CN116200514A - 用于检测水稻病原菌的引物探针组合产品及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明大体涉及分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种用于检测水稻病原菌的引物探针组合产品及其应用。采用本发明提供的引物探针组合产品能够同时检测水稻细菌性条斑、水稻白叶枯和水稻细菌性谷枯病菌，具有较好的灵敏度和准确度，扩增效率高，且操作简便，快速省时。
Description
技术领域
本发明大体涉及分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种用于检测水稻病原菌的引物探针组合产品及其应用。
背景技术
随着我国对外贸易经济的迅速发展，进出境动植物以及动植物产品在品种和数量上越来越多。水稻作为重要的粮食经济作物，水稻种子的资源调运也日益频繁。一些水稻病害随着种子进行扩散，对于水稻的产量造成不可挽回的损失。2007年，我国相关部门制定了《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》，该名录中明确规定水稻细菌性条斑病（Rice bacterial leaf streak, BLS）、水稻白叶枯病（Rice bacterial leaf blight,BLB）和水稻细菌性谷枯病（Rice grain rot）为水稻的检疫性病害。
水稻细菌性条斑病（BLS）由稻黄单胞菌条斑致病变种（Xanthomonasoryzaepv.oryzicola, Xoc）引起，在亚洲广泛分布，我国部分地区此病发生严重，严重时可导致水稻减产40-60%。水稻白叶枯病由稻黄单胞菌水稻致病变种（Xanthomonasoryzaepv.oryzae, Xoo）引起，在我国华东、华中、华南稻区普遍发生，一旦爆发，减产可达20%，严重时可达50-70%。水稻细菌性谷枯由颖壳伯克氏菌（Burkholderia glumae）引起，一般稻米减产损失在20-30%，发病严重时损失可达到75%。由于带病原的种子是这三种病害的主要初侵染源与传播途径，因此尽早检测种子携带的病原及发现病症，对于预防、控制、指导生产，减少经济损失等均有重要意义。
实时荧光定量PCR技术是目前应用最广泛的分子检测法，该技术不仅实现了对病毒核酸的定量，而且具有灵敏度高、特异性强、自动化程度高等特点。专利CN105063193A公开了一种检测水稻白叶枯病菌的HDA试剂盒及其检测方法，利用等温扩增的方法检测水稻白叶枯病菌，但是只能检测一种水稻致病菌。CN103498000B公开了一种多重PCR法检测水稻检疫性病原菌的引物组及试剂盒和方法，该专利可同时检测水稻细菌性条斑病菌，白叶枯病菌和细菌性谷枯病菌，但是使用普通PCR的方法，其灵敏度相较荧光定量PCR差出几个数量级。目前还没有针对三种病原菌的多重荧光定量PCR检测试剂盒。
另外对于病原体的核酸检测，市场现有检测系统或方法通常需要在检测前进行样品处理，提取核酸后才能进行扩增。本发明申请人基于该问题，经过数年研发，于在先申请CN202110057507.0中公开了一种新型现场化快速核酸检测设备CarryOn P1000F，该设备为“手持全自动封闭式核酸qPCR分析系统”，目前的升级版CarryOn P1000F可在35分钟内完成病原菌的现场自动化核酸检测，真正实现“样品进，结果出”的快速检测。
现有的检测试剂盒及方法较操作时间长，且操作步骤繁琐，因此，亟需提供一种灵敏度高、特异性强、覆盖面广、操作简便、省时且节约成本的水稻细菌性条斑病菌、水稻白叶枯病菌和水稻细菌性谷枯病菌检测试剂盒及其使用方法。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种用于检测水稻病原菌的引物探针组合产品，其包含a)~c)中的一种或多种：
a) 核苷酸序列为SEQ ID NO：1~2所示的引物以及SEQ ID NO：3所示的探针；
b) 核苷酸序列为SEQ ID NO：4~5所示的引物以及SEQ ID NO：6所示的探针；
