JP6884705B2 - アルギナーゼ活性の測定方法、アルギナーゼ活性の検出キット、アルギナーゼ関連疾患検出キット、及びアルギナーゼの阻害剤又は活性剤のスクリーニング方法 - Google Patents
アルギナーゼ活性の測定方法、アルギナーゼ活性の検出キット、アルギナーゼ関連疾患検出キット、及びアルギナーゼの阻害剤又は活性剤のスクリーニング方法 Download PDFInfo
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Description
本願は、2015年11月18日に、日本に出願された特願2015−225939号、2016年1月29日に、日本に出願された特願2016−015903号、2016年3月31日、世界知的所有権機関に出願されたPCT/JP2016/061637号、及び2016年10月3日に、日本に出願された特願2016−195933号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
一実施形態において、本発明は、反応容器に、アルギナーゼを含む試料と、2価のカチオンを含む溶液とを添加して、アルギナーゼを活性化する工程と、活性化されたアルギナーゼを含む試料に、アルギニン溶液を添加し、酵素基質反応を行う工程と、酵素基質反応を行った試料に、尿素検出試薬を含むpH1.0以上4.0以下の酸性溶液を添加し、酵素の失活及び尿素の検出反応を同時に行う工程と、を備える、アルギナーゼ活性の測定方法を提供する。
まず、アルギナーゼを含む試料を調製し、2価のカチオンを含む溶液と共に反応容器に添加する。続いて、アルギナーゼの活性をより高めるために、酵素が失活しない程度の温度(例えば、55℃以上70℃未満の温度等)で、10分程度インキュベートしてもよい。
溶液中の2価のカチオンの濃度としては、例えば1mM以上100mM以下であってよく、3mM以上50mM以下であってよく、5mM以上30mM以下であってよい。
中でも、多数の試料を測定することが可能であることから、マイクロプレート状であることが好ましい。マイクロプレートとしては、任意の数のウェルが配置されているものが挙げられる。ウェルの数としては、プレート1枚当たり、例えば、24、96、384、1,536個等が挙げられる。反応容器は、微細な流路を備えたマイクロ流路デバイスを構成していてもよい。反応容器のサイズは、使用する装置に適用できる範囲であれば構わない。
次に、活性化されたアルギナーゼを含む試料に、基質としてアルギニン溶液を添加し、酵素基質反応を行う。反応温度は、20℃以上45℃以下が好ましく、30℃以上40℃以下がより好ましく、37℃以上40℃以下が最も好ましい。反応時間は、30分以上3時間以下が好ましく、2時間が特に好ましい。反応時のpHは、pH8.5以上10.5以下が好ましく、pH9.0以上10.0以下が特に好ましい。
次に、酵素基質反応を行った試料に、尿素検出試薬を含むpH1.0以上4.0以下の酸性溶液を添加し、酵素の失活及び尿素の検出反応を同時に行う。
上記尿素検出試薬を含むpH1.0以上4.0以下の酸性溶液の添加後に、加熱しながらインキュベートすることで尿素検出反応を促進させてもよい。加熱温度としては、室温以上100℃以下が好ましく、90℃以上100℃以下が特に好ましい。加熱時間としては、30分以上であり、30分以上12時間以下が特に好ましい。加熱温度及び加熱時間はアルギナーゼの含有量に応じて、適宜調節することができる。また、加熱しながらインキュベートすることで、尿素検出試薬による反応を促進し、より早く検出を行うことができる。
さらに、試料内のタンパク質濃度を測定し、アルギナーゼ活性の測定値を校正してもよい。
一実施形態において、本発明は、反応容器に、アルギナーゼを含む試料と、2価のカチオンを含む溶液とを添加して、アルギナーゼを活性化する工程と、活性化されたアルギナーゼを含む試料に、アルギニン溶液を添加し、酵素基質反応を行う工程と、酵素基質反応を行った試料に、尿素検出試薬としてα−イソニトロソプロピオフェノンを含む酸性溶液を添加し、酵素の失活及び尿素の検出反応を同時に行う工程と、を備える、アルギナーゼ活性の測定方法を提供する。
次に、酵素基質反応を行った試料に、尿素検出試薬としてα−イソニトロソプロピオフェノンを含む酸性溶液を添加し、酵素の失活及び尿素の検出反応を同時に行う。
