CN116024255B - 一种利用不定芽体外再生提高菊属植物基因编辑效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用不定芽体外再生提高菊属植物基因编辑效率的方法，包括以下步骤：将CRISPR/Cas9基因编辑菊属植物的幼叶的叶盘经过不定芽再生培养获得不定芽，再将不定芽切下接种到生根培养基上进行生根培养得到再生植株。本发明通过构建含有编辑CsDRM1基因的载体，利用叶盘转化法获得基因编辑植株，再利用不定芽体外再生的方式将基因编辑效率从≤50％提升至100％，此方法具有操作简单，效果显著等优点，为基因编辑发展提供新方法，具有较高的实用性和科研应用价值。
Description
技术领域
本发明属于基因编辑领域，涉及提高CRISPR/Cas9在菊属植物中的基因编辑效率的方法，尤其涉及一种利用不定芽体外再生提高菊属植物基因编辑效率的方法。
背景技术
菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat.)是菊科、菊属的多年生宿根草本植物，观赏价值高，是世界四大切花之一。但栽培菊花多为六倍体植物，起源复杂，基因组高度杂合，基因功能分析困难。甘野菊(Chrysanthemum seticuspe)Gojo-0是一个和菊花亲缘关系较近的自交亲和的二倍体菊属植物。它不仅具有野菊的优良特性，且具有自交亲和性和基因组纯合的特点。相对于六倍体的栽培菊花品种，甘野菊Gojo-0遗传分析相对简单，将其作为菊属植物研究的模式植物有利于栽培菊花品种中复杂生物学现象的研究。
近年来，基因编辑技术高速发展，CRISPR/Cas9技术在多种园艺作物上的应用为基因功能研究和新品种育种提供了一种高效的手段，提高CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率也变得非常迫切。
中国专利申请CN 110129363 A公开了一种提高番茄CRISPR/Cas9基因编辑效率的方法，但是该方法中是在外植体的培养转化过程中发现通过提高温度可以显著提高基因编辑的效率，该方法仅仅是利用了初次组培再生过程中的温度对于基因编辑的效率的影响，而并不能用于已经转化成功的植株进行二次诱导基因编辑。
目前，Gojo-0的基因组已公布，以叶盘为外植体的再生体系和农杆菌介导的遗传转化体系建立的完成为甘野菊Gojo-0基因编辑奠定了基础。但影响编辑效率的因素有很多，亟需一种能够提高菊属植物中的基因编辑效率的方法。
发明内容
发明目的：本发明提供了一种利用不定芽体外再生提高植株编辑效率的方法，并进一步通过连接pHEE401E载体的方式验证了此方法显著提高了植株CRISPR/Cas9基因编辑的效率。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种利用不定芽体外再生提高菊属植物基因编辑效率的方法，包括以下步骤：将CRISPR/Cas9基因编辑菊属植物的幼叶的叶盘经过不定芽再生培养获得不定芽，然后将不定芽切下接种到生根培养基上进行生根培养得到再生植株。
其中，所述CRISPR/Cas9基因编辑菊属植物为甘野菊Gojo-0，其他菊属类植物也在本发明的保护范围之内。
其中，所述CRISPR/Cas9基因编辑植物是将pHEE401E-CsDRM1载体导入农杆菌中得到浸染液，然后将甘野菊Gojo-0的幼叶叶盘在浸染液中浸染培养获得。
其中，所述叶盘尺寸为4mm×4mm。
其中，所述不定芽再生培养的培养基为MS+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.2mg·L-1。
其中，所述生根培养基为MS+Hyg2mg·L-1+Cb150mg·L-1。
进一步地，pHEE401E-CsDRM1载体对应的农杆菌抗性为卡那霉素(Kan)，所述转基因植物对应筛选标记抗性为潮霉素(Hyg)。
进一步的，所述农杆菌OD600＝0.4-0.6；农杆菌侵染时间为8-10min。
进一步的，所述提高基因编辑方法所需时间为28-32d，优选30d。
进一步的，验证基因编辑效率的方法为连接pMD19-T载体转化大肠杆菌后挑取单克隆测序。比较再生苗株系与野生型植株在编辑位点的序列差异，计算编辑效率。
基因编辑效率(％)＝已编辑序列克隆数/总克隆数×100(％)。
有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：
