CN111500625A

CN111500625A - 一种利用发根农杆菌诱导产生玫瑰毛状根的方法

Info

Publication number: CN111500625A
Application number: CN202010417330.6A
Authority: CN
Inventors: 冯立国; 曾雨倩; 王建文
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2020-05-18
Filing date: 2020-05-18
Publication date: 2020-08-07

Abstract

一种利用发根农杆菌诱导产生玫瑰毛状根的方法，属于植物生物技术工程领域。包括发根农杆菌保存、活化与侵染液的制备；外植体的预培养和共培养；农杆菌侵染诱导毛状根；毛状根液体增值培养。本发明利用毛状根生长速度快的特点，解决野生玫瑰植株稀缺无法大规模用于药用成分提取的技术问题。

Description

一种利用发根农杆菌诱导产生玫瑰毛状根的方法

技术领域

本发明属于植物生物技术工程领域，涉及一种玫瑰（Rosa rugosa Thunb.）毛状根的培养方法，具体是一种利用发根农杆菌诱导产生玫瑰毛状根的方法。

背景技术

玫瑰（Rosa rugosa Thunb.）是蔷薇科蔷薇属植物，直立灌木，因其精油含量高、品质好且为国际香型，栽培面积不断扩大，近年来，玫瑰药用价值日益受到重视。一方面，药典记载，玫瑰花能止痛消肿，活血化瘀，另一方面，玫瑰花提取物活性研究证实，其中有很大一部次生代谢物具有潜在的抗自由基、抗肿瘤和抗氧化作用。植物化学的最新研究发现，玫瑰根系中高含量的野蔷薇苷有重要药用价值：可以促进心肌细胞在低压缺氧环境下对氧自由基清除，有望应用于急性低压缺氧诱导的心肌损伤保护；对HIV-1蛋白酶活性的抑制作用较强（达50.3%），有望作为重要的艾滋病抗病毒治疗的HIV-1蛋白酶抑制剂。目前的代谢物生物反应器中，利用植物组织培养技术生（如愈伤组织）获取代谢产物相关技术获得了迅速发展，但是由于细胞培养为脱分化状态的细胞团，激活的生物学通路和次生代谢通路并不一致，因而次生代谢产物的生产能力低且不稳定，且其产生代谢物效率不如已经高度分化的天然植物组织，加上无菌环境成本过高，从而限制了其产业化的发展。

玫瑰中化合物成分复杂、含量低，性质不稳定易分解等使得精油、野蔷薇苷等重要代谢物获取难度较大，且野生玫瑰是国家二级保护植物，难以大规模用于野蔷薇苷等药用成分的提取，组织培养技术无法建立满足生产需求的高效玫瑰生物反应器。而经过发根农杆菌侵染植物所形成的毛状根（hair root)，是一种恶性增殖的器官，相对于常规细胞培养，其具有激素自养、生长迅速、周期短等特点，因而可进行大量培养，同时它起源于单细胞，遗传性状稳定，拥有亲本植株的特征次生代谢途径。由于其生长迅速且遗传性状稳定十分有利于天然药物的开发与利用，成为药用植物次生代谢产物生产的重要原料，目前，人参、黄芪等多种药用植物建立了毛状根诱导和培养体系，大约有百种药用植物的毛状根被成功诱导，76%为草本植物，藤本和木本植物数量较少，大约为7%和17%。结合遗传转化，以毛状根为载体，通过筛选获得优化条件后，可获得更高产量的有效药用成分。对于某些提取受限的野生药用植物资源来说，毛状根培养发展是因势利导，成为一项由基因工程和细胞工程相结合的新技术。

建立玫瑰毛状根诱导技术体系，利用玫瑰根系拥有亲本特征次生代谢途径，可以作为玫瑰重要次生代谢物的扩大生产的生物反应器，也为进一步挖掘野生玫瑰（二级濒危）中高价值代谢物打破了植物原材料限制。

发明内容

本发明的目的是提出一种玫瑰毛状根诱导方法，即一种利用发根农杆菌诱导产生玫瑰毛状根的方法，利用毛状根生长速度快的特点，解决野生玫瑰植株稀缺无法大规模用于药用成分提取的技术问题。

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

1.侵染液的制备：

在无菌条件下，接种根癌农杆菌ATCC15834活化菌液50μL于50mL YEB液体培养基中，28°C 、200 rpm震荡培养至OD600=0.5左右。取菌液5000 rpm离心5~10 min后去上清，加入等体积的1/2MS液体培养基，重悬混匀，置于28°C、 100~110 rpm摇床震荡培养20~30 min后得到侵染液。

2.外植体的预培养和共培养：

在无菌条件下，选取继代20天左右，长势良好的玫瑰组培苗，将其幼嫩叶片切成0.6cm²的小块，背面向上置于固体培养基上培养2d后，将叶片小块浸入准备好的菌液中，轻摇5~20min，使外植体和菌液充分接触取后出叶片小块，用无菌滤纸吸干表面菌液，置于固体培养基上暗培养2~3 d。