また、溶液の添加量を少なくすることができ、さらに尿素検出試薬の添加量のばらつきを低減することができる。また、上記尿素検出試薬としてα−イソニトロソプロピオフェノンを含む酸性溶液と、続く尿素検出反応促進工程における加熱とを組み合わせることにより、酵素反応及び酵素の失活を十分に行うことができる。
一実施形態において、本発明は、尿素検出試薬としてα−イソニトロソプロピオフェノンを含む酸性溶液を備える、アルギナーゼ活性の検出キットを提供する。
一実施形態において、本発明は、アルギニンと、2価のカチオンを含む溶液と、尿素検出試薬を含むpH1.0以上4.0以下の酸性溶液と、を備える、アルギナーゼ活性の検出キットを提供する。
一実施形態において、本発明は、アルギニンと、2価のカチオンを含む溶液と、尿素検出試薬を含むpH1.0以上4.0以下の酸性溶液と、を備える、アルギナーゼ関連疾患検出キットを提供する。
一実施形態において、本発明は、被検物質存在下及び非存在下において、反応容器に、アルギナーゼを含む試料と、2価のカチオンを含む溶液とを添加して、アルギナーゼを活性化する工程と、活性化されたアルギナーゼを含む試料に、アルギニン溶液を添加し、酵素基質反応を行う工程と、酵素基質反応を行った試料に、尿素検出試薬としてα−イソニトロソプロピオフェノンを含む酸性溶液を添加し、酵素の失活及び尿素の検出反応を同時に行う工程と、被検物質の存在下において検出された尿素が、被検物質の非存在下において検出された尿素と比較して低かった場合に、前記被検物質はアルギナーゼの阻害剤であると判定し、被検物質の存在下において検出された尿素が、被検物質の非存在下において検出された尿素と比較して高かった場合に、前記被検物質はアルギナーゼの活性剤であると判定する工程と、を備える、スクリーニング方法を提供する。
まず、被検物質存在下及び非存在下において、アルギナーゼを含む試料を調製し、2価のカチオンを含む溶液と共に反応容器に添加する。続いて、アルギナーゼの活性をより高めるために、酵素が失活しない程度の温度(例えば、55℃以上70℃未満の温度等)で、10分程度インキュベートしてもよい。
溶液中の2価のカチオンの濃度としては、例えば1mM以上100mM以下であってよく、3mM以上50mM以下であってよく、5mM以上30mM以下であってよい。
中でも、多数の試料を測定することが可能であることから、マイクロプレート状であることが好ましい。マイクロプレートとしては、任意の数のウェルが配置されているものが挙げられる。ウェルの数としては、プレート1枚当たり、例えば、24、96、384、1,536個等が挙げられる。反応容器は、微細な流路を備えたマイクロ流路デバイスを構成していてもよい。反応容器のサイズは、使用する装置に適用できる範囲であれば構わない。
次に、活性化されたアルギナーゼを含む試料に、基質としてアルギニン溶液を添加し、酵素基質反応を行う。反応温度は、20℃以上45℃以下が好ましく、30℃以上40℃以下がより好ましく、37℃以上40℃以下が最も好ましい。反応時間は、30分以上3時間以下が好ましく、2時間が特に好ましい。反応時のpHは、pH8.5以上10.5以下が好ましく、pH9.0以上10.0以下が特に好ましい。
次に、酵素基質反応を行った試料に、尿素検出試薬としてα−イソニトロソプロピオフェノンを含む酸性溶液を添加し、酵素の失活及び尿素の検出反応を同時に行う。
酸性溶液のpHは4.0以下であればよく、ガラス電極のpHメーターでは計測することが難しい酸性度の強い溶液を用いてもよい。使用可能な酸としては、上述の<アルギナーゼ活性の測定方法(1)>において例示されたものと同様のものが挙げられる。上記酸を2種類以上混合したものでもよい。さらに、生理食塩水等の緩衝液又は蒸留水等で希釈されたものであってもよい。
上記尿素検出試薬としてα−イソニトロソプロピオフェノンを含む酸性溶液の添加後に、加熱しながらインキュベートすることで尿素検出反応を促進させてもよい。加熱温度としては、室温以上100℃以下が好ましく、90℃以上100℃以下が特に好ましい。加熱時間としては、30分以上であり、30分以上12時間以下が特に好ましい。加熱温度及び加熱時間はアルギナーゼの含有量に応じて、適宜調節することができる。また、加熱しながらインキュベートすることで、尿素検出試薬による反応を促進し、より早く検出を行うことができる。
さらに、試料内のタンパク質濃度を測定し、アルギナーゼ活性の測定値を校正してもよい。