c) 核苷酸序列为SEQ ID NO：7~8所示的引物以及SEQ ID NO：9所示的探针。
本发明的又一目的在于提供含有如上所述的引物探针组合产品的试剂盒或微流控芯片。
本发明的再一目的在于提供检测水稻病原菌的方法，包括：
使用如上所述的试剂盒或微流控芯片对水稻样品进行检测的步骤；
所述水稻病原菌包括水稻细菌性条斑病菌、水稻白叶枯病菌和水稻细菌性谷枯病菌中的一种或多种。
采用本发明提供的引物探针组合产品能够同时检测水稻细菌性条斑、水稻白叶枯和水稻细菌性谷枯病菌，具有较好的灵敏度和准确度，扩增效率高，且操作简便，快速省时。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为试剂盒灵敏度检测结果图。
图2为试剂盒一体化微流控芯片正面和反面示意图。
图3为试剂盒FAM与HEX通道串扰验证实验扩增结果图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另有说明，用于披露本发明的所有术语(包括技术和科学术语)的意义与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同。通过进一步的指导，随后的定义用于更好地理解本发明的教导。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项（也即均用“逻辑或”连接的技术方案），也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合（也即均用“逻辑与”连接的技术方案）。
本发明中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。
本发明中用端点表示的数值范围包括该范围内所包含的所有数值及分数，以及所引述的端点。
本发明中涉及浓度数值，其含义包括在一定范围内的波动。比如，可以在相应的精度范围内波动。比如2%，可以允许±0.1%范围内波动。对于数值较大或无需过于精细控制的数值，还允许其含义包括更大波动。比如100mM，可以允许±1%、±2%、±5%等范围内的波动。涉及分子量，允许其含义包括±10%的波动。
本发明中，涉及“多个”、“多种”等描述，如无特别限定，指在数量上指大于等于2。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本申请的发明目的和/或技术方案相冲突，否则，本发明涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本发明中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本发明中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本发明为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。
本发明的第一方面涉及用于检测水稻病原菌的引物探针组合产品，其包含a)~c)中的一种或多种：
a) 核苷酸序列为SEQ ID NO：1~2所示的引物以及SEQ ID NO：3所示的探针；
b) 核苷酸序列为SEQ ID NO：4~5所示的引物以及SEQ ID NO：6所示的探针；
c) 核苷酸序列为SEQ ID NO：7~8所示的引物以及SEQ ID NO：9所示的探针。
在一些实施方式中，所述的引物探针组合产品还包含d)和/或e)：
d) 用于检测内参基因的引物和探针；
e) 用于检测过程质控品的引物和探针。
内参基因可以为水稻中常用的基因，诸如Actin1、eEF1-α、β-TUB、UBQ5、GAPDH、UBC、OsAOC等等。在一些优选的实施方式中，所述内参基因源自水稻PLD基因。进一步优选地，d) 为核苷酸序列为SEQ ID NO：10~11所示的引物以及SEQ ID NO：12所示的探针。
在一些实施方式中，e) 为核苷酸序列为SEQ ID NO：13~14所示的引物以及SEQ IDNO：15所示的探针。
