CN109182374A - 一种利用发根农杆菌诱导蒲公英产生毛状根的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用发根农杆菌诱导蒲公英产生毛状根的方法，该方法包括如下步骤：外植体的制备、发根农杆菌的活化、发根农杆菌浸染及共培养、毛状根除菌和继代培养。本发明经过继代培养最终成功诱导蒲公英产生毛状根，其具有更强的产生次生代谢产物的潜能。采用本发明进行毛状根诱导所获得的毛状根具有生长速度快、遗传稳定性好的优点。本发明不仅操作简单、便捷，而且诱导率高，具有大规模生产工业用蒲公英药用成分的替代资源的潜力。

Description

一种利用发根农杆菌诱导蒲公英产生毛状根的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种利用发根农杆菌诱导产生蒲公英毛状根的方法，并初步建立了蒲公英毛状根离体培养体系。
背景技术
发根农杆菌(Agrobaeterium rhizogenes)是根瘤菌科(Rhi—zobiaceae)农杆菌属(Agrobactefium)一类革兰氏阴性土壤农杆菌，可以侵染大多数双子叶植物和少数单子叶植物，通过发根农杆菌感染植物，将其所含的Ri质粒上的一段DNA(T-DNA)转移并整合到植物基因组中，诱导产生毛状根。
蒲公英作为一种食药同源植物，是一种具有广阔开发及应用前景的植物资源。我国学者以及临床医学工作者已经证实蒲公英具有抗氧化、抑菌、降血脂、降血糖、保肝利胆、胃黏膜损伤修复等作用。
近年来国内外对蒲公英的抗氧化及医学疗效的研究日益活跃，其在此领域的应用价值引起了越来越多人的关注。利用生物反应器进行蒲公英的工程化生产将成为今后的发展趋势。目前国内外尚未见转化蒲公英发根成功的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明针对现有技术中存在的问题，提供一种利用发根农杆菌诱导蒲公英产生毛状根的方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种利用发根农杆菌诱导蒲公英产生毛状根的方法，所述方法具体包括如下步骤：
步骤一、外植体的制备
蒲公英种子用温水浸泡，选取饱满的蒲公英种子置于容器中，经消毒、冲洗并用无菌纸吸干种子表面残留水分后，将蒲公英种子转接到1/2MS固体培养基上，于温度21℃～23℃、光周期为8h～16h的人工气候箱培养30～35d，待无菌苗长至一定高度时，采取蒲公英外植体进行侵染实验；
步骤二、发根农杆菌的活化
将低温保存的发根农杆菌R1601取出，接种菌液于LB固体培养基内，在25℃～30℃的条件下培养2～3d长出单菌落后，在无菌操作的前提下挑取单菌落，并将其转入含LB液体培养基的离心管中，于温度为25℃～30℃、转速为150～200r/min的摇床培养18～20h，培养至菌液变浑浊，然后将菌液和LB液体培养基按体积比1:1的比例转入新的离心管中，于温度为25℃～30℃、转速为150～200r/min的条件下进行二次活化；待培养18～20h至菌液变浑浊后，吸取活化过两次的菌液并按照菌液：LB液体培养基＝1:100的比例进行温度为25℃～30℃、转速为150～200r/min的摇床扩大培养，直至测定菌液OD600达到0.5～0.8，用低速冷冻离心机以3000r/min的条件下离心20min，并用MS液体培养基洗涤2～3次，分别重悬至OD600＝0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0，所得菌悬液备用；
步骤三、发根农杆菌浸染及共培养
(1)外植体的预培养
用剪刀将由步骤一获得的蒲公英无菌苗的叶片根切断后用无菌镊子取出，放置在提前灭过菌的含有无菌吸水纸的平皿中；然后用剪刀或无菌手术刀将叶片的边缘剪出伤口，并将其剪成0.4～0.6cm2的小块，将根剪成0.8～1.2cm长；最后将处理过的外植体接种在含有100μmol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基上培养1～3d，完成外植体的预培养阶段；
(2)菌液共培养