次に、被検物質の存在下において検出された尿素が、被検物質の非存在下において検出された尿素と比較して低かった場合に、前記被検物質はアルギナーゼの阻害剤であると判定することができる。
一方、被検物質の存在下において検出された尿素が、被検物質の非存在下において検出された尿素と比較して高かった場合に、前記被検物質はアルギナーゼの活性剤であると判定することができる。
(1)アルギナーゼ活性化工程
マイクロプレートに、50mM Tris−HCl(pH7.5)及び10mM MnCl2の混合液を20μLずつマルチピペッターで分注した。続いて、0.1%TritonX100及びProteinase Inhibitor mixtureの混合液を用いて、動物細胞を破砕して、アルギナーゼを含む試料として細胞破砕液を調製した。
続いて、マイクロプレートに、調製した細胞破砕液をマルチピペッターで20μLずつ添加した。続いて、56℃で10分間インキュベートして、アルギナーゼを活性化した。
続いて、マイクロプレートに、基質として0.5Mアルギニン溶液(pH9.7)を40μLずつマルチピペッターで添加した。37℃で2時間インキュベートし、酵素基質反応を行った。
酸混合液(リン酸:濃硫酸:水=1:3:7(体積比))に、1/10量のα−イソニトロソプロピオフェノン(9質量%、100%エタノールに溶解)を添加して、95℃で30分以上加熱溶解し、尿素検出試薬を含む酸性溶液を調製した。続いて、マイクロプレートに、調製した尿素検出試薬を含む酸性溶液をマルチピペッターで180μLずつ添加した。続いて、一晩常温でインキュベートした。続いて、95℃で1時間45分加熱した。続いて、予め、0、5、10、20、40、80、160μg/mLの尿素溶液で検量線を引いたマイクロプレートリーダー(モレキュラーデバイス(Molecular Devices)社製、Spectra Max i3)を用いて、アルギナーゼを含む試料の540nmでの吸光度を測定した。さらに、予めBCA protein assayにより測定した、アルギナーゼを含む試料のタンパク質濃度を用いて、測定値を校正した。結果を図2に示す。
図2中、コントロール(Control)は何も添加していない細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったもの、ポジティブコントロール(Positive control)はアルギナーゼ活性促進因子を添加した細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったもの、ネガティブコントロール(Negative control)はアルギナーゼ活性抑制因子を添加した細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったもの、サンプル(Sample)はアルギナーゼ活性促進因子及びアルギナーゼ活性抑制因子を添加した細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったものを示す。
(1)酵素基質反応工程
アルギニンバッファー(BioAssay Systems社製、QuantiChrom(登録商標) Arginase Assay Kit(DARG−200))と、Mn溶液(BioAssay Systems社製、QuantiChrom(登録商標) Arginase Assay Kit(DARG−200))とを4:1で混合し、5倍濃縮の基質バッファーを調製した。続いて、マイクロプレートに、実施例1と同様の方法を用いて調製した細胞破砕液を40μLずつ分注した。続いて、マイクロプレートに、5倍濃縮の基質バッファーを10μLずつ分注した。また、ブランクとして、5倍濃縮の基質バッファーを分注せず細胞破砕液のみを含むウェルも準備した。37℃で2時間インキュベートし、酵素基質反応を行った。
A試薬(BioAssay Systems社製、QuantiChrom(登録商標) Arginase Assay Kit(DARG−200))とB試薬(BioAssay Systems社製、QuantiChrom(登録商標) Arginase Assay Kit(DARG−200))とを、1:1で混合し、尿素検出試薬を調製した。続いて、マイクロプレートに、尿素検出試薬を200μLずつ添加して、酵素反応を停止し、尿素検出反応を開始した。このとき、ブランクに5倍濃縮の基質バッファーを10μL添加した。続いて、室温で60分間インキュベートした。続いて、予め、0、5、10、20、40、80、160μg/mLの尿素溶液で検量線を引いたマイクロプレートリーダー(モレキュラーデバイス(Molecular Devices)社製、Spectra Max i3)を用いて、アルギナーゼを含む試料の430nmでの吸光度を測定した。結果を図3に示す。