另外，需要说明的是，在一个方面，有用的引物和探针包括与SEQ ID NO：1~15所示的引物或探针具有大于60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列。容易理解，本领域技术人员对于上述序列的保护范围还考虑了这样的引物和探针修饰并且可根据标准技术制备。
术语“%同一性”在两个或更多个核苷酸序列或氨基酸序列的上下文中，指的是相同或具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸的两个或多个序列或子序列，当比较和比对以用于最大对应时，如使用以下序列比较算法之一或通过目视检查来测量的。例如，%同一性是相对于要比较的序列的编码区域的整个长度。
对于序列比较，通常一个序列用作参考序列，测试序列与该序列进行比较。当使用序列比较算法时，测试序列和参考序列被输入到计算机中，如果需要，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法根据指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。可使用搜索算法例如BLAST和PSI-BLAST (Altschuletal., 1990、J Mol Biol 215:3, 403-410; Altschul et al., 1997, Nucleic AcidsRes25:17, 3389-402)确定百分比同一性。
引物和探针修饰可以采用公知的方法。这些引物和/或探针序列的修饰版本可包括，通过非限制性例子，将一个或多个核苷酸添加到5’端，将一个或多个核苷酸添加到3’端，将一个或多个核苷酸添加到5’端和3’端，添加尾部，缩短序列，延长序列，将序列上下游移动几个碱基，或其任何组合。
碱基修饰例如3'P、5'P、5-硝基吲哚、2-氨基嘌呤、8-氨基-2'-脱氧腺苷、C-5丙炔基-脱氧胞苷、C-5丙炔基-脱氧尿苷、2-氨基-2'-脱氧腺苷-5'-三磷酸、2,6-二氨基嘌呤(2-氨基-dA)、反向dT、反向二脱氧-T、羟甲基dC、异-dC、5-甲基dC、氨基乙基-吩噁嗪-脱氧胞苷，和锁核酸(LNA’s)，并包括在碱基之一处的至少一个错配碱基，或者替换其中至少一个碱基为RNA碱基，以实现例如增加突变体特异性引物3’端的核酸相互作用，以增加Tm。双链稳定碱基修饰的加入对PCR有积极的影响，从而使其能够在较高的温度下进行，在此范围内已知Taq聚合酶显示出最大的活性。修饰后的探针应当保留区分待检测突变位点和野生型位点的能力。
在一些实施方式中，所述探针标记有可检测的信号物质。在一些实施方式中，所述信号物质是荧光团、比色标记、胶体金、量子点、生物素以及其他可以用于探测的标签分子（如用于拉曼衍射成像的炔烃基团，用于click反应的环烯烃，用于聚合物标记的引发基团），也可以选自多肽/蛋白分子，LNA/PNA，非天然氨基酸及其类似物（比如拟肽），非天然核酸及其类似物（拟核苷酸）和纳米结构（包括无机纳米颗粒，NV-center，聚集/组装诱导发光分子，稀土离子配体分子，多金属氧簇等）。
在一些实施方式中，所述探针均为自身淬灭探针。
在一些实施方式中，各探针的荧光发射基团独立地选自AMCA、Pacific Blue、Atto425、BODIPY FL、FAM、Alexa Fluor 488、TET、JOE、Yakima Yellow、VIC、HEX、Quasar 570、Cy3、NED、TAMRA、ROX、Aqua Phluor593、Texas Red、Atto 590、Cy5、Quasar 670、Cy5.5以及Cy5.5中的任一种。
在一些实施方式中，所述组合产品中各探针上所标记的信号物质可区分；在一些实施方式中，所述组合产品中各探针的荧光发射基团所携带的荧光信号可区分。
在一个具体的实施例中，SEQ ID NO：3、6、9、12、15所示的探针上的荧光发射基团选自FAM、HEX、Cy5、Atto425和Cy5.5。在一个具体的实施例中，SEQ ID NO：3、6、9、12、15所示的探针上的荧光发射基团依次分别为FAM、HEX、Cy5、Atto425和Cy5.5。
