CN102090342B

CN102090342B - 一种紫花野菊高效再生体系建立的方法

Info

Publication number: CN102090342B
Application number: CN 201110003048
Authority: CN
Inventors: 陈发棣; 陈琳; 尹冬梅; 陈素梅; 房伟民; 管志勇; 刘兆磊; 蒋甲福; 滕年军
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2011-01-10
Filing date: 2011-01-10
Publication date: 2013-01-16
Anticipated expiration: 2031-01-10
Also published as: CN102090342A

Abstract

本发明涉及一种建立紫花野菊高效再生体系的方法，属于植物生物技术育种领域。以紫花野菊无菌苗叶片为外植体，采用两激素三水平随机区组设计的方法筛选出最佳再生培养基，诱导胚性愈伤组织，经过2-3次继代培养后分化出再生小苗，而后转入生根培养基中生根培养，获得完整植株。本发明首次针对紫花野菊建立了其高频再生体系，为紫花野菊生物技术育种工作提供了理论基础和实验依据，将有效推动菊花生物技术育种进程。

Description

一种紫花野菊高效再生体系建立的方法

一、技术领域

本发明为一种建立紫花野菊高效再生体系的方法，专用于紫花野菊基因工程和转基因育种工作，属于菊花生物技术育种领域。

二、背景技术

紫花野菊（Chrysanthemum zawadskii），又名山菊（东北植物检索表），为菊科菊属的植物。分布在蒙古、俄罗斯、欧洲以及中国大陆的河北、甘肃、山西、吉林、黑龙江、安徽、陕西、内蒙古、辽宁等地，生长于海拔850米至1,800米的地区，多生于草原、林间草地、林下及溪边，目前已由人工引种栽培。

本课题组前期研究建立了菊花耐涝评价体系，并对57个菊花近缘种属植物进行了耐涝性鉴定，结果发现，菊花近缘种属植物的耐涝性遗传背景差异十分明显，筛选出紫花野菊等8份耐涝材料，是一批宝贵的耐源材料，可用于菊花耐涝育种。植物的耐涝性是一个受多种因素制约的复杂问题，不同野生物种、同一野生种不同地理居群在同样水涝环境中存在耐涝性强、弱差异，可能与在不同原生境下，形成耐涝力不同的基因型有关，当淹水厌氧信号出现时，与形态、结构和生理变化相关的基因被诱导激活而表达，以获得耐涝性。在发掘出耐涝优异资源的基础上，还需要进一步研究其耐涝的形态、解剖、生理、生化、遗传与分子调控机制，以揭示菊花的耐涝机理，并推动耐涝菊花新品种选育。

紫花野菊的再生体系研究至今未见报道，因此，系统深入研究其再生能力及获得再生植株，建立专门针对紫花野菊的高效稳定的再生体系，可为菊花耐涝基因工程和转基因育种工作提供理论基础和实验依据，将有效推进高等植物抗性生物技术育种进程。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的是建立了一套适用于紫花野菊的高效稳定的再生体系，专门对紫花野菊的再生能力进行了系统深入研究，为菊花基因工程和转基因育种奠定基础。

技术方案

本发明是一种建立紫花野菊高效再生体系的方法，其实施方案如下：

1、建立紫花野菊高频再生体系的方法，包括：

1）无菌苗的获得

于秋末取紫花野菊脚芽，洗涤剂清洗10-15min，流水冲洗1-2h，滤纸吸干水分，无菌条件下依次用70%乙醇浸泡30s，0.1%升汞溶液消毒7-9min，无菌水冲洗3～5次，切取0.5cm-1.0cm带腋芽的茎段，接种于MS+细胞分裂素6-BA1.0mg·L^-1+生长素NAA 0.1mg·L^-1的培养基上诱导腋芽萌发，待不定芽长至1-2cm时切下转入1/2MS的生根培养基上获得无菌苗；

其中培养室温度：23±2℃；湿度：50～70%；采用自然散射光，光周期：16h·d^-1；光照强度：1800～2000Lux；

2）再生体系的建立

1）叶片最适分化培养基的选择

筛选诱导分化培养基时，取25d苗龄的无菌苗顶端幼嫩叶片切成5mm²大小，将叶圆片分别接种于含有细胞分裂素6-BA 1.0、2.0或3.0mg·L^-1和生长素NAA0.1、0.5或1.0mg·L^-1的MS培养基中，每瓶接种8个叶盘，每个处理5瓶，在相同的培养条件下重复3次。观察并记录不同培养基上愈伤组织形成和不定芽分化情况；30d后统计再生率和平均芽数；培养基中含蔗糖3%、琼脂0.7%，pH为5.8。

不定芽再生率(%)=再生不定芽的外植体总数/接种外植体总数×100%；

平均芽数=外植体再生不定芽总数/再生不定芽的外植总数

2）叶片发育程度对分化的影响

分别取25d苗龄的无菌苗顶端幼叶和近基部成熟叶切成5mm²大小，接种于叶片最适分化培养基上，30d后统计再生率和平均芽数。观察对比其愈伤组织褐变及不定芽再生情况。

3)不定芽生根情况

叶片诱导产生愈伤组织后，继代培养后转入1/2MS生根培养基中进行生根培养，获得完整植株。观察并记录生根情况。

生根率（%）=不定芽生根株数/接种不定芽总数×100%

有益效果

本发明提供的一种建立紫花野菊高效再生体系的方法，与现有技术相比具有如下优点和积极效果：

1.本发明首次针对紫花野菊再生能力进行了系统深入的研究，为后续的紫花野菊耐涝基因工程和转基因育种工作提供了最基本的方法。

2.在再生体系建立中，利用两种激素（细胞分裂素6-BA、生长素NAA）随机区组设计筛选出最佳诱导分化培养基（MS+细胞分裂素6-BA1.0mg·L^-1+生长素NAA1.0mg·L^-1）；在比较近基部成熟叶和顶端幼嫩叶叶片分化情况时发现，与近基部成熟叶片相比，顶端幼嫩叶片愈伤组织不易褐化，且提高了再生率；不定芽生根培养基以不加激素的1/2MS生根培养基生根效果最优，且生根率为100%。

四、附图说明

图1紫花野菊不同激素条件(细胞分裂素6-BA/生长素NAA)下叶盘再生图

A：1.0/0.1；B：1.0/0.5；C：1.0/1.0

D：2.0/0.1；E：2.0/0.5；F：2.0/1.0

G：3.0/0.1；H：3.0/0.5；I：3.0/1.0（mg·l^-1）

图2紫花野菊单个叶盘再生过程

A：脱分化期；B：分化期；C：不定芽长至2～3cm时；

D：不定芽生根；E：再生植株

图3叶片发育程度对紫花野菊再生的影响

近基部成熟叶：愈伤组织（A1）和不定芽（A2）；

顶端幼叶：愈伤组织（B1）和不定芽（B2）

图4紫花野菊不定芽添加激素和不加激素条件下生根情况

A1-A2：在添加激素条件下（细胞分裂素6-BA/生长素NAA=1/0.1mg·l^-1）

不定芽的生根

B1-B2：不加激素条件下不定芽的生根

五、具体实施方式

本发明提供的一种建立紫花野菊高效再生体系的方法，其具体实施方式如下：

1紫花野菊高频再生体系的建立

1.1无菌材料的获得

以紫花野菊为供试材料，取生长健壮的地下脚芽，洗涤剂清洗10～15min，流水冲洗1-2h，在超净工作台上用70%乙醇浸泡30s，再用0.1%升汞溶液消毒7-9min，无菌水冲洗3～5次，切取0.5cm-1.0cm带腋芽的茎段，接种于MS+细胞分裂素6-BA1.0mg·L^-1+生长素NAA 0.1mg·L^-1培养基上诱导腋芽萌发，20d后不定芽长至1-2cm，切下转入1/2MS生根培养基，7d后可以观察到不定芽基部出现根系，25d后获得6-8cm高的无菌植株。用于再生的外植体为25天苗龄的无菌苗顶端幼嫩叶片切成的5mm²叶圆片。