図3中、コントロール(Control)は何も添加していない細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったもの、ポジティブコントロール(Positive control)はアルギナーゼ活性促進因子を添加した細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったもの、ネガティブコントロール(Negative control)はアルギナーゼ活性抑制因子を添加した細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったもの、サンプル(Sample)はアルギナーゼ活性促進因子及びアルギナーゼ活性抑制因子を添加した細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったものを示す。
以上のことから、実施例1に記載のアルギナーゼ活性の測定方法では、バックグラウンドが低く、高感度でアルギナーゼ活性を測定できることが確かめられた。
(1)尿素溶液の調製
尿素(ナカライテスク社製)を用いて、0、5、10、20、40、80、160μg/mLとなるように尿素溶液を調製した。
酸混合液(リン酸:濃硫酸:水=1:3:7(体積比))に、1/10量のα−イソニトロソプロピオフェノン(9質量%、100%エタノールに溶解)を添加して、95℃で30分以上加熱溶解し、尿素検出試薬を含む酸性溶液を調製した。
1枚のマイクロプレートに、(1)で調製した異なる濃度の尿素溶液を各20μLずつ、マンガン溶液20μLずつ、アルギニン溶液40μLずつ、各8ウェルずつ(合計56ウェル×1枚)、マルチピペッターで添加した。続いて、マイクロプレートに、(2)で調製した尿素検出試薬を含む酸性溶液を各180μLずつマルチピペッターで添加した。続いて、95℃で2、3、4、5、6、8時間加熱した。続いて、マイクロプレートリーダー(モレキュラーデバイス(Molecular Devices)社製、Spectra Max i3)を用いて、540nmでの吸光度を測定した。結果を表1に示す。
表1において、「mean」はまず0、5、10、20、40、80、160μg/mLの尿素濃度それぞれにおける8ウェルの平均値を算出後、該平均値を標準偏差で割った値(平均値/標準偏差)を算出し、さらに算出された7つの平均値/標準偏差を平均した値を示している。また、「SD」は前記7つの平均値/標準偏差の標準偏差を示す。
また、8時間加熱したマイクロプレート中の溶液の液色を撮影した画像を図4Aに示す。
(1)尿素溶液の調製
尿素(ナカライテスク社製)を用いて、実施例2の(1)と同様の方法により、0、5、10、20、40、80、160μg/mLとなるように尿素溶液を調製した。
1枚のマイクロプレートに、(1)で調製した異なる濃度の尿素溶液を各20μLずつ、マンガン溶液20μLずつ、アルギニン溶液40μLずつ、各8ウェルずつ(合計56ウェル×1枚)、マルチピペッターで添加した。続いて、マイクロプレートに、酸混合液(リン酸:濃硫酸:水=1:3:7(体積比))を各162μLずつマルチピペッターで添加した。続いて、尿素検出試薬としてα−イソニトロソプロピオフェノン(9質量%、100%エタノールに溶解)を18μLずつマルチピペッターで添加した。95℃で2、3、4、5、6、8時間加熱した。続いて、マイクロプレートリーダー(モレキュラーデバイス(Molecular Devices)社製、Spectra Max i3)を用いて、540nmでの吸光度を測定した。結果を表1に示す。
また、8時間加熱したマイクロプレート中の溶液の液色を撮影した画像を図4Bに示す。
以上のことから、本発明の測定方法では、測定値のばらつきを低減できることが明らかとなった。
よって、従来の測定方法である比較例2ではバックグラウンドが高いのに対し、本発明の測定方法では、バックグラウンドが低く、アルギナーゼ活性をより正確に検出できることが明らかとなった。
(1)アルギナーゼ活性化工程