取出预培养后的外植体，放置于经步骤二活化的菌液中，期间不停震荡，浸染2～15min，后将浸染后的外植体取出，并用吸水纸吸干表面残余的菌液，接种到含有100μmol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基上置于人工气候箱中培养1～3d；
(3)除菌培养
在无菌条件下，将完成共培养的外植体转移至含有100～300mg/L头孢噻肟钠的1/2MS固体培养基中于人工气候箱中培养，每隔3～5d转接一次，并将头孢噻肟钠的浓度降低，且每次转接时用无菌水冲洗外植体5～10次，并用吸水纸吸干表面残存的水分，直至培养到在不含头孢噻肟钠的培养基中培养，且没有菌落生成；
步骤四、毛状根除菌
在步骤三除菌培养中的外植体毛状根长至3～5cm，剪取毛状根，置于含有100～300mg/L头孢噻肟钠的1/2MS固体培养基中进行继代培养，直至完全除去农杆菌；
步骤五、继代培养
将步骤四除菌后的根放于含有1/2MS液体培养基上进行转代培养，黑暗中，24℃～26℃培养，即完成本发明所述的利用发根农杆菌诱导蒲公英产生毛状根。
其中，发明人通过创造性试验得到最佳制备工艺参数：预培养时间为2天，浸染用菌液浓度OD600为0.7，菌液浸染时间为5min，共培养时间为2天。具体优化试验实施过程参见本发明内容中的具体实施方式。
通过采用上述技术方案，本发明的有益效果如下：
本发明通过利用发根农杆菌成功诱导蒲公英产生毛状根，其具有更强的产生次生代谢产物的潜能。发根可以在培养基内产生次生代谢产物，并可以通过人为的改变生长环境，诱导次生代谢产物不断产生，并分泌于培养基内，便于收集和应用，是取代人工合成蒲公英次生代谢产物的有效途径，为其以后进一步的应用打下了良好的基础。
优选的，步骤二中，在扩大培养过程中，按照Rif：LB培养基1:1000的比例，向所述LB液体培养基中添加利福平。
优选的，所述利福平由以下方法获得：将提前称量好的利福平用甲醇溶解，加双蒸水定容配制成50mg/mL的高浓度母液，滤膜过滤，1.5mL离心管分装，并于-20℃下冷藏备用。
优选的，所述乙酰丁香酮由以下方法获得：将提前称量好的乙酰丁香酮用二甲基亚砜和双蒸水1:1溶解，配制成100μmol/mL的高浓度母液，滤膜过滤，1.5mL离心管分装，并于-20℃下冷藏备用。
优选的，所述头孢噻肟钠由以下方法获得：将1g头孢噻肟钠加10mL的双蒸水溶解，配制成100mg/mL的高浓度母液，滤膜过滤，1.5mL离心管分装，并于-20℃下冷藏备用。
优选的，步骤一中，所述蒲公英种子在超净工作台中按照以下步骤进行消毒处理：75％医用酒精消毒40s后；再将种子置于4％次氯酸钠溶液中消毒8～10min。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明提供了一种利用发根农杆菌诱导蒲公英产生毛状根的方法，其突出的优点在于：
(1)采用本方法进行蒲公英毛状根诱导，毛状根的生成率高，最高达80％，同时所需材料容易获得、操作简单、易行、成本低。
(2)采用本方法进行蒲公英毛状根诱导，获得的毛状根在无任何外缘激素的培养基中容易生长，且具有生长速度快、遗传稳定性好、合成能力强且稳定、向培养基中释放部分代谢产物等特点，是生产次生代谢产物理想的载体。
(3)通过本发明获得的毛状根易于进行大量繁殖培养，可进行大规模生产以作为工业用蒲公英的替代资源来提取次生代谢产物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明共培养的图片。
图2附图为本发明浸染后的图片。
图3附图为本发明共培养浸染生根的图片。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种利用发根农杆菌诱导蒲公英产生毛状根的方法，不仅操作简单、便捷，而且诱导率高，可用于大规模生产工业用蒲公英药用成分的替代资源。
为更好地理解本发明，下面通过以下实施例对本发明作进一步具体的阐述，但不可理解为对本发明的限定，对于本领域的技术人员根据上述发明内容所作的一些非本质的改进与调整，也视为落在本发明的保护范围内。
本发明公开了一种利用发根农杆菌诱导蒲公英产生毛状根的方法，所述方法具体包括如下步骤：
步骤一、外植体的制备