1)方法简单易行：本方法需将插入基因编辑载体片段的植株无菌苗叶片切成4mm×4mm的叶盘，放置在适宜不定芽再生的培养基(MS+1.0mg·L-1 6-BA+0.2mg·L-1 NAA)上培养30d，即可获得编辑效率100％的基因编辑植株。
2)显著提高了植物体基因编辑效率：本方法将植物体的基因编辑效率从≤50％提升至100％，使植物体内目的基因均有片段被敲除，阻碍了基因表达。
综上，本发明提供的提高植物中基因编辑效率的方法，为甘野菊基因功能研究奠定了方法学基础，为基因编辑发展研究提供新方法，具有较高的实用性和科研应用价值。
附图说明
图1为叶盘再生效果图；
图2为为转基因验证图；
图3为基因编辑序列类型示意图；
图4为基因编辑序列类型测序峰图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。
实施例1pHEE401E-CsDRM1载体的构建
1、PCR扩增小片段
在CHOPCHOP网站(https：//chopchop.cbu.uib.no/)选择物种为Chrysanthemumseticuspe，靶标为CsDRM1基因序列，编辑酶为CRISPR/Cas9，编辑模式为Knock-out，通过该网站设计适用于CsDRM1基因编辑的gRNA序列。在gRNA序列上游加上BsaI酶切位点，下游加上pCBC-DT1T2载体(http：//www.addgene.org/50590/)，设计出上下游引物CmCsDRM1-pHEE-1-F/CmCsDRM1-pHEE-2-R，高保真PCR混样配制如表1所示，引物序列见表2。PCR反应程序为98℃预变性2min；98℃变性15s，58℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃终延伸5min。
表1
表2
2、将上一步获得的PCR产物进行纯化，测定产物纯化后浓度需＞20ng/μl，跑胶确定正确大小约为620bp。
3、Goldengate连接反应
表3
注：片段和载体体积根据浓度调整。
反应条件：(37℃/5min+16℃/10min)×10个循环，37℃/10min，80℃/5min。
4、取5μl连接产物转化大肠杆菌DH5α。在kanamycin LB平板上挑取克隆进行菌液PCR。引物见表2。
5、阳性克隆过夜培养，miniprep质粒抽提，送测序确认。测序上下游均测，引物见表2中的pHEE401E-F/R。经测序正确的质粒导入农杆菌EHA105中得到重组菌株EHA105-pHEE401E。
实施例2基因编辑植株的获得
1、植物材料预培养：将苗龄约为40d的Gojo-0无菌苗(Nakano M，TaniguchiK，Masuda Y，et al.A pure line derived from a self-compatible Chrysanthemumseticuspe mutant as a model strain in the genus Chrysanthemum[J].PlantScience，2019，287：110174.作者馈赠)的幼叶在超净工作台中切割成4mm×4mm的叶盘，接种在最适合不定芽再生的M1培养基(MS+1.0mg·L-16-BA+0.2mg·L-1NAA)上预培养3d。
2、农杆菌培养及侵染液的制备：挑取平板上生长的重组菌株EHA105-pHEE401E单克隆接种于含有Rif50μg·mL-1和Kan50μg·mL-1的50mLYEB液体培养基中，置于28℃、200rpm摇床中培养至OD600＝0.4-0.6后4000rpm离心15min收集菌体，倒出上清液并添加30mL MS液体培养基以重新悬浮农杆菌。
3、侵染与共培养：将叶盘置于侵染液中侵染8～10min，侵染后用注射器吸出侵染液，用无菌滤纸吸取叶盘上多余的侵染液后将叶盘接种在不定芽再生培养基M1上，23℃黑暗环境中培养3d。
4、脱羧培养与继代选择培养：将共培养后的叶盘转移到脱羧培养基(M1+Cb500mg·L-1)中培养7d，然后将叶盘接种到含有抗生素的筛选培养基(M1+Hyg2.5mg·L-1+Cb400mg·L-1)中进行筛选培养，共继代选择培养3-4代，每次逐渐降低Hyg的筛选压力。经继代筛选培养后，具有抗性的芽点分化成不定芽。
选择培养1代筛选培养基(M1+Hyg2.5mg·L-1+Cb400mg·L-1)；
选择培养2代筛选培养基(M1+Hyg2.25mg·L-1+Cb400mg·L-1)；
选择培养3代筛选培养基(M1+Hyg2.0mg·L-1+Cb400mg·L-1)；