マイクロプレートに、10mM MnCl2溶液を20μLずつマルチピペッターで分注した。続いて、0.1%TritonX100及びProteinase Inhibitor mixtureの混合液を用いて、マウスマクロファージであるRAW264細胞を破砕して、アルギナーゼを含む試料として細胞破砕液を調製した。続いて、マイクロプレートに、調製した細胞破砕液をマルチピペッターで20μLずつ添加した。
続いて、マイクロプレートに、基質として0.5Mアルギニン溶液(pH9.7)を40μLずつマルチピペッターで添加した。37℃で2時間インキュベートし、酵素基質反応を行った。
酸混合液(リン酸:濃硫酸:水=1:3:7(体積比))に、1/10量のα−イソニトロソプロピオフェノン(9質量%、100%エタノールに溶解)を添加して、95℃で30分以上加熱溶解し、尿素検出試薬を含む酸性溶液を調製した。続いて、マイクロプレートに、調製した尿素検出試薬を含む酸性溶液をマルチピペッターで180μLずつ添加した。続いて、一晩常温でインキュベートした。続いて、95℃で1時間45分、又は2時間15分加熱した。続いて、予め、0、5、10、20、40、80、160μg/mLの尿素溶液で検量線を引いたマイクロプレートリーダー(モレキュラーデバイス(Molecular Devices)社製、Spectra Max i3)を用いて、アルギナーゼを含む試料の540nmでの吸光度を測定した。さらに、予めBCA protein assayにより測定した、アルギナーゼを含む試料のタンパク質濃度を用いて、測定値を校正した。結果を図5A及び図5Bに示す。
図5A及び図5B中、コントロール(Control)は何も添加していない細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったもの、ポジティブコントロール(Positive control)はアルギナーゼ活性促進因子としてIL−4を添加した細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったもの、ネガティブコントロール(Negative control)はアルギナーゼ活性抑制因子としてLipopolysaccharide(LPS)及びINTERFERON γ(IFNγ)を添加した細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったもの、サンプル(Sample)はアルギナーゼ活性促進因子(IL−4)及びアルギナーゼ活性抑制因子(LPS及びIFNγ)を添加した細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったものを示す。
(1)酵素基質反応工程
マイクロプレートに、実施例3と同様の方法を用いて調製した細胞破砕液を20μLずつ、及び酵素基質(L−アルギニン40μL+塩化マンガン20μL)溶液を60μLずつ分注した。また、ブランクとして、酵素基質溶液のみを含むウェルと、塩化マンガンのみ含むウェルも準備した。37℃で60分間インキュベートし、酵素基質反応を行った。
続いて、A試薬(1.8M 硫酸中10mM o−フタルジアルデヒド及び0.4% ポリオキシエチレン(23)ラウリルエーテル(w/v))とB試薬(3.6M 硫酸中1.3mM プリマキン二リン酸塩、0.4% ポリオキシエチレン(23)ラウリルエーテル(w/v)、及び130mM ホウ酸)とを、1:1で混合し、尿素検出試薬を調製した。続いて、マイクロプレートに、A試薬及びB試薬の混合後ただちに尿素検出試薬を180μLずつ添加して、酵素反応を停止し、尿素検出反応を開始した。続いて、室温で10分間、又は120分間静置し、発色させた。続いて、予め、0、5、10、20、40、80、160μg/mLの尿素溶液で検量線を引いたマイクロプレートリーダー(モレキュラーデバイス(Molecular Devices)社製、Spectra Max i3)を用いて、アルギナーゼを含む試料の430nmでの吸光度を測定した。結果を図6A及び図6Bに示す。