蒲公英种子用温水浸泡，选取饱满的蒲公英种子置于容器中，经消毒、冲洗并用无菌纸吸干种子表面残留水分后，将蒲公英种子转接到1/2MS固体培养基上，于温度21℃～23℃、光周期为8h～16h的人工气候箱培养30～35d，待无菌苗长至一定高度时，采取蒲公英外植体进行侵染实验；
步骤二、发根农杆菌的活化
将低温保存的发根农杆菌R1601取出，接种菌液于LB固体培养基内，在25℃～30℃的条件下培养2～3d长出单菌落后，在无菌操作的前提下挑取单菌落，并将其转入含LB液体培养基的离心管中，于温度为25℃～30℃、转速为150～200r/min的摇床培养18～20h，培养至菌液变浑浊，然后将菌液和LB液体培养基按体积比1:1的比例转入新的离心管中，于温度为25℃～30℃、转速为150～200r/min的条件下进行二次活化；待培养18～20h至菌液变浑浊后，吸取活化过两次的菌液并按照菌液：LB液体培养基＝1:100的比例进行温度为25℃～30℃、转速为150～200r/min的摇床扩大培养，直至测定菌液OD600达到0.5～0.8，用低速冷冻离心机以3000r/min的条件下离心20min，并用MS液体培养基洗涤2～3次，分别重悬至OD600＝0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0，所得菌悬液备用；
步骤三、发根农杆菌浸染及共培养
(1)外植体的预培养
用剪刀将由步骤一获得的蒲公英无菌苗的叶片根切断后用无菌镊子取出，放置在提前灭过菌的含有无菌吸水纸的平皿中；然后用剪刀或无菌手术刀将叶片的边缘剪出伤口，并将其剪成0.4～0.6cm2的小块，将根剪成0.8～1.2cm长；最后将处理过的外植体接种在含有100μmol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基上培养1～3d，完成外植体的预培养阶段；
(2)菌液共培养
取出预培养后的外植体，放置于经步骤二活化的菌液中，期间不停震荡，浸染2～15min，后将浸染后的外植体取出，并用吸水纸吸干表面残余的菌液，接种到含有100μmol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基上置于人工气候箱中培养1～3d；
(3)除菌培养
在无菌条件下，将完成共培养的外植体转移至含有100～300mg/L头孢噻肟钠的1/2MS固体培养基中于人工气候箱中培养，每隔3～5d转接一次，并将头孢噻肟钠的浓度降低，且每次转接时用无菌水冲洗外植体5～10次，并用吸水纸吸干表面残存的水分，直至培养到在不含头孢噻肟钠的培养基中培养，且没有菌落生成；
步骤四、毛状根除菌
在步骤三除菌培养中的外植体毛状根长至3～5cm，剪取毛状根，置于含有100～300mg/L头孢噻肟钠的1/2MS固体培养基中进行继代培养，直至完全除去农杆菌；
步骤五、继代培养
将步骤四除菌后的根放于含有1/2MS液体培养基上进行转代培养，黑暗中，24℃～26℃培养，即完成本发明所述的利用发根农杆菌诱导蒲公英产生毛状根。
为更好的说明本发明中利用发根农杆菌诱导蒲公英产生毛状根的技术效果，参见说明书附图。图1为本发明共培养的图片；图2为本发明浸染后的图片；图3为本发明共培养浸染生根的图片，其中(a)为浸染14天叶片伤口处萌发出毛状根，(b)为侵染17天后毛状根的生长状态。
为了进一步实现本发明的技术效果，步骤二中，在扩大培养过程中，按照Rif：LB培养基1:1000的比例，向所述LB液体培养基中添加利福平。
为了进一步实现本发明的技术效果，利福平由以下方法获得：将提前称量好的利福平用甲醇溶解，加双蒸水定容配制成50mg/mL的高浓度母液，滤膜过滤，1.5mL离心管分装，并于-20℃下冷藏备用。
为了进一步实现本发明的技术效果，乙酰丁香酮由以下方法获得：将提前称量好的乙酰丁香酮用二甲基亚砜和双蒸水1:1溶解，配制成100μmol/mL的高浓度母液，滤膜过滤，1.5mL离心管分装，并于-20℃下冷藏备用。
为了进一步实现本发明的技术效果，头孢噻肟钠由以下方法获得：将1g头孢噻肟钠加10mL的双蒸水溶解，配制成100mg/mL的高浓度母液，滤膜过滤，1.5mL离心管分装，并于-20℃下冷藏备用。
为了进一步实现本发明的技术效果，步骤一中，蒲公英种子在超净工作台中按照以下步骤进行消毒处理：75％医用酒精消毒40s后；再将种子置于4％次氯酸钠溶液中消毒8～10min。
