CN109609664A - 用于鉴定木瓜秀粉蚧的特异性引物及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于鉴定木瓜秀粉蚧的特异性引物及其检测方法，所述特异性引物序列如下：28S‑parF：5’‑CGGAATTCAGAATTTGTGGCGTTTAC‑3’；28S‑marR：5’‑CGGCCATATTACAAGAAT‑3’。本发明基于28S rDNA种特异性PCR方法，建立了木瓜秀粉蚧快速检测方法，该方法完全可用于木瓜秀粉蚧的准确鉴别及其检测监测，对保障农产品进出口安全、有效阻截其进一步扩张蔓延意义重大。

Description

用于鉴定木瓜秀粉蚧的特异性引物及其检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于鉴定木瓜秀粉蚧的特异性引物及其检测方法。

背景技术

木瓜秀粉蚧(Paracoccus marginatus Williams and Granara de Willink)，又称木瓜粉蚧，英文名papaya mealybug，隶属于半翅目(Hemiptera)蚧总科(Coccoidea)粉蚧科(Pseudococcidae)秀粉蚧属(Paracoccus)。其寄主范围广泛，是一种重要的农林业害虫。该虫一般被认为原产于墨西哥或（/和）中美洲地区。1955年首次在墨西哥采集到木瓜秀粉蚧，1992年Williams 和 Granara de Willink对从伯利兹、哥斯达黎加、瓜地马拉和墨西哥的新热带地区采集到的木瓜粉蚧进行了描述并发表为新种。

木瓜秀粉蚧自从1995年在圣马丁报道危害之后，随即扩散至中美洲、北美洲、太平洋地区、非洲、亚洲等地区至少20个国家或地区，并给中美洲部分国家、佛罗里达州、夏威夷、关岛、印尼、印度、斯里兰卡等国家或地区的木瓜产业造成严重损失。2010年木瓜秀粉蚧入侵中国台湾；2013年我国首次在云南采集到该虫； 2017年9月在福建省福州市仓山区的木瓜和茄子上发现该虫危害，同年10月于福建省漳州市天宝镇木瓜和肿柄菊上均有采集到该虫。

木瓜秀粉蚧是一种多食性害虫，其寄主包括果树、粮食、观赏花卉以及绿植杂草等68科264种植物，是一种蔓延性强，生命力强，繁殖力强的重要潜在经济害虫。与其他粉蚧相同，木瓜秀粉蚧以口针刺吸寄主植物的汁液为食，导致寄主植物的叶片畸形、失绿、脱落，严重影响果实品质，其分泌的蜜露尚能诱发煤烟病，影响寄主植物的光合作用，甚至导致植株死亡。

目前，木瓜秀粉蚧的鉴定主要依靠雌成虫的外部形态特征。粉蚧类昆虫由于其体型较小，且形态特征差异极其微小，特别是近缘种粉蚧更是难以区分鉴定。区分识别粉蚧对技术人员的鉴定水平具有较高的要求，依据传统形态学特征鉴定粉蚧费时费力。因此，目前需要开发出一套科学先进的快速检测和区分鉴定木瓜秀粉蚧的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供用于鉴定木瓜秀粉蚧的特异性引物及其检测方法，通过对木瓜秀粉蚧28S rDNA的序列分析，并基于28S rDNA的种特异性PCR方法设计了木瓜秀粉蚧的特异性引物，并通过与其他粉蚧类昆虫对照，进行种特异性的验证。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

用于鉴定木瓜秀粉蚧的特异性引物，序列如下：

28S-parF：5’-CGGAATTCAGAATTTGTGGCGTTTAC-3’；

28S-marR：5’-CGGCCATATTACAAGAAT-3’。

所述的引物在鉴定木瓜秀粉蚧中的应用。

以待测样本的基因组DNA为模板，以所述的特异性引物作为扩增引物进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测：如果电泳结果出现446 bp DNA目的条带，则待测样本为木瓜秀粉蚧。