选择培养4代筛选培养基(M1+Hyg1.75mg·L-1+Cb400mg·L-1)。
5、生根培养：待不定芽长度达到1em时，将Hyg抗性芽切下接种到生根筛选培养基(MS+Hyg2mg·L-1+Cb150mg·L-1)上进行生根筛选。15d后抗性芽生根，选择幼苗叶片进行分子检测。
6、基因编辑载体插入片段的鉴定：提取获得的抗性苗叶片的总DNA，使用pHEE401E-F/R引物鉴定pHEE401E-CsDRM1载体质粒是否插入植物DNA。以抗性苗的总DNA为模板，以pHEE401E载体(http：//www.addgene.org/71287/)的质粒为阳性对照，野生型甘野菊Gojo-0的DNA和H2O为阴性对照进行PCR扩增，反应后产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统观察记录。经鉴定获得CRISPR/Cas9转基因株系。PCR体系和程序如下：
PCR体系：
表4
PCR程序：94℃预变性3min；94℃变性10s，55℃退火20s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸7min。
7、基因编辑效果的鉴定：使用CsDRM1-F/R引物扩增并测序确定转基因株系DNA中的CsDRM1基因序列是否被切割。PCR体系和程序如下：
PCR体系：
表5
PCR程序：94℃预变性3min；94℃变性10s，55℃退火20s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸7min。
将以CRISPR/Cas9基因编辑甘野菊Gojo-0植株DNA和野生型植株(WT)DNA的扩增片段胶回收，连接pMD19-T载体，转化DH5α大肠杆菌，各挑取20个单克隆用CsDRM1-F/R引物测序。测序结果显示，WT株系的克隆中CsDRM1基因序列全部完整，而部分克隆中CsDRM1基因中有CGTG4个碱基被切割掉(图3)，其余克隆中CsDRM1基因序列完整(图3)。此结果说明CRISPR/Cas9基因编辑的转基因株系为嵌合体，编辑效率≤50％。为提高CRISPR/Cas9基因编辑效率，我们进行了以下试验。
实施例3提高基因编辑效率
将40天苗龄的CRISPR/Cas9基因编辑转基因Gojo-0无菌苗的幼叶在超净工作台中切成4mm×4mm的叶盘，接种在适合甘野菊Gojo-0不定芽再生的培养基(MS+6-BAl.0mg·L-1+NAA0.2mg·L-1)上培养，30d后叶盘诱导再生出不定芽，切下长度约1.0cm的不定芽插在含有Hyg的MS培养基中生根培养，获得CRISPR/Cas9基因编辑不定芽再生苗4个株系，分别命名为DRM1-1C、DRM1-1E、DRM1-1F和DRM1-1H，待无菌苗株高达5cm取幼嫩叶片提取植物总DNA进行转化效率鉴定。鉴定步骤同步骤实施例2中第7步。结果如图2所示，所有的再生植株均为CRISPR/Cas9基因编辑转基因株系。经进一步转化、测序验证，结果表明，不定芽再生后株系DRM1-1C、DRM1-1E、DRM1-1F和DRM1-1H的基因序列中，除出现了切割CGTG4个碱基的编辑类型(即芽再生前基因编辑类型)外，还出现了另外的随机编辑类型(图3和图4)，且每个株系切割位点、切割碱基数目不同，从而使每一条CsDRM1基因序列都发生了切割。说明经不定芽再生后株系的基因编辑效率达到了100％，克服了CRISPR/Cas9基因编辑效率低的困难。
本实施例中验证基因编辑效率的方法为将植株DNA中的CsDRM1基因片段连接pMD19-T载体转化大肠杆菌后挑取单克隆测序，通过比较再生苗株系与野生型植株在编辑位点的序列差异，计算编辑效率。
基因编辑效率(％)＝已编辑序列克隆数/总克隆数×100(％)。
DRMl-1株系基因编辑效率(％)＝DRMl-1编辑序列类型克隆数(4)/总克隆数(9)×100(％)
DRMl-1C株系基因编辑效率(％)＝[DRMl-1编辑序列类型克隆数(8)+DRMl-1C编辑序列类型克隆数(6)]/总克隆数(14)×100(％)
DRM1-1E株系基因编辑效率(％)＝[DRMl-1编辑序列类型克隆数(8)+DRM1-1E编辑序列类型克隆数(7)]/总克隆数(15)×100(％)
DRM1-1F株系基因编辑效率(％)＝[DRMl-1编辑序列类型克隆数(23)+DRMl-1F编辑序列类型克隆数(3)]/总克隆数(26)×100(％)
DRM1-1H株系基因编辑效率(％)＝[DRMl-1编辑序列类型克隆数(5)+DRMl-1H编辑序列类型克隆数(6)]/总克隆数(11)×100(％)
表6基因编辑效率统计表
Claims (1)
1.一种利用不定芽体外再生提高菊属植物基因编辑效率的方法，其特征在于，包括以下步骤：将CRISPR/Cas9基因编辑菊属植物的幼叶的叶盘经过不定芽再生培养获得不定芽，再将不定芽切下接种到生根培养基上进行生根培养得到再生植株，所述CRISPR/Cas9基因编辑菊属植物为甘野菊Gojo-0，所述CRISPR/Cas9基因编辑植物是将pHEE401E-CsDRM1载体导入农杆菌中得到浸染液，然后将甘野菊Gojo-0的幼叶叶盘在浸染液中浸染培养获得，所述叶盘尺寸为4 mm×4 mm，所述不定芽再生培养的培养基为MS+6-BA 1.0 mg·L-1 +NAA0.2 mg·L-1，所述生根培养基为MS+Hyg 2 mg·L-1+Cb 150 mg·L-1，所述pHEE401E-CsDRM1载体具有适用于CsDRM1基因编辑的gRNA序列。
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| US5567599A (en) * | 1990-08-21 | 1996-10-22 | Florigene Europe B.V. | Method for producing transformed chrysanthemum plants |
| CN102090342A (zh) * | 2011-01-10 | 2011-06-15 | 南京农业大学 | 一种紫花野菊高效再生体系建立的方法 |
| CN103004585A (zh) * | 2012-12-12 | 2013-04-03 | 南京农业大学 | 一种利用卡那霉素快速筛选菊花转基因植株的方法 |
| CN111926033A (zh) * | 2020-07-31 | 2020-11-13 | 上海交通大学 | 一种基于草铵膦为筛选标记的甜瓜遗传转化方法 |
| CN114164229A (zh) * | 2021-11-04 | 2022-03-11 | 南京农业大学 | 利用CRISPR/Cas9基因编辑载体获得再生效率高的草莓新种质的方法及应用 |
-
2022
- 2022-07-11 CN CN202210812008.2A patent/CN116024255B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5567599A (en) * | 1990-08-21 | 1996-10-22 | Florigene Europe B.V. | Method for producing transformed chrysanthemum plants |
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| DFL基因在烟草中的表达及转化菊花的研究;白凌;中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑;D048-22，摘要 * |
| Generation of Gene-Edited Chrysanthemum morifolium Using Multicopy Transgenes as Targets and Markers;Mitsuko Kishi-Kaboshi等;Plant and Cell Physiology;第58卷(第2期);摘要，第222页左栏第2段、第223页右栏第2段，第224页左栏第1段、第224页右栏第4段，表2-3，补充图S6 * |
| Mitsuko Kishi-Kaboshi等.Generation of Gene-Edited Chrysanthemum morifolium Using Multicopy Transgenes as Targets and Markers.Plant and Cell Physiology.2017,第58卷(第2期),摘要，第222页左栏第2段、第223页右栏第2段，第224页左栏第1段、第224页右栏第4段，表2-3，补充图S6. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116024255A (zh) | 2023-04-28 |
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