为了进一步实现本发明的技术效果，MS培养基由以下方法获得：量取所需母液，并称取蔗糖30g、琼脂8g，添加适量蒸馏水后煮沸使琼脂完全溶解并定容至1000mL；当培养基冷却到一定温度，但没有凝固时，调节pH值在5.8～6.2之间；分装并标记；高压灭菌；放置备用。
其中MS培养基成分：大量元素、微量元素、铁盐和维生素；若配制液体培养基则不需添加琼脂，不用煮沸。
为了进一步实现本发明的技术效果，LB培养基由以下方法获得：称取胰蛋白胨10g；酵母提取物5g；氯化钠10g；琼脂粉15～20g(液体培养基不需添加琼脂)；双蒸水定容至1000mL后煮沸；调pH至7.0左右分装标记，高压灭菌后备用。
下面，将结合具体实施例，对本发明的技术方案进行进一步的说明。
实施例1：预培养时间对蒲公英毛状根诱导的影响
适当的预培养时间对于侵染转化实验的相当重要，如表1所示，预培养时间为1～2天时，都可以得到较高的生根率，不过预培养2天时的平均生根数与根长远比预培养1天要好。而预先培养为0天或者3天时，蒲公英的生根时间比预培养2天时要长，平均生根数和平均根长没有预培养2天。
表1预培养时间对蒲公英诱导毛状根的影响
实施例2：菌液浓度对蒲公英毛状根诱导的影响
菌液浓度与蒲公英外植体生根率关系很大。如表2所示，当菌体浓度略低时随着菌液浓度的增加，外植体生根率也随之增加，当菌液OD600值为0.6～0.7时，生根率比较高，而当值OD600超过这个范围时，外植体的生根率明显降低，褐化加剧，后继除菌操作困难，造成外植体的周围长满菌落无法进行后继操作。而且在菌液OD600＝0.7时，生根率高，平均生根数也多。因此，菌液浓度OD600＝0.7时比较适合蒲公英毛状根诱导实验。
表2菌液浓度对蒲公英毛状根诱导的影响
实施例3：侵染时间对蒲公英毛状根诱导的影响
侵染时间与蒲公英毛状根的诱导率关系很大，如表3所示，当侵染时间小于5min时，加长侵染时间，外植体生根率提高；当时间为8min大于5min时，生根率骤然下降；当时间达到15min时，蒲公英外植体褐化现象加剧，生根率极低。所以本实验初步判定侵染时间为5min时蒲公英诱导毛状根的效果比较好。
表3不同侵染时间对蒲公英毛状根诱导的影响
实施例4：侵染后共培养时间对蒲公英毛状根诱导率的影响
如下表4所示，共培养时间影响着蒲公英毛状根的诱导率。共培养时间为1和3天时，外植体生根率相差不大，不过当共培养时间为3天时，后继除菌操作困难，部分外植体由于长满菌落，无法继续培养；而共培养时间为2天时生根率最高为39％平均生根数也最多。因此，共培养2天时，较为适合蒲公英外植体生根。
表4共培养时间对蒲公英毛状根诱导的影响
实施例5：除菌培养基中头孢噻肟钠浓度对蒲公英毛状根诱导率的影响
如下表5所示当浓度为0、100、200mg/L时，蒲公英外植体生根时间明显比300mg/L时要短，但是在20天统计结果时，蒲公英外植体的生根率、平均生根数与平均根长明显比添加300mg/L头孢噻肟钠的外植体低。由于高浓度的头孢噻肟钠浓度会对植物生长具有抑制作用，本实验没有进行更高浓度的对照，本实验初步判断蒲公英毛状根诱导实验中除菌培养基中较好头孢噻肟钠适宜浓度为300mg/L。
表5头孢噻肟钠浓度对蒲公英毛状根诱导的影响
发明人通过创造性试验得到最佳的实验条件：预培养2天，菌液浓度OD600为0.7，侵染5min，共培养2天，以及诱导实验中除菌培养基中头孢噻肟钠浓度为300mg/L。通过该试验条件利用发根农杆菌诱导蒲公英产生毛状根的平均生根数多且平均根长长，具有生长速度快、遗传稳定性好、合成能力强的优点。本发明公开的诱导方法不仅操作简单、便捷，而且诱导率高，可用于大规模生产工业用蒲公英药用成分的替代资源。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (6)

1.一种利用发根农杆菌诱导蒲公英产生毛状根的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：
步骤一、外植体的制备
蒲公英种子用温水浸泡，选取饱满的蒲公英种子置于容器中，经消毒、冲洗并用无菌纸吸干种子表面残留水分后，将蒲公英种子转接到1/2MS固体培养基上，于温度21℃～23℃、光周期为8h～16h的人工气候箱培养30～35d，待无菌苗长至一定高度时，采取蒲公英外植体进行侵染实验；