所述PCR扩增体系为为：2xTaq PCR MasterMix12.5 μL，上游引物、下游引物各1.5μL，模板DNA 1 μL，ddH₂O 8.5 μL；

PCR反应参数为：94℃预变性4 min，94℃变性1 min，56℃退火1 min,72℃延伸1.5min，运行30个循环；最后72℃延伸10 min。

包含所述的引物的试剂盒。

本发明的优点在于：

本发明的特异性引物可对木瓜秀粉蚧进行快速的分子鉴定，方法简单、准确、灵敏度高，可以运用于木瓜秀粉蚧的快速检测中，为农产品进出品过程中木瓜秀粉蚧的检疫检测和控制木瓜秀粉蚧的扩散及危害提供了技术保障。

附图说明

图1. 粉蚧28S通用引物S3660/A335对11种粉蚧的扩增结果电泳检测，M：DNA分子量标准DNA ladder； 1. 木瓜秀粉蚧Paracoccus marginatus；2. 扶桑绵粉蚧Phenacoccus solenopsis；3. 甘蔗灰粉蚧Dysmicoccus boninsis；4. 柑橘堆蜡粉蚧 Nipaecoccus viridis；5. 石蒜绵粉蚧Phenacoccus solani；6. 康氏粉蚧Pseudococcus comstocki；7.桔小粉蚧Pseudococcus cryptus；8. 南洋臀纹粉蚧Planococcus lilacinus；9. 大洋臀纹粉蚧Planococcus minor；10. 美地绵粉蚧Phenacoccus madeirensis；11. Pseudococcus odermatti；12. 阴性对照（ddH₂O）。

图2 木瓜秀粉蚧种特异性引物28S-parF/marR的特异性检验，M：DNA分子量标准DNA ladder； 1. 木瓜秀粉蚧Paracoccus marginatus；2. 扶桑绵粉蚧Phenacoccus solenopsis；3. 甘蔗灰粉蚧Dysmicoccus boninsis；4. 柑橘堆蜡粉蚧 Nipaecoccus viridis；5. 石蒜绵粉蚧Phenacoccus solani；6. 康氏粉蚧Pseudococcus comstocki；7.桔小粉蚧Pseudococcus cryptus；8. 南洋臀纹粉蚧Planococcus lilacinus；9. 大洋臀纹粉蚧Planococcus minor；10. 美地绵粉蚧Phenacoccus madeirensis；11. Pseudococcus odermatti；12. 阴性对照（ddH₂O）。

图3 木瓜秀粉蚧种特异性引物28S-parF/marR对不同寄主/来源/龄期的木瓜秀粉蚧通用性检测，M：DNA分子量标准DNA ladder；1. 福州木瓜Carica papaya from Fuzhou,Fujian；2. 福州茄子Solanum melongena from Fuzhou, Fujian；3. 福州土豆Solanum tuberosum from Fuzhou, Fujian；4. 福州鸡蛋花Plumeria rubra from Fuzhou,Fujian； 5. 漳州木瓜Carica papaya from zhangzhou, Fujian；6. 漳州肿柄菊Tithonia diversifolia from zhangzhou, Fujian；7. 云南景洪假连翘Duranta erecta fromJinghong, Yunnan；8. 2龄若虫The 2nd instar nymphs from Carica papaya；9. 3龄若虫The 3rd instar nymphs from Carica papaya；10. 阴性对照（ddH₂O）。

图4 木瓜秀粉蚧种特异性引物28S-parF/marR对不同浓度DNA的灵敏度检测。M：DNA分子量标准DNA ladder；1. 模板DNA浓度为10.6 ng/μL；2. 模板DNA浓度为1.06 ng/μL；3. 模板DNA浓度为1.06×10^-1 ng/μL；4. 模板DNA浓度为1.06×10^-2 ng/μL；5. 模板DNA浓度为1.06×10^-3 ng/μL；6. 阴性对照（ddH₂O）。

具体实施方式

实施例1

所用的供试粉蚧分别采自福建省的福州市及漳州市，云南省景洪市（见表1），标本浸泡于无水乙醇中，放于-20℃的冰箱中冷冻保存。

表1 供试粉蚧样品的采集信息

粉蚧的28S rDNA通用序列的扩增、电泳检测及序列测定

以表1中供试粉蚧所提得的DNA为模板，以扩增粉蚧28S rDNA基因的通用引物(Gullan,2010)进行PCR扩增，其中通用引物的上游引物S3660：5’-GAGAGTTMAASAGTACGTGAAAC-3’，下游引物A335：5’-TCGGARGGAACCAGCTACTA-3’。该引物委托福州擎科生物公司合成。

PCR反应体系（25 μL体系）为：2xTaq PCR MasterMix(TIANGEN) 12.5 μL，上游引物、下游引物各1.5 μL，模板DNA 4 μL，ddH₂O 5.5 μL；PCR反应参数为：95℃预变性5 min，94℃变性1 min，52℃退火1 min,72℃延伸1.5 min，运行40个循环；最后72℃延伸10 min。

取5 μL PCR产物于琼脂糖含量1.5%的琼脂糖凝胶上，在120V电压下电泳26 min后在紫外凝胶成像系统分析电泳结果。

粉蚧28S rDNA基因序列的测定、比对及结果分析

PCR产物委托广州擎科生物公司纯化、克隆及序列双向测定；利用Chromas软件打开测序所得的DNA图谱，对峰图进行分析和序列单一性检查。通过DNAMAN进行序列拼接，去除两端的序列，保留结果一致的28S rDNA基因片段序列；再将所得DNA序列在NCBI上进行BLAST相似性检索；将相似度99%的序列下载，经DNAMAN软件的多序列比对再次核对，确定序列检测结果。

通过28S rDNA通用引物S3660/A335对木瓜秀粉蚧、扶桑绵粉蚧、甘蔗灰粉蚧、柑橘堆蜡粉蚧、石蒜绵粉蚧、康氏粉蚧、桔小粉蚧、南洋臀纹粉蚧、Pseudococcus odermatti、大洋臀纹粉蚧、美地绵粉蚧等11种粉蚧进行PCR扩增。电泳结果表明，该通用引物对上述11种粉蚧均扩增到约800 bp的条带（图1）。

经测序并将结果进行分析、序列拼接后得到上述11种粉蚧的28S rDNA基因的片段序列。经与GenBank中已发布的相应种类的基因片段序列相比较，相似度均达99%以上。经比对分析，木瓜秀粉蚧与数据库中Paracoccus marginatus isolate S3-668， KP692333的相似度为100%，说明所采集的粉蚧经分子鉴定确定为木瓜秀粉蚧。

实施例2

粉蚧基因组DNA的提取

将单头粉蚧置于洁净滤纸上晾干后，置于1.5 mL的离心管中用相应规格的研磨棒磨碎虫体，之后参照OMEGA昆虫基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）的方法提取粉蚧DNA。

木瓜秀粉蚧特异性引物设计

根据序列测定分析结果，采用木瓜秀粉蚧Paracoccus marginatus (Williams andGranara de Willink)、扶桑绵粉蚧Phenacoccus solenopsis (Tinsley)、甘蔗灰粉蚧Dysmicoccus boninsis (Kuwana)、柑橘堆蜡粉蚧Nipaecoccus viridis (Newstead)和石蒜绵粉蚧Phenacoccus solani (Ferris)的28S rDNA基因片段序列，在DNAMAN上进行比对，选取序列中差异较大的位点，设计木瓜秀粉蚧特异性引物28S-parF/marR。其中，上游引物为28S-parF：5’-CGGAATTCAGAATTTGTGGCGTTTAC-3’；下游引物为28S-marR：5’-CGGCCATATTACAAGAAT-3’；引物由福州擎科生物公司合成。

木瓜秀粉蚧特异性引物的PCR反应体系和参数

木瓜秀粉蚧特异性引物(28S-parF/marR)的PCR反应体系（25 μL体系）为：2xTaq PCRMasterMix(TIANGEN) 12.5 μL，上游引物、下游引物各1.5 μL，模板DNA 1 μL，ddH₂O 8.5 μL。

木瓜秀粉蚧特异性引物(28S-parF/marR)的PCR反应参数为：94℃预变性4 min，94℃变性1 min，56℃退火1 min,72℃延伸1.5 min，运行30个循环；最后72℃延伸10 min。

木瓜秀粉蚧种特异性引物的特异性检测

以福建省内采集的木瓜秀粉蚧Paracoccus marginatus、扶桑绵粉蚧Phