)酵素基質反応工程
 続いて、マイクロプレートに、基質として0.5Mアルギニン溶液(pH9.7)を40μLずつマルチピペッターで添加した。37℃で2時間インキュベートし、酵素基質反応を行った。
(3)酵素失活及び尿素検出反応工程
 酸混合液(リン酸:濃硫酸:水=1:3:7(体積比))に、1/10量のα-イソニトロソプロピオフェノン(9質量%、100%エタノールに溶解)を添加して、95℃で30分以上加熱溶解し、尿素検出試薬を含む酸性溶液を調製し、24時間室温で保管した。続いて、マイクロプレートに、調製後24時間室温で保管した尿素検出試薬を含む酸性溶液をマルチピペッターで180μLずつ添加した。続いて、一晩常温でインキュベートした。続いて、95℃で1時間45分、又は2時間15分加熱した。続いて、予め、0、5、10、20、40、80、160μg/mLの尿素溶液で検量線を引いたマイクロプレートリーダー(モレキュラーデバイス(Molecular Devices)社製、Spectra Max i3)を用いて、アルギナーゼを含む試料の540nmでの吸光度を測定した。さらに、予めBCA protein assayにより測定した、アルギナーゼを含む試料のタンパク質濃度を用いて、測定値を校正した。結果を図7A及び図7Bに示す。
 図7A及び図7B中、コントロール(Control)は何も添加していない細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったもの、ポジティブコントロール(Positive control)はアルギナーゼ活性促進因子としてIL-4を添加した細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったもの、ネガティブコントロール(Negative control)はアルギナーゼ活性抑制因子としてLipopolysaccharide(LPS)及びINTERFERON γ(IFNγ)を添加した細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったもの、サンプル(Sample)はアルギナーゼ活性促進因子(IL-4)及びアルギナーゼ活性抑制因子(LPS及びIFNγ)を添加した細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったものを示す。
[比較例4]
(1)酵素基質反応工程
 マイクロプレートに、実施例3と同様の方法を用いて調製した細胞破砕液を20μLずつ、及び酵素基質(L-アルギニン40μL+塩化マンガン20μL)溶液を60μLずつ分注した。また、ブランクとして、酵素基質溶液のみを含むウェルと、塩化マンガンのみ含むウェルも準備した。37℃で60分間インキュベートし、酵素基質反応を行った。
(2)酵素失活及び尿素検出反応工程
 続いて、A試薬(1.8M 硫酸中10mM o-フタルジアルデヒド及び0.4% ポリオキシエチレン(23)ラウリルエーテル(w/v))とB試薬(3.6M 硫酸中1.3mM プリマキン二リン酸塩、0.4% ポリオキシエチレン(23)ラウリルエーテル(w/v)、及び130mM ホウ酸)とを、1:1で混合し、予め尿素検出試薬を調製し、4℃で24時間保管した。続いて、マイクロプレートに、調製後24時間4℃で保管した尿素検出試薬を180μLずつ添加して、酵素反応を停止し、尿素検出反応を開始した。続いて、室温で10分間、又は120分間静置し、発色させた。続いて、マイクロプレートリーダー(モレキュラーデバイス(Molecular Devices)社製、Spectra Max i3)を用いて、430nmでの吸光度を測定したが、0、5、10、20、40、80、160μg/mLの尿素溶液で検量線を引くことができなかった。
 さらに、4種のアルギナーゼを含む試料、すなわち、何も添加していない細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったもの(コントロール(Control))、アルギナーゼ活性促進因子としてIL-4を添加した細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったもの(ポジティブコントロール(Positive control))、アルギナーゼ活性抑制因子としてLipopolysaccharide(LPS)及びINTERFERON γ(IFNγ)を添加した細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったもの(ネガティブコントロール(Negative control))、及びアルギナーゼ活性促進因子(IL-4)及びアルギナーゼ活性抑制因子(LPS及びIFNγ)を添加した細胞破砕液(サンプル(Sample))について吸光度を測定したが、各条件を反映しておらず、比較例3の結果とは全く異なる傾向を示した。
図7A及び図7Bから、加熱時間が1時間45分である場合と、2時間15分である場合とで、各試料のアルギニン活性の測定値に大きな差はなかった。