在一个具体的实施例中，上述a)~e)中的引物探针，可以在同一个反应体系中使用组或多组以组成多重反应体系提高反应效率。
在一些实施方式中，所述的引物探针组合产品中各探针的荧光发射基团所携带的荧光信号可区分。
在一些实施方式中，各探针的淬灭基团独立地选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl、Eclipse以及MGB中的任一种。
根据本发明的第二方面，含有如上所述的引物探针组合产品的试剂盒或微流控芯片。
术语“试剂盒”是指包括至少一个设备的任何制品（例如，包装或容器），试剂盒可进一步包括在本文中描述的方法或其步骤中使用的使用说明书、补充试剂和/或组分或组件。
在一些实施方式中，所述的试剂盒或微流控芯片还包括纯化试剂、qPCR反应试剂和过程质控品中的至少一种。
在一些实施方式中，所述的纯化试剂包括裂解液、洗脱液和磁珠。
在一些实施方式中，所述的裂解液包括盐酸胍、醋酸钠和Triton X-100。
在一些实施方式中，所述的洗脱液包括Tris-HCl；所述的裂解液和洗脱液的体积比优选为1:(2-2.5)。
在一些实施方式中，所述的磁珠为干化磁珠。
在一些实施方式中，所述qPCR反应试剂是风干的。
qPCR反应试剂可以包含扩增所需的常规组分，诸如扩增缓冲液、dNTP、Mg2+、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照和水中的至少一种。
在一些实施方式中，所述DNA聚合酶具有5'外切酶活性，例如选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4DNA聚合酶以及Klenow片段中的任一种。
本发明所用的水通常为无核酸和/或无核酸酶的水，形式可以是蒸馏水、去离子水或反渗水。
在一些实施方式中，所述过程质控品的包含SEQ ID NO:16所示序列。
在一些实施方式中，所述过程质控品是质粒。
在一些实施方式中，所述过程质控品是冻干品。
在一些实施方式中，所述过程质控品包括甘露醇、海藻糖、牛血清白蛋白、消泡剂、2-羟丙基-β-环糊精、pH 8.0的Tris-HCl、NaCl和Tween20中的一种或多种。
各组分优选以冻干形式，例如以一种或多种所谓的冻干珠的形式实现。冻干珠通常可以被理解为是指在制造后（在所述制造后物质通常作为粉末存在）被压制成球形的冻干物。因此，可以例如以冻干形式提供PCR批次所需的组分，特别是酶、核酸组分以及反应缓冲剂组分等。以这种方式，可以通过添加待定量的样品以及任选其它所需组分以对于用户非常友好的方式直接开始PCR过程。特别地，冻干形式的提供非常有利于自动化应用。在一些优选的实施方式中，所述过程质控品是冻干的。进一步具体地，所述的过程质控品以冻干球的形式封装在一体化微流控芯片中。
进一步的，所述的试剂盒在一体化芯片上完成样本的核酸提取、纯化、扩增和检测。
进一步的，所述的微流控芯片可用于CarryOn P1000F快速核酸检测设备。
进一步的，所述的微流控芯片是一体化微流控芯片。
本发明的第三方面，涉及一种检测水稻病原菌的方法，包括：
使用如上所述的试剂盒或微流控芯片对待检测样品进行检测的步骤；
所述水稻病原菌包括水稻细菌性条斑病菌、水稻白叶枯病菌和水稻细菌性谷枯病菌中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述待检测样品包括水稻样本、土壤样本和水样本中的至少一种，或者怀疑含水稻病原菌的任何样本。
本文所用的“水稻样品”是指固体，粘性或液体物质或制剂，典型的实例可包括水稻的根，叶，茎，花，种子，果实或其它部分。
水稻样本可预先经过研磨、压实、降解、干燥、润湿等常规处理，只要该处理对病原菌的检测不产生显著干扰。
进一步具体地，上述步骤采用CarryOn P1000F快速核酸检测设备，在（一体化）微流控芯片上进行。