1.2再生体系的建立

1.2.1最佳诱导分化培养基的筛选

将叶圆片（5mm²）分别接种于含有不同浓度配比的细胞分裂素6-BA（1.0、2.0或3.0mg·L^-1）和生长素NAA（0.1、0.5或1.0mg·L^-1）的MS培养基中，叶片外植体接种培养4d后，切口边缘开始膨大，叶片逐渐增厚，7d后，在切口边缘观察到黄绿色的愈伤组织，15d后将带有愈伤的外植体继代到相同培养基上，愈伤组织继续膨大，继代后5～7d陆续观察到绿色芽点突起，经过2～3次继代培养后有不定芽产生，且发现细胞分裂素6-BA和生长素NAA不同浓度配比对叶盘再生不定芽影响很大，在细胞分裂素6-BA浓度一定时，不定芽的再生率随着生长素NAA浓度的增加而逐渐降低；而随着细胞分裂素6-BA浓度从1.0mg·L^-1增加到3.0mg·L^-1时不定芽再生率也呈下降趋势。当添加的6-BA浓度为1mg·L^-1时，不定芽的再生率分别为86.8%（0.1mg·L^-1NAA）、45.6%（0.5mg·L^-1NAA）、11.4%（1.0mg·L^-1NAA），说明低浓度的NAA有利于不定芽的发生与增殖；当添加0.1mg·L^-1NAA不定芽再生率分别为86.8%（1.0mg·L^-16-BA）、52.6%（2.0mg·L^-16-BA）、12.2%（3.0mg·L^-16-BA），说明低浓度的6-BA也有利于不定芽的发生与增殖。最终确定MS+细胞分裂素6-BA1.0mg·L^-1+生长素NAA0.1mg·L^-1的诱导效果最好，再生率达86.8%，平均芽数达6.36（表1、图1、图2）。

表1细胞分裂素6-BA和生长素NAA对紫花野菊叶片再生的影响

注：同列不同小写字母表示在5%水平上差异显著。

1.2.2叶片发育程度对分化的影响

分别取25d苗龄的无菌苗顶端幼叶和近基部成熟叶切成5mm²大小，接种于叶片最适分化培养基上，30d后发现近基部成熟叶与顶端幼叶相比，愈伤褐变程度高，再生能力较差，不定芽数也较少。顶端幼叶不定芽再生率为88.0%，而近基部成熟叶不定芽再生率仅为46.0%（表2、图3）。

表2叶片发育程度对分化的影响

注：同列不同小写字母表示在5%水平上差异显著。

1.2.3不定芽生根情况

叶片诱导产生愈伤组织后，经过2～3代继代培养后转入1/2MS生根培养基中进行生根培养，获得完整植株。比较发现，在添加激素和不加激素的条件下，不定芽生根率均为100%，但在添加激素条件下，植株根系较少，茎杆细弱，且在基部分化出许多不定芽，不利于植株生长；而不加激素条件下没有出现此情况，根系健壮且较多，植株生长健壮（图4）。

Claims

1.一种建立紫花野菊高效再生体系的方法，其特征在于按如下步骤实现：

a、无菌苗的获得

于秋末取紫花野菊脚芽，经清水冲洗，于无菌条件下乙醇脱水，升汞消毒，无菌水冲洗获得脱菌的脚芽，切取带腋芽的茎段，接种于MS+细胞分裂素6-BA1.0 mg·L^-1+生长素NAA 0.1 mg·L^-1的培养基上诱导腋芽萌发，不定芽长至1-2cm时切下转入1/2MS的生根培养基获得无菌苗；

b、培养条件

培养室温度：23±2℃；湿度：50~70%；采用自然散射光，光周期：16h·d^-1；光照强度：1800~2000Lux；

c、再生体系的建立

1）叶片最适分化培养基的选择

取25d苗龄的无菌苗顶端幼嫩叶片切成5mm²大小，接种于含有细胞分裂素6-BA与生长素NAA的MS培养基中；每瓶接种8个叶盘，每个处理5瓶，在相同的培养条件下重复3次，观察并记录不同培养基上愈伤组织形成和不定芽分化情况，30d后统计再生率和平均芽数；培养基中含蔗糖3%、琼脂0.7%，pH为5.8;

2）叶片发育程度对分化的影响

分别取25d苗龄的无菌苗顶端幼叶和近基部成熟叶切成5mm²大小，接种于叶片最适分化培养基上，30d后统计再生率和平均芽数;

3）不定芽生根情况

叶片诱导产生愈伤组织后，继代培养后转入1/2MS生根培养基中进行生根培养，获得完整植株。

2.根据权利要求1所述的一种建立紫花野菊高效再生体系的方法，其特征在于步骤C中（1）的细胞分裂素6-BA 1.0、2.0或3.0 mg·L^-1；生长素NAA0.1、0.5或1.0 mg·L^-1。