図6A及び図6B中、コントロール(Control)は何も添加していない細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったもの、ポジティブコントロール(Positive control)はアルギナーゼ活性促進因子としてIL−4を添加した細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったもの、ネガティブコントロール(Negative control)はアルギナーゼ活性抑制因子としてLipopolysaccharide(LPS)及びINTERFERON γ(IFNγ)を添加した細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったもの、サンプル(Sample)はアルギナーゼ活性促進因子(IL−4)及びアルギナーゼ活性抑制因子(LPS及びIFNγ)を添加した細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったものを示す。
また、図6A及び図6Bから、発色時間が10分である場合と、120分である場合とで、各試料のアルギニン活性の測定値に大きな差はなかった。
一方、ネガティブコントロールのアルギニン活性の測定値に対して、サンプルのアルギニン活性の測定値が、比較例3では約2.4〜2.6倍であるのに対し、実施例3では約2.9〜3.3倍と高かった。
また、比較例3でのコントロールでのアルギニン活性の測定値が約75であるのに対し、実施例3でのコントロールでのアルギニン活性の測定値は約29〜37と50以下であった。
このことから、比較例3に記載のアルギナーゼ活性の測定方法では、A試薬及びB試薬の混合直後から反応が進むことで尿素検出試薬が変色し、バックグラウンドが高くなったと推察される。
(1)アルギナーゼ活性化工程
マイクロプレートに、10mM MnCl2溶液を20μLずつマルチピペッターで分注した。続いて、0.1%TritonX100及びProteinase Inhibitor mixtureの混合液を用いて、マウスマクロファージであるRAW264細胞を破砕して、アルギナーゼを含む試料として細胞破砕液を調製した。続いて、マイクロプレートに、調製した細胞破砕液をマルチピペッターで20μLずつ添加した。
続いて、マイクロプレートに、基質として0.5Mアルギニン溶液(pH9.7)を40μLずつマルチピペッターで添加した。37℃で2時間インキュベートし、酵素基質反応を行った。
酸混合液(リン酸:濃硫酸:水=1:3:7(体積比))に、1/10量のα−イソニトロソプロピオフェノン(9質量%、100%エタノールに溶解)を添加して、95℃で30分以上加熱溶解し、尿素検出試薬を含む酸性溶液を調製し、24時間室温で保管した。続いて、マイクロプレートに、調製後24時間室温で保管した尿素検出試薬を含む酸性溶液をマルチピペッターで180μLずつ添加した。続いて、一晩常温でインキュベートした。続いて、95℃で1時間45分、又は2時間15分加熱した。続いて、予め、0、5、10、20、40、80、160μg/mLの尿素溶液で検量線を引いたマイクロプレートリーダー(モレキュラーデバイス(Molecular Devices)社製、Spectra Max i3)を用いて、アルギナーゼを含む試料の540nmでの吸光度を測定した。さらに、予めBCA protein assayにより測定した、アルギナーゼを含む試料のタンパク質濃度を用いて、測定値を校正した。結果を図7A及び図7Bに示す。
図7A及び図7B中、コントロール(Control)は何も添加していない細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったもの、ポジティブコントロール(Positive control)はアルギナーゼ活性促進因子としてIL−4を添加した細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったもの、ネガティブコントロール(Negative control)はアルギナーゼ活性抑制因子としてLipopolysaccharide(LPS)及びINTERFERON γ(IFNγ)を添加した細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったもの、サンプル(Sample)はアルギナーゼ活性促進因子(IL−4)及びアルギナーゼ活性抑制因子(LPS及びIFNγ)を添加した細胞破砕液を用いて酵素基質反応及び尿素検出反応を行ったものを示す。
(1)酵素基質反応工程
マイクロプレートに、実施例3と同様の方法を用いて調製した細胞破砕液を20μLずつ、及び酵素基質(L−アルギニン40μL+塩化マンガン20μL)溶液を60μLずつ分注した。また、ブランクとして、酵素基質溶液のみを含むウェルと、塩化マンガンのみ含むウェルも準備した。37℃で60分間インキュベートし、酵素基質反応を行った。