在一些实施方案中，检测水稻病原菌的方法还包括从怀疑含有水稻病原菌的成分中分离DNA（特别是基因组DNA）。如本文所用，术语“分离”指的是：（1）基本上或基本上不含通常伴随或与天然存在的环境中的材料相互作用的组分，（2）基本上或基本上不含伴随或相互作用加工形式的材料的组分，例如在饮料或食品中或从在分离过程中使用的物质中，或者（3）如果该材料在其自然环境中，则该材料已经通过故意的人为干预组合物而改变和/或放置在细胞中不同于该材料固有的位点的位点处。当使用术语“基本上纯化的”时，该命名将指其中蛋白质或肽形成组合物主要组分的组合物，例如占组合物的约50%，约60%，约70%，约80%，约90%，约95%或更多（即，例如，重量/重量和/或重量/体积）。如本文所用，术语“基本上纯化的”是指核酸分子（特别是DNA），其从它们的自然环境或植物中除去，分离或分离，并且至少60%游离，优选75%游离，更优选90%不含它们天然相关的其它组分。
从待检测样品中分离植物DNA片段可包括使用分离溶剂，如甲醇，乙醇，水，丙酮或其组合。在一些实施方案中，可以使用DNA分离试剂盒的试剂盒，包括例如使用DneasyMericon食品试剂盒（Qiagen，Germantown，MD，USA）或十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)DNA分离方案。其它分离技术包括裂解，加热，醇沉淀，盐沉淀，有机分离，固相分离，二氧化硅原膜分离，CSCL梯度纯化，或其任意组合。在一些具体的实施方式中，采用如上所述的纯化试剂提取并纯化待检测样品中的DNA。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以参考本领域已知的其它实验方法，或者按照制造厂商所建议的条件。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
1.试剂及仪器
（1）本申请实施例中所用的试剂信息详见下表1。
表1 试剂及厂家
（2）本申请所用的仪器信息详见下表2。
表2 仪器及厂家
本申请所用的整体设备即PCR反应装置详见专利202110057507.0，用于核酸检测的芯片装置详见202110055537.8。
实施例1
本实施例提供了一种检测水稻细菌性条斑病菌、水稻白叶枯病菌和水稻细菌性谷枯病菌的微流控芯片试剂盒
一、引物和探针
引物和探针包含如下组分：
（1）用于检测水稻细菌性条斑病菌的Xoc的引物探针：
F：SEQ ID NO:1：5'-CTACGTCTCATGTTTCCTTTGA-3'；
R：SEQ ID NO:2：5'-TTTGTACTCCGGCGTAGAC-3'；
P：SEQ ID NO:3：5'-ACGCAGAATCCAAAAGCGTCCTAGA-3'；
（2）用于检测水稻白叶枯病菌的Xoo引物探针：
F：SEQ ID NO:4：5'-CATCAATGATCCCGTTCTGG-3'；
R：SEQ ID NO:5：5'-CCCCATGAAGAACTTCGC-3'；
P：SEQ ID NO:6：5'-TCGCCGACTTCACACACGACT-3'；
（3）用于检测水稻细菌性谷枯病菌的Bglm引物探针：
F：SEQ ID NO:7：5'-AGGGATACTGAGCAGTTGTCA-3'；
R：SEQ ID NO:8：5'-AGCCGATAAGCGCTACTTCT-3'；
P：SEQ ID NO:9：5'-TGGCGATTGAGCCAGTCAGAGGAT-3'；
（4）用于检测水稻内参的PLD引物探针：
F：SEQ ID NO:10：5'-TGGTGAGCGTTTTGCAGTCT-3'；
R：SEQ ID NO:11：5'-CTGATCCACTAGCAGGAGGTCC-3'；
P：SEQ ID NO:12：5'-TGTTGTGCTGCCAATGTGGCCTG-3'；
（5）用于检测过程质控品的IPC引物探针：
F：SEQ ID NO:13：5'-AGTTGCAGTGTAACCGTCATGTA-3'；
R：SEQ ID NO:14：5'-TCGACGAGACTCTGCTGTTAA-3'；