 また、ネガティブコントロールのアルギニン活性の測定値に対して、サンプルのアルギニン活性の測定値は、比較例4では各条件を反映しておらず、比較することができなかったのに対し、実施例4では約3.1~3.5倍と高かった。
 このことから、比較例4に記載のアルギナーゼ活性の測定方法では、A試薬及びB試薬の混合後24時間経過したことにより反応が進んで飽和し、尿素検出試薬としての機能を完全に失ったと推察される。
 一方で、データは示さないが、実施例4に記載のアルギナーゼ活性の測定方法では、調製された尿素検出試薬を含む酸性溶液は、保管期間が24時間よりも長期(例えば、数か月程度等)であっても、問題なくアルギナーゼ活性の測定に使用することができる。
 以上のことから、実施例4に記載のアルギナーゼ活性の測定方法で用いられる尿素検出試薬を含む酸性溶液は、大量に調製し、長期保存可能であり、長期保存後であっても、バックグラウンドが低く、高感度でアルギナーゼ活性を測定できることが確かめられた。
 本発明によれば、高感度且つ簡便にアルギナーゼ活性を測定することができる。
 1…アルギナーゼを含む試料、2…2価のカチオンを含む溶液、3…反応容器、4…アルギニン溶液、5…尿素検出試薬を含むpH1.0以上4.0以下の酸性溶液、6…測定装置。

Claims (12)

  1.  反応容器に、アルギナーゼを含む試料と、2価のカチオンを含む溶液とを添加して、アルギナーゼを活性化する工程と、
     活性化されたアルギナーゼを含む試料に、アルギニン溶液を添加し、酵素基質反応を行う工程と、
     酵素基質反応を行った試料に、尿素検出試薬を含むpH1.0以上4.0以下の酸性溶液を添加し、酵素の失活及び尿素の検出反応を同時に行う工程と、
    を備えることを特徴とするアルギナーゼ活性の測定方法。
  2.  前記尿素検出試薬がα-イソニトロソプロピオフェノンである請求項1に記載のアルギナーゼ活性の測定方法。
  3.  反応容器に、アルギナーゼを含む試料と、2価のカチオンを含む溶液とを添加して、アルギナーゼを活性化する工程と、
     活性化されたアルギナーゼを含む試料に、アルギニン溶液を添加し、酵素基質反応を行う工程と、
     酵素基質反応を行った試料に、尿素検出試薬としてα-イソニトロソプロピオフェノンを含む酸性溶液を添加し、酵素の失活及び尿素の検出反応を同時に行う工程と、
    を備えることを特徴とするアルギナーゼ活性の測定方法。
  4.  さらに、酸性溶液を添加した試料を室温以上100℃以下で30分以上加熱し、尿素の検出反応を促進する工程を備える請求項1~3のいずれか一項に記載のアルギナーゼ活性の測定方法。
  5.  さらに、試料内のタンパク質濃度を測定し、アルギナーゼ活性の測定値を校正する工程を備える請求項1~4のいずれか一項に記載のアルギナーゼ活性の測定方法。
  6.  前記反応容器がマイクロプレートである請求項1~5のいずれか一項に記載のアルギナーゼ活性の測定方法。
  7.  一度の分析において、多数の試料を測定し得る請求項1~6のいずれか一項に記載のアルギナーゼ活性の測定方法。
  8.  尿素検出試薬としてα-イソニトロソプロピオフェノンを含む酸性溶液を備えることを特徴とするアルギナーゼ活性の検出キット。
  9.  アルギニンと、
     2価のカチオンを含む溶液と、
     尿素検出試薬を含むpH1.0以上4.0以下の酸性溶液と、
    を備えることを特徴とするアルギナーゼ活性の検出キット。
  10.  前記2価のカチオンがマンガンである請求項9に記載のアルギナーゼ活性の検出キット。
  11.  アルギニンと、
     2価のカチオンを含む溶液と、
     尿素検出試薬を含むpH1.0以上4.0以下の酸性溶液と、
    を備えることを特徴とするアルギナーゼ関連疾患検出キット。
  12.  アルギナーゼの阻害剤又は活性剤のスクリーニング方法であって、
     被検物質存在下及び非存在下において、反応容器に、アルギナーゼを含む試料と、2価のカチオンを含む溶液とを添加して、アルギナーゼを活性化する工程と、
     活性化されたアルギナーゼを含む試料に、アルギニン溶液を添加し、酵素基質反応を行う工程と、
     酵素基質反応を行った試料に、尿素検出試薬としてα-イソニトロソプロピオフェノンを含む酸性溶液を添加し、酵素の失活及び尿素の検出反応を同時に行う工程と、
     被検物質の存在下において検出された尿素が、被検物質の非存在下において検出された尿素と比較して低かった場合に、前記被検物質はアルギナーゼの阻害剤であると判定し、
     被検物質の存在下において検出された尿素が、被検物質の非存在下において検出された尿素と比較して高かった場合に、前記被検物質はアルギナーゼの活性剤であると判定する工程と、
    を備えることを特徴とするスクリーニング方法。
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