CN111440891B - 用于鉴别冬虫夏草原产地的dna条形码组合物及其应用 - Google Patents

用于鉴别冬虫夏草原产地的dna条形码组合物及其应用 Download PDF

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CN111440891B CN202010240220.7A CN202010240220A CN111440891B CN 111440891 B CN111440891 B CN 111440891B CN 202010240220 A CN202010240220 A CN 202010240220A CN 111440891 B CN111440891 B CN 111440891B
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Abstract

本发明提供了一种用于鉴别冬虫夏草原产地的DNA条形码组合物，所述DNA条形码组合物为代表冬虫夏草的不同原产地的CO1基因的片段。本发明提供了所述DNA条形码组合物及其扩增引物在鉴别冬虫夏草的原产地中的应用。本发明还提供了一种用于鉴别冬虫夏草的原产地的方法。本发明基于冬虫夏草菌寄主蝙蝠蛾幼虫迁移能力弱，且分布地仅限我国高海拔区域的特点，建立了一套简单、快速、易操作的鉴别冬虫夏草原产地的方法。

Description

用于鉴别冬虫夏草原产地的DNA条形码组合物及其应用
技术领域
本发明属于中药检测领域，尤其涉及一种用于鉴别冬虫夏草原产地的DNA条形码组合物。本发明还涉及用于扩增所述DNA条形码组合物的引物、鉴别冬虫夏草原产地的方法和试剂盒。
背景技术
冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis Berk.Sacc.)是我国名贵的传统中草药材，其滋补功效和营养价值备受人们的追崇，近年来市场价格也在逐年上涨，现代医学界认可的冬虫夏草功能包括调节人体免疫系统、内分泌系统以及循环系统，抗癌，抗氧化，延缓人体衰老等。冬虫夏草由蝙蝠蛾(鳞翅目Lepidoptera蝙蝠蛾科Hepialidae蝙蝠蛾属Hepiaua)的幼虫虫体以及从其头部长出的真菌子座连接形成，主要分布于我国西藏、青海、四川、云南、甘肃这五个省份3000米以上的高海拔地区。冬虫夏草的产地非常广泛，但并不是所有产地的冬虫夏草都是高品质冬虫夏草，人们通常认为西藏那曲以及青海玉树的冬虫夏草最为优质。
现有的对冬虫夏草的鉴别主要是真伪鉴别，方法包括形态鉴定法(通过看、闻、摸等方法观察冬虫夏草外部特征)和化学成分分离鉴定法。最近几年，其他的鉴定方法如蛋白质指纹图谱测定法、双重PCR、Bar-HRM等方法飞速发展，这些方法的发展在一定程度上抑制了伪品药材的泛滥。但是，传统的形态学鉴定具有一定的风险，没有长期的经验积累很难做出准确判断；化学成分鉴定法专业性较强，且耗时长，也不适用于一般的鉴定。基于核酸分子的检测技术因比其他方法对样品形态、大小等要求低，灵敏度高，可操作性强而逐渐兴起。陈士林于2015年报道了采用冬虫夏草真菌ITS2序列与数据库比对来鉴定真伪，但由于冬虫夏草菌的不同生长阶段导致该方法具有一定的缺陷；张富丽等人于2017年报道了采用二重PCR检测冬虫夏草真伪，相比前面所述的方法，其实用性和准确性更强，能够有效区别冬虫夏草与伪品。但是，除此之外，消费者真正想了解的还有他们打算购买的冬虫夏草与商家描述的原产地是否一致。然而，现有技术中，对于如何识别冬虫夏草产地，没有统一的严谨的标准，普通消费者甚至中药产业的从业者也对此缺乏合理的科学判断的依据，单纯依靠传统的经验可能无法准确识别冬虫夏草产地。
因此，当前亟需一种有效的鉴别冬虫夏草原产地的方法。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供一种用于鉴别冬虫夏草原产地的DNA条形码组合物。本发明还提供了用于扩增所述DNA条形码的引物、鉴别冬虫夏草原产地的方法和试剂盒。本发明提供的方法成本低、耗时短、全套流程不超过两天即可完成，适用性很强。
一方面，本发明提供了一种用于鉴别冬虫夏草原产地的DNA条形码组合物，所述DNA条形码组合物为代表冬虫夏草的不同原产地的CO1基因的片段。
具体地，所述CO1基因的片段如SEQ ID NO:1-10所示。
另一方面，本发明提供了用于扩增所述DNA条形码的引物序列，其中，所述引物序列为昆虫的通用引物LCO-1490和HCO-2198，其具有分别如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的序列。
SEQ ID NO:11GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG
SEQ ID NO:12TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA
再一方面，本发明提供了所述DNA条形码组合物及其扩增引物在鉴别冬虫夏草的原产地中的应用。
本发明还提供了一种用于鉴别冬虫夏草的原产地的方法，所述方法包括以下步骤：
1)从待测的样品中分离并提取冬虫夏草虫体部分的DNA；
2)以步骤1)提取的总DNA为模板，使用LCO-1490和HCO-2198进行PCR扩增，得到扩增产物；
3)将步骤2)扩增得到的产物进行测序；
4)将测序得到的序列与所述冬虫夏草的DNA条形码组合物进行系统发育树重建，根据聚类结果即可判断待测样品的原产地。
根据本发明所述的方法，其中，在步骤1)中，所述待测样品为20-30mg，选自粉末状或完整的冬虫夏草；
根据本发明所述的方法，其中，在步骤1)中，所述提取使用市面上销售的任何DNA提取试剂盒，按照试剂盒步骤获取冬虫夏草上虫体部分的DNA；
根据本发明所述的方法，其中，在步骤2)中，扩增得到冬虫夏草虫体的DNA条形码，即CO1基因的片段。
根据本发明所述的方法，其中，在步骤2)中，所述PCR扩增的反应体系为：缓冲液3μL、Mg2+溶液3μL、dNTP溶液3μL、LA Taq聚合酶0.3μL、去离子水15.7μL、正向引物LCO-1490 1μL、反向引物HCO-2198 1μL、DNA模板3μL，共30μL。
根据本发明所述的方法，其中，在步骤2)中，所述PCR扩增的反应程序为：(a)94℃预变性2min；(b)94℃变性50s，48℃退火50s，72℃延伸1min，其中变性到延伸重复30个循环；(c)72℃延伸6min。
根据本发明所述的方法，其中，在步骤3)中，所述产物的目的条带为长度658bp的条带。
根据本发明所述的方法，其中，在步骤4)中，使用BioEdit、MEGA、IQ-TREE重建系统发育树。
本发明还提供了一种用于鉴别冬虫夏草的原产地的试剂盒，所述试剂盒包括，用于扩增DNA条形码CO1基因的片段的PCR反应体系；
优选地，所述试剂盒还包括包含代表冬虫夏草的不同原产地的DNA条形码组合物的说明书。
更优选地，所述PCR反应体系包含:
缓冲液3μL、Mg2+溶液3μL、dNTP溶液3μL、LA Taq聚合酶0.3μL、去离子水15.7μL、正向引物LCO-1490 1μL、反向引物HCO-2198 1μL、DNA模板3μL。
申请人在研究过程中，出乎意料地发现，由于冬虫夏草的真菌寄主蝙蝠蛾幼虫迁移能力弱，且分布地仅限我国高海拔区域，不同生活环境的蝙蝠蛾形成了特殊的分化。因此，对不同生活环境的蝙蝠蛾的DNA条形码进行序列比对可以解决冬虫夏草原产地追溯的问题。与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明操作方法简便，流程简洁，准确性高，适合推广。
(2)本发明基于前人鉴定冬虫夏草真伪的基础，结合冬虫夏草菌寄主蝙蝠蛾幼虫迁移能力弱，且分布地仅限我国高海拔区域的特点，通过获取冬虫夏草虫体部分的DNA条形码基因序列，建立一套简单快速易操作的流程追溯冬虫夏草原产地。
(3)本发明对冬虫夏草样品的形态、大小等无特殊要求，不需要针对样品设计特异性引物，通过通用引物即可获得完整的虫体DNA条形码片段，目的性强。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为根据本发明的方法的流程图。
图2为根据本发明的方法，获得待测样品的DNA条形码序列，在NCBI数据库中blast比对结果(鉴定结果为小金蝠蛾)以及相关参考文献。
图3为根据本发明的方法，获得待测样品的DNA条形码序列，与已有的DNA条形码通过MEGA软件进行序列比对的部分截图。
图4为根据本发明的方法，获得待测样品的DNA条形码序列，通过IQ-TREE重建的系统发育树(仅截取了部分)，方框3部分为西藏墨竹的样品，方框2部分为甘肃碌曲的样品，方框1部分为四川小金县的样品，其中Q05和Q09开头的是本发明中进行测试的样品，其余序列来自于NCBI数据库；其中，方框显示本发明测试的小金蝠蛾样品与NCBI数据库中的四川小金县的小金蝠蛾样品聚在了一起，由此可推断待测样品的原产地为四川省。
具体实施方式
以下部分将结合附图说明对本发明做进一步说明。
实施例1待测样品的DNA条形码的获得
申请人选取了标注产地为四川小金县的冬虫夏草，并根据以下方法获得其DNA条形码序列。
1)从待测的样品中分离并提取冬虫夏草虫体部分的DNA；
2)以步骤1)提取的总DNA为模板，使用LCO-1490和HCO-2198进行PCR扩增，得到扩增产物；
3)将步骤2)扩增得到的产物进行测序；
其中，DNA条形码序列的通用引物对为：
LCO-1490：GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG
HCO-2198：TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA
步骤1)中本发明测试使用的试剂盒为凯杰Blood&Tissue Kit(Cat.No.69506)，具体操作参照试剂盒说明页；
步骤2)中，利用获取的DNA模板，结合昆虫通用引物进行PCR扩增；
在步骤2)中，所述PCR扩增的反应体系为：缓冲液(TaKaRa PCR Buffer)3-5μL、Mg2+溶液(TaKaRa 25mM MgCl2)3-5μL、dNTP溶液(TaKaRa dNTP Mixture)3-5μL、LA Taq聚合酶0.3-0.5μL、去离子水15.7-27.5μL、正向引物LCO-1490 1μL、反向引物HCO-2198 1μL、DNA模板3μL，共30-48μL。
根据本发明所述的方法，其中，在步骤2)中，所述PCR扩增的反应程序为：(a)94℃预变性2min；(b)94℃变性50s，48℃退火50s，72℃延伸1min，其中变性到延伸重复30个循环；(c)72℃延伸6min。
通过步骤2)获得了本发明需要的DNA条形码片段，如步骤3)所示，将获得的PCR产物送至测序公司进行测序，获取CO1基因的序列；
步骤3)本发明测试样品的测序公司为美吉生物科技公司，该步对测序公司没有特殊的要求，常见的生物公司均可完成该测序工作；
如图2所示，展示了本发明测试样品之一测序获得的CO1基因序列，通过将该序列上传到NCBI数据库中Blast比对得到该样品的拉丁名为：Hepialus xiaojinensis Tu.主要分布地为四川小金县及周边地区。同时图2也显示了相关参考文献。
图3所示的是本发明测试的样品与数据库已有序列通过MEGA软件比对的部分截图。将序列与数据库比对之后，通过检索数据库相关的基因，将这些序列下载下来同本发明的测试样品序列同时导入到MEGA软件中进行序列比对。
步骤4为系统发育分析，重建系统发育树。本发明使用的软件为IQ-TREE。
附图4为本发明通过IQ-TREE重建的系统发育树(仅截取了部分)，方框1显示本发明测试的小金蝠蛾样品与NCBI数据库中的四川小金县的小金蝠蛾样品聚在了一起，由此可推断我们测试的样品的原产地为四川省。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Figure BDA0002432281430000061
Figure BDA0002432281430000071
Figure BDA0002432281430000081
Figure BDA0002432281430000091
序列表
<110> 中国科学院动物研究所
<120> 用于鉴别冬虫夏草原产地的DNA条形码组合物及其应用
<130> DIC19110079
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 654
<212> DNA
<213> Hepialus xiaojinensis
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attagttcct ttaatattag gggcccctga tatagctttc ccacgactta ataacataag 240
attttgattg ctacctcctt cactaatact attaatttct agaagaattg tagaaaatgg 300
ggcaggaaca ggttgaactg tttatccccc tttatcttca aatattgccc actcaggagc 360
gtctgtagac ttagctattt tctctttaca tttagcagga atttcatcaa ttttaggggc 420
aatcaatttt attactactg taattaatat acgatcaaaa agaatatctt ttgaccgtat 480
acctttattt gtgtgaagag ttgtaattac agcactttta cttttattgt cattgccagt 540
actggccgga gctatcacta tactattaac agatcgaaat ttaaatactt cattttttga 600
tcctgccggt gggggtgacc ctattttata tcaacatcta ttttgatttt ttgg 654
<210> 10
<211> 654
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
ttttggtatt tgatcaggaa tagtgggaac atccttaaga ataataattc gaacagaatt 60
aggaaatcct ggatctttaa ttggagatga tcaaatttat aatgtaattg ttacagctca 120
tgcttttatt ataatttttt ttatagtaat accaattata attggtggtt ttgggaattg 180
attaattcct ttaatattag gggctcccga tatagcattt ccacgactta ataatataag 240
attttgatta ttacctccat cattaatatt attaatttct agtagaattg tagaaaacgg 300
ggcaggaaca ggttgaactg tatatccccc attatcatca aatattgcac attctggggc 360
atccgtagat ttagctattt tttctttaca tctagcagga atttcatcaa ttttaggggc 420
aattaatttt atcactactg taattaatat acgatcaaaa agaatatctt ttgatcgtat 480
accattattt gtatgaagag ttgtaattac tgcattatta cttttactat cattacctgt 540
attagcagga gctattacta tactactaac agatcgaaac ttaaatacct catttttcga 600
tcctgcagga ggtggtgacc ctattctata tcaacattta ttttgatttt ttgg 654
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
ggtcaacaaa tcataaagat attgg 25
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
taaacttcag ggtgaccaaa aaatca 26

Claims (6)

1.一种DNA条形码组合物及其引物序列在鉴别冬虫夏草的原产地中的应用；
其中，所述DNA条形码组合物为代表冬虫夏草的不同原产地的CO1基因的片段，如SEQID NO:1-10所示；
所述引物序列为昆虫的通用引物LCO-1490和HCO-2198。
2.一种用于鉴别冬虫夏草的原产地的方法，所述方法包括以下步骤：
1)从待测的样品中分离并提取冬虫夏草虫体部分的DNA；
2)以步骤1)提取的总DNA为模板，使用通用引物LCO-1490和HCO-2198进行PCR扩增，得到扩增产物；
3)将步骤2)扩增得到的产物进行测序；
4)将测序得到的序列与如SEQ ID NO:1-10所示的DNA条形码组合物进行系统发育树重建，根据聚类结果即可判断待测样品的原产地。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，在步骤2)中，所述PCR扩增的反应体系为：缓冲液3-5μL、Mg2+溶液3-5μL、dNTP溶液3-5μL、LA Taq聚合酶0.3-0.5μL、去离子水15.7-27.5μL、正向引物LCO-1490 1μL、反向引物HCO-2198 1μL、DNA模板3μL，共30-48μL。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中，在步骤2)中，所述PCR扩增的反应程序为：(a)94℃预变性2min；(b)94℃变性50s，48℃退火50s，72℃延伸1min，其中变性到延伸重复30个循环；(c)72℃延伸6min。
5.根据权利要求2所述的方法，其中，在步骤3)中，所述产物的目的条带为长度658bp的条带。
6.根据权利要求2所述的方法，其中，在步骤4)中，使用BioEdit、MEGA、IQ-TREE重建系统发育树。
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