P：SEQ ID NO:15：5'-CAGTAATCTGCGTCGCACGTGTGCA-3'。
水稻细菌性条斑病菌的引物探针组合用于检测水稻细菌性条斑病菌的假定膜蛋白基因，水稻白叶枯病菌的引物探针组合用于检测水稻白叶枯病菌的Tale基因，水稻细菌性谷枯病菌的引物探针组合用于检测水稻细菌性谷枯病菌的ITS序列。
二、试剂盒的组成
（1）包括上述的引物探针组合，其中，Xoc引物探针组合物的浓度为引物0.3μM，探针0.1μM；Xoo引物探针组合物的浓度为引物0.3μM，探针0.1μM；Bglm引物探针组合物的浓度为引物0.15μM，探针0.15μM；PLD引物探针组合物的浓度为引物0.2μM，探针0.2μM；IPC引物探针组合物的浓度为引物0.15μM，探针0.15μM。
（2）还包括纯化试剂，冻干反应试剂和冻干IPC内部质控品。
1）所述的纯化试剂包括裂解液400μL和洗脱液850μL，所述的裂解液包括6M 盐酸胍、0.4M 醋酸钠（pH4.7）和2% Triton X-100，所述的洗脱液包括10mMTris-HCl（pH 8.5），将纯化试剂加入芯片中的加样层，所述的磁珠干化方法见专利202110222434.6。
2）所述风干RT-qPCR反应试剂体系如下表3所示。
表3 风干RT-qPCR反应试剂体系
将上述表3试剂加入一体化微流控芯片的反应仓中，将芯片放入鼓风干燥箱，按照Air-Dryable 1-Step RT-qPCR Mix说明书进行风干操作。
3）所述冻干IPC过程质控品包括IPC质粒的制备和冻干试剂体系。
将IPC基因（SEQ ID NO：16：5'-AGTTGCAGTGTAACCGTCATGTAC CAGTAATCTGCGTCGCACGTGTGCACCTAGTCTAATCACTTATGACTCAGATAACTTAACAGCAGAGTCTCGTCGA-3'）连接到pUC18载体中构建包含IPC扩增子序列的DNA质粒。
所述冻干IPC试剂体系如下表4所示。
表4 冻干IPC试剂体系
将上述表4试剂每5µL滴到液氮中制成冻干球，放入西林瓶中按照下表5的冷冻干燥机冻干程序进行冻干。
表5 冻干程序
将冻干球放入已风干反应试剂的芯片上，组装成一体化检测试剂盒。
实施例2
本实施例提供了实施例1中所提供的水稻细菌性条斑病菌、水稻白叶枯病菌和水稻细菌性谷枯病菌检测试剂盒的使用方法。
采用CarryOn P1000F进行本申请所述的水稻细菌性条斑病菌、水稻白叶枯病菌和水稻细菌性谷枯病菌的检测，具体检测步骤如下表6所示。
表6
实时定量PCR反应程序为：55℃ 4min30s；95℃ 1min；（95℃ 8s，60℃ 16s），45cycles。
实验例1 灵敏度检测
水稻细菌性条斑病菌，水稻白叶枯病菌和水稻细菌性谷枯病菌均来自中国检验检疫科学研究院。水稻细菌性条斑病菌X1的浓度为4.12×107CFU/mL，水稻白叶枯病菌OP0的浓度为5.09×107CFU/mL，水稻细菌性谷枯病菌BP1的浓度为1.94×106CFU/mL，依次进行10倍稀释，所有菌液上样量为5μL，与45μL 10mM Tris-HCl（pH8.0）混合共50μL加入芯片样本仓。按照上述实施例对上述样品进行检测，其检测结果如下表7所示，检测曲线如图1所示。
表7
由上表7可知，本申请所述的引物组合物及其试剂盒具有较好的灵敏度，水稻细菌性谷枯的菌液可检测到2次方，水稻细菌性条斑和水稻白叶枯的菌液可以检测到3次方。
实验例2 重复性检测
使用0.3g感染水稻细菌性条斑病菌的水稻种子加入3mL无菌水，剧烈震荡1分钟后取上清40μL，与5μL OP3菌液和5μL BP4菌液混合，共50μL加入微流控芯片样本仓。按照上述实施例的体系和步骤对上述样品进行检测，重复检测10次，检测结果如下表8所示。
表8
由表8可知，整体来看本申请所述的引物组合物及其试剂盒具有较好的重复性。
实验例3 特异性检测
为证明试剂盒的交叉反应性，选取了五株水稻细菌性条斑及水稻白叶枯的同属近缘对照菌，选取了五株水稻细菌性谷枯同属近缘对照菌，选取了八株水稻上其他致病菌。每种对照菌上样量为5μL，与45μL 10mM TrisHCl（pH8.0）混合共50μL加入芯片样本仓。同时取一株水稻细菌性条斑病菌、水稻白叶枯病菌和水稻细菌性谷枯病菌作为对照进行扩增检测，上样方法与阴性对照菌相同。按照上述实施例1-3的体系和步骤对上述提取的样品进行检测，其检测结果如下表9所示。