3.毛状根诱导：

将共培养叶片进行洗菌后，置于附加300mg/L特美汀（Tim）的固体培养基上，在25±2℃黑暗条件下进行诱导培养。一周后，转入到添加200 mg/L浓度特美汀的洗菌培养基中，7~9天转接一次，依次降低浓度，直至完全无菌，20d后进行观察，统计诱导出的毛状根数，计算诱导率。

4.毛状根液体增殖培养：

将诱导至3~5cm毛状根的根株在无菌环境中用剪刀切下培养，一段时间后，挑选生长迅速、根系粗壮、分支较多、无向地性的毛状根转移到液体培养基中进行扩大培养，25℃，120rpm黑暗中震荡培养，毛状根大量生长。

优选的，步骤2-3中固体培养基为1/2 B5培养基，步骤4中的液体培养基为1/2 B5培养基。

优选的，所述步骤3中洗菌方法如下：将共培养后的叶片用高温灭菌后的蒸馏水清洗2~4次（根据菌株生长状况适量增减次数），然后转接于放有无菌滤纸的培养皿内吸干叶片表面多余的水分。

本发明的有益效果：

本发明利用发根农杆菌ATCC15834侵染玫瑰外植体，通过选择发根农杆菌ATCC15834的活力旺盛期，筛选侵染的合适外植体，优化毛状根诱导培养基，成功诱导出玫瑰毛状根，进一步通过改良毛状根洗菌和繁殖条件，获得快速生长的玫瑰毛状根，为解决玫瑰重要次生代谢物的扩大生产提供了生物反应器，有利于二级濒危植物资源野生玫瑰的保护性利用和可持续性发展，具有很好的开发应用前景。

附图说明

图1是农杆菌ATCC15834繁殖曲线（随小时数变化）；

图2是不同类型培养基中毛状根生长状况（A：1/2B5培养基；B：1/2MS培养基）；

图3是诱导生成玫瑰毛状根（A：预培养时期；B：共培养时期；C：洗菌时期；D：单根生长）；

图4液体培养基扩繁玫瑰毛状根（A.1/2 B5培养基；B.1/2 MS培养基）；

图5 玫瑰rolB基因的PCR检测结果（M：DL2000标准分子量；1、10：清水对照；2、4、6、9：玫瑰不定根总DNA为模板；3、5、7、8：玫瑰毛状根总DNA为模板；）。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

一、发根农杆菌（菌株ATCC15834）保存与活化

长期保存：利用20%（体积浓度）甘油保存，即甘油与菌液进行1：4的体积比例添加后混匀，放置于-80℃冰箱保存，该方法可以保存菌种3~5年。

活化长期保存的菌种：在超净工作台内，从甘油保存的菌种挑取一个长势良好的单菌落于YEB固体培养基上进行平板划线后，倒置放于28℃恒温培养箱约36小时，直至长出较多直径大小约1cm的菌落，挑取一个单菌落于3mL YEB液体培养基中，培养12~14h后，吸取30μL活化的菌液接于30mL的YEB液体培养基中，200rpm振荡培养12~14h，重复上述步骤继代3~4次后将活化后的菌液分装保存于4℃冰箱。培养条件为：培养温度为28℃，暗培养，摇床转速200rpmin。

短期保存：在超净工作台内，将冷藏-80℃的农杆菌菌种接种与YEB（无抗生素）固体平板培养基，置于28℃恒温培养箱进行暗培养48小时左右，直至菌斑长大至直径1 cm左右，置于4℃冰箱进行保存，该方法保存菌种时间较短，需3个月继代一次。

活化短期保存的菌种：在无菌条件下，用移液枪吸取短期保存的菌液30μL，接种于3mLYEB液体培养基，活化方法与活化甘油保存菌种的方法一致。

二、侵染液的制备

在无菌条件下，取活化好的菌液50μL，接到50mL YEB液体培养基中，28°C 、200 rpm震荡培养至OD600=0.5左右（如图1，约8h）。取菌液5000 rpm离心5~10 min，去上清后，加入等体积（50 mL）的1/2MS液体培养基，重悬混匀，置于28°C、100~110 rpm摇床震荡培养20~30min后，菌液制备完成用于后续侵染。

三、外植体的预培养和共培养

在超净工作台上（无菌条件下），选取继代20天左右，长势良好的玫瑰无菌苗，将其幼嫩叶片切成0.6cm²的小块，背面向上置于无激素添加的预培养培养基上，避光进行预培养。将预培养2d后的叶片小块浸入准备好的菌液中，轻摇5~20min，使外植体和菌液充分接触取后出叶片小块，用无菌滤纸吸干表面菌液，置于共培养固体培养基上暗培养2~3 d。