步骤二、发根农杆菌的活化
将低温保存的发根农杆菌R1601取出，接种菌液于LB固体培养基内，在25℃～30℃的条件下培养2～3d长出单菌落后，在无菌操作的前提下挑取单菌落，并将其转入含LB液体培养基的离心管中，于温度为25℃～30℃、转速为150～200r/min的摇床培养18～20h，培养至菌液变浑浊，然后将菌液和LB液体培养基按体积比1:1的比例转入新的离心管中，于温度为25℃～30℃、转速为150～200r/min的条件下进行二次活化；待培养18～20h至菌液变浑浊后，吸取活化过两次的菌液并按照菌液：LB液体培养基＝1:100的比例进行温度为25℃～30℃、转速为150～200r/min的摇床扩大培养，直至测定菌液OD600达到0.5～0.8，用低速冷冻离心机以3000r/min的条件下离心20min，并用MS液体培养基洗涤2～3次，分别重悬至OD600＝0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0，所得菌悬液备用；
步骤三、发根农杆菌浸染及共培养
(1)外植体的预培养
用剪刀将由步骤一获得的蒲公英无菌苗的叶片根切断后用无菌镊子取出，放置在提前灭过菌的含有无菌吸水纸的平皿中；然后用剪刀或无菌手术刀将叶片的边缘剪出伤口，并将其剪成0.4～0.6cm2的小块，将根剪成0.8～1.2cm长；最后将处理过的外植体接种在含有100μmol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基上培养1～3d，完成外植体的预培养阶段；
(2)菌液共培养
取出预培养后的外植体，放置于经步骤二活化的菌液中，期间不停震荡，浸染2～15min，后将浸染后的外植体取出，并用吸水纸吸干表面残余的菌液，接种到含有100μmol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基上置于人工气候箱中培养1～3d；
(3)除菌培养
在无菌条件下，将完成共培养的外植体转移至含有100～300mg/L头孢噻肟钠的1/2MS固体培养基中于人工气候箱中培养，每隔3～5d转接一次，并将头孢噻肟钠的浓度降低，且每次转接时用无菌水冲洗外植体5～10次，并用吸水纸吸干表面残存的水分，直至培养到在不含头孢噻肟钠的培养基中培养，且没有菌落生成；
步骤四、毛状根除菌
在步骤三除菌培养中的外植体毛状根长至3～5cm，剪取毛状根，置于含有100～300mg/L头孢噻肟钠的1/2MS固体培养基中进行继代培养，直至完全除去农杆菌；
步骤五、继代培养
将步骤四除菌后的根放于含有1/2MS液体培养基上进行转代培养，黑暗中，24℃～26℃培养，即完成本发明所述的利用发根农杆菌诱导蒲公英产生毛状根。
2.根据权利要求1所述的一种利用发根农杆菌诱导蒲公英产生毛状根的方法，其特征在于，步骤二中，在扩大培养过程中，按照Rif：LB培养基1:1000的比例，向所述LB液体培养基中添加利福平。
3.根据权利要求2所述的一种利用发根农杆菌诱导蒲公英产生毛状根的方法，其特征在于，所述利福平由以下方法获得：将提前称量好的利福平用甲醇溶解，加双蒸水定容配制成50mg/mL的高浓度母液，滤膜过滤，1.5mL离心管分装，并于-20℃下冷藏备用。
4.根据权利要求1所述的一种利用发根农杆菌诱导蒲公英产生毛状根的方法，其特征在于，所述乙酰丁香酮由以下方法获得：将提前称量好的乙酰丁香酮用二甲基亚砜和双蒸水1:1溶解，配制成100μmol/mL的高浓度母液，滤膜过滤，1.5mL离心管分装，并于-20℃下冷藏备用。
5.根据权利要求1所述的一种利用发根农杆菌诱导蒲公英产生毛状根的方法，其特征在于，所述头孢噻肟钠由以下方法获得：将1g头孢噻肟钠加10mL的双蒸水溶解，配制成100mg/mL的高浓度母液，滤膜过滤，1.5mL离心管分装，并于-20℃下冷藏备用。
6.根据权利要求1所述的一种利用发根农杆菌诱导蒲公英产生毛状根的方法，其特征在于，步骤一中，所述蒲公英种子在超净工作台中按照以下步骤进行消毒处理：75％医用酒精消毒40s后；再将种子置于4％次氯酸钠溶液中消毒8～10min。
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