表9
其中，以上IPC的检测结果Ct值为过程对照扩增结果。本申请所述的水稻细菌性条斑病菌引物探针组合物、水稻白叶枯病菌引物探针组合物、水稻细菌性谷枯病菌引物探针组合物未扩增到产物。因此，其检测结果为阴性。
由上表9可知，本申请所述的引物组合物及其试剂盒具有较好的特异性。
实验例4 荧光串扰实验
为检测设备FAM通道和HEX通道没有荧光串扰，保证水稻细菌性条斑病菌和水稻白叶枯病菌检测结果的可靠性，在样本中单独扩增水稻细菌性条斑病菌质控品或单独扩增水稻白叶枯病菌，扩增结果如下表10。
表10
扩增结果图见图3，由以上结果可知，试剂盒在手持设备上运行FAM和HEX通道间不存在串扰，不会影响扩增结果。设备Cy5一般对Cy5.5有微弱串扰，但是Cy5.5是过程质控品IPC，是每个反应都必须起峰的靶标，并且IPC起峰非常强，所以可以认为串扰对于IPC没有影响，后续算法处理时也会将Cy5对Cy5.5的串扰进行屏蔽。
综上所述，本实施例利用一体化芯片上微流控的方式集成了核酸提取、纯化、扩增和检测，解决病原体快速检测的问题，实现“样本进，结果出”的POCT检测方案，取样后直接加入设备，纯化加扩增，35分钟内出结果。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
Claims (23)
1.用于检测水稻病原菌的引物探针组合产品，其特征在于，包含a)~c)中的一种或多种：
a) 核苷酸序列为SEQ ID NO：1~2所示的引物以及SEQ ID NO：3所示的探针，其中SEQID NO：1为5'-CTACGTCTCATGTTTCCTTTGA-3'， SEQ ID NO：2为5'-TTTGTACTCCGGCGTAGAC-3'，SEQ ID NO：3为5'-ACGCAGAATCCAAAAGCGTCCTAGA-3'；
b) 核苷酸序列为SEQ ID NO：4~5所示的引物以及SEQ ID NO：6所示的探针，其中SEQID NO：4为5'-CATCAATGATCCCGTTCTGG-3'， SEQ ID NO：5为5'-CCCCATGAAGAACTTCGC-3'，SEQ ID NO：6为5'-TCGCCGACTTCACACACGACT-3'；
c) 核苷酸序列为SEQ ID NO：7~8所示的引物以及SEQ ID NO：9所示的探针，其中SEQID NO：7为5'-AGGGATACTGAGCAGTTGTCA-3'， SEQ ID NO：8为5'-AGCCGATAAGCGCTACTTCT-3'，SEQ ID NO：9为5'-TGGCGATTGAGCCAGTCAGAGGAT-3'。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合产品，其特征在于，还包含d)：
d) 用于检测内参基因的引物和探针。
3.根据权利要求2所述的引物探针组合产品，其特征在于，所述内参基因源自水稻PLD基因。
4. 根据权利要求2所述的引物探针组合产品，其特征在于，d) 为核苷酸序列为SEQ IDNO：10~11所示的引物以及SEQ ID NO：12所示的探针，其中SEQ ID NO：10为5'-TGGTGAGCGTTTTGCA GTCT-3'， SEQ ID NO：11为5'-CTGATCCACTAGCAGGAGGTCC-3'，SEQ IDNO：12为5'-TGTTGTGCTGCCAATGTGGCCTG-3'。
5.根据权利要求1所述的引物探针组合产品，其特征在于，还包含e)：
e) 用于检测过程质控品的引物和探针。
6. 根据权利要求5所述的引物探针组合产品，其特征在于，e) 为核苷酸序列为SEQ IDNO：13~14所示的引物以及SEQ ID NO：15所示的探针，其中SEQ ID NO：13为5'-AGTTGCAGTGTAACCGTCATGTA-3'， SEQ ID NO：14为5'-TCGACGAGACTCTGCTGTTAA-3'，SEQ IDNO：15为5'-CAGTAATCTGCGTCGCACGTGTGCA-3'。
7.根据权利要求1~6中任一项所述的引物探针组合产品，其特征在于，所述探针均为自身淬灭探针。
8. 根据权利要求7所述的引物探针组合产品，其特征在于，各探针的荧光发射基团独立地选自AMCA、Pacific Blue、Atto 425、BODIPY FL、FAM、Alexa Fluor 488、TET、JOE、Yakima Yellow、VIC、HEX、Quasar 570、Cy3、NED、TAMRA、ROX、Aqua Phluor593、Texas Red、Atto 590、Cy5、Quasar 670和Cy5.5中的任一种。
9.根据权利要求8所述的引物探针组合产品，其特征在于，各探针的荧光发射基团所携带的荧光信号可区分。
10.根据权利要求7所述的引物探针组合产品，其特征在于，各探针的淬灭基团独立地选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl、Eclipse以及MGB中的任一种。
11.含有根据权利要求1~10中任一项所述的引物探针组合产品的试剂盒。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其还包括纯化试剂、qPCR反应试剂和过程质控品中的至少一种。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述的纯化试剂包括裂解液、洗脱液和磁珠。
14. 根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述的裂解液包括盐酸胍、醋酸钠和Triton X-100。
15.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述的洗脱液包括Tris-HCl。
16.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述的裂解液和洗脱液的体积比为1:(2-2.5)。
17.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述的磁珠为干化磁珠。
18. 根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述过程质控品包含SEQ ID NO：16所示序列，其中SEQ ID NO：16为5'-AGTTGCAGTGT AACCGTCATGTACCAGTAATCTGCGTCGCACGTGTGCACCTAGTCTAATCACTTATGACTCAGATAACTTAACAGCAGAGTCTCGTCGA-3'。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，其特征在于，所述过程质控品是质粒。
20. 根据权利要求18所述的试剂盒，其特征在于，所述过程质控品是冻干品，并且还包括甘露醇、海藻糖、牛血清白蛋白、消泡剂、2-羟丙基-β-环糊精、pH 8.0的Tris-HCl、NaCl和Tween20中的一种或多种。
21.含有根据权利要求1~10中任一项所述的引物探针组合产品的微流控芯片。
22.检测水稻病原菌的方法，其特征在于，包括：
使用根据权利要求11~20中任一项所述的试剂盒或根据权利要求21所述的微流控芯片对待检测样品进行检测的步骤；
所述水稻病原菌包括水稻细菌性条斑病菌、水稻白叶枯病菌和水稻细菌性谷枯病菌中的一种或多种。
23.根据权利要求22所述的检测水稻病原菌的方法，其特征在于，所述待检测样品包括水稻样本、土壤样本和水样本中的至少一种。
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| GR01 | Patent grant | ||
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