続いて、A試薬(1.8M 硫酸中10mM o−フタルジアルデヒド及び0.4% ポリオキシエチレン(23)ラウリルエーテル(w/v))とB試薬(3.6M 硫酸中1.3mM プリマキン二リン酸塩、0.4% ポリオキシエチレン(23)ラウリルエーテル(w/v)、及び130mM ホウ酸)とを、1:1で混合し、予め尿素検出試薬を調製し、4℃で24時間保管した。続いて、マイクロプレートに、調製後24時間4℃で保管した尿素検出試薬を180μLずつ添加して、酵素反応を停止し、尿素検出反応を開始した。続いて、室温で10分間、又は120分間静置し、発色させた。続いて、マイクロプレートリーダー(モレキュラーデバイス(Molecular Devices)社製、Spectra Max i3)を用いて、430nmでの吸光度を測定したが、0、5、10、20、40、80、160μg/mLの尿素溶液で検量線を引くことができなかった。
また、ネガティブコントロールのアルギニン活性の測定値に対して、サンプルのアルギニン活性の測定値は、比較例4では各条件を反映しておらず、比較することができなかったのに対し、実施例4では約3.1〜3.5倍と高かった。
このことから、比較例4に記載のアルギナーゼ活性の測定方法では、A試薬及びB試薬の混合後24時間経過したことにより反応が進んで飽和し、尿素検出試薬としての機能を完全に失ったと推察される。
一方で、データは示さないが、実施例4に記載のアルギナーゼ活性の測定方法では、調製された尿素検出試薬を含む酸性溶液は、保管期間が24時間よりも長期(例えば、数か月程度等)であっても、問題なくアルギナーゼ活性の測定に使用することができる。
Claims (10)
- 反応容器に、アルギナーゼを含む試料と、2価のカチオンを含む溶液とを添加して、アルギナーゼを活性化する工程と、
活性化されたアルギナーゼを含む試料に、アルギニン溶液を添加し、酵素基質反応を行う工程と、
酵素基質反応を行った試料に、尿素検出試薬としてα−イソニトロソプロピオフェノンを含む酸性水溶液を添加し、酵素の失活及び尿素の検出反応を同時に行う工程と、
を備えることを特徴とするアルギナーゼ活性の測定方法。 - さらに、前記酸性水溶液を添加した試料を室温以上100℃以下で30分以上加熱し、尿素の検出反応を促進する工程を備える請求項1に記載のアルギナーゼ活性の測定方法。
- さらに、試料内のタンパク質濃度を測定し、アルギナーゼ活性の測定値を校正する工程を備える請求項1又は2に記載のアルギナーゼ活性の測定方法。
- 前記反応容器がマイクロプレートである請求項1〜3のいずれか一項に記載のアルギナーゼ活性の測定方法。
- 一度の分析において、多数の試料を測定し得る請求項1〜4のいずれか一項に記載のアルギナーゼ活性の測定方法。
- 尿素検出試薬としてα−イソニトロソプロピオフェノンを含む酸性水溶液を備えることを特徴とするアルギナーゼ活性の検出キット。
- アルギニンと、
2価のカチオンを含む溶液と、
α−イソニトロソプロピオフェノンを含む酸性水溶液と、
を備えることを特徴とするアルギナーゼ活性の検出キット。 - 前記2価のカチオンがマンガンである請求項7に記載のアルギナーゼ活性の検出キット。
- アルギニンと、
2価のカチオンを含む溶液と、
α−イソニトロソプロピオフェノンを含む酸性水溶液と、
を備えることを特徴とするアルギナーゼ関連疾患検出キット。 - アルギナーゼの阻害剤又は活性剤のスクリーニング方法であって、
被検物質存在下及び非存在下において、反応容器に、アルギナーゼを含む試料と、2価のカチオンを含む溶液とを添加して、アルギナーゼを活性化する工程と、
活性化されたアルギナーゼを含む試料に、アルギニン溶液を添加し、酵素基質反応を行う工程と、
酵素基質反応を行った試料に、尿素検出試薬としてα−イソニトロソプロピオフェノンを含む酸性水溶液を添加し、酵素の失活及び尿素の検出反応を同時に行う工程と、
被検物質の存在下において検出された尿素が、被検物質の非存在下において検出された尿素と比較して低かった場合に、前記被検物質はアルギナーゼの阻害剤であると判定し、
被検物質の存在下において検出された尿素が、被検物質の非存在下において検出された尿素と比較して高かった場合に、前記被検物質はアルギナーゼの活性剤であると判定する工程と、
を備えることを特徴とするスクリーニング方法。
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