四、洗菌和毛状根诱导

将共培养后的叶片用高温灭菌后的蒸馏水清洗2~4次（根据菌株生长状况适量增减次数），然后转接于放有无菌滤纸的培养皿内吸干叶片表面多余的水分，置于洗菌培养基附加300mg/L特美汀（Tim）的固体培养基上，在25±2℃黑暗条件下进行诱导培养，一周后，转入到添加200 mg/L浓度的固体洗菌培养基中，依次降低浓度，7~9天转接一次，直至完全无菌，20d后进行观察，统计诱导出的毛状根数，计算诱导率。

五、毛状根液体增殖培养

毛状根诱导中，将生长至3~5cm的根株在无菌环境中用剪刀切下培养，一段时间后，挑选生长迅速、根系粗壮、分支较多、无向地性的毛状根转移到液体培养基中进行扩大培养，培养条件是25℃，120rpmin黑暗中摇床震荡培养，直到玫瑰毛状根大量生长。

以上说明对本发明而言只是说明性的，而非限制性的，本领域普通技术人员理解，在不脱离所附权利要求所限定的精神和范围的情况下，可做出许多修改、变化或等效，但都将落入本发明的保护范围。

六、玫瑰毛状根PCR扩增检测

发根农杆菌质粒中TL-DNA的rol家族基因与毛状根形成有着密切关系,检测毛状根中是否存在rol基因，可作为鉴定毛状根中的一种有效方法。挑选在液体培养基中生长状况良好的毛状根，使用TaKaRaMiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit进行毛状根DNA提取，作为阳性对照；以清水和实验室玫瑰无菌苗根系为阴性对照，提取DNA为模板，根据rolB基因设计一对引物后进行PCR扩增试验，具体步骤如下：

玫瑰毛状根DNA提取：挑选够在无外源激素的培养基上快速自主生长的毛状根，提取取毛状根根总DNA、未侵染菌苗的根系总DNA，提取方法参照MiniBESTPLant Genomic DNAExtraction Kit试剂盒操作手册进行。

玫瑰毛状根PCR检测：根据发根农杆菌Ri质粒T-DNA上的roL基因家族设计一对特异引物，其中上游引物为5'-GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3'，下游为5'-GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3'，25μL PCR反应体系为PCR Master Mix 12.5μL，上/下游引物（10μM）各自0.5μl，DNA (50ng/μl) 1μl， ddH₂O 10.5μl。反应程序为94℃ 3min；94℃20sec，54℃ 30sec，72℃ 1min，35cycles；72℃10 min。反应结束后，取PCR反应产物在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。从图5可以看出，以扩繁后的玫瑰毛状根的总DNA为模板，扩增到423bp左右的特异性条带，而在未经过农杆菌ATCC15834侵染的根中未扩增到任何特异性片段，由此表明，农杆菌ATCC15834中的Ri质粒中T-DNA序列含有的rolB基因已经整合到玫瑰毛状根基因组中，所检测的根为发根农杆菌ATCC15834诱导的毛状根，故按照以上步骤，可以获得了完整的玫瑰毛状根发生体系。

Claims

1.一种利用发根农杆菌诱导产生玫瑰毛状根的方法，其特征是，包括以下步骤：

（1）发根农杆菌保存、活化与侵染液的制备；

（2）外植体的预培养和共培养；

（3）农杆菌侵染诱导毛状根；

（4）毛状根液体增值培养。

2.根据权利要求1所述的一种利用发根农杆菌诱导产生玫瑰毛状根的方法，其特征是，步骤（1）中，侵染液的制备：

在无菌条件下，接种根癌农杆菌ATCC15834活化菌液50μL于50mL YEB液体培养基中，28°C 、200 rpm震荡培养至OD600=0.5；

取菌液5000 rpm离心5~10 min后去上清，加入等体积的1/2MS液体培养基，重悬混匀，置于28°C、100~110 rpm摇床震荡培养20~30 min后得到侵染液。

3.根据权利要求1所述的一种利用发根农杆菌诱导产生玫瑰毛状根的方法，其特征是，步骤（2）中，外植体的预培养和共培养：

在无菌条件下，将玫瑰组培苗幼嫩叶片切成0.6cm²的小块，背面向上于固体培养基培养2d后；浸入菌液轻摇5~20 min，吸干表面菌液后置于固体培养基上暗培养2~3 d。

4.根据权利要求1所述的一种利用发根农杆菌诱导产生玫瑰毛状根的方法，其特征是，步骤（3）中，毛状根的诱导：

将共培养叶片进行洗菌，置于附加300mg/L特美汀的培养基，在25±2℃黑暗条件下诱导培养一周，转入添加200 mg/L特美汀的除菌培养基中，7~9天转接一次，依次降低浓度，直至完全无菌，20d后诱导出的毛状根。

5.根据权利要求1所述的一种利用发根农杆菌诱导产生玫瑰毛状根的方法，其特征是，步骤（4）中，毛状根液体增殖培养：

将诱导至3~5cm毛状根的根株切下培养，挑选生长迅速、根系粗壮、分支较多、无向地性的毛状根转移到液体培养基中，25℃、120rpm黑暗中震荡进行扩大培养，获得大量生长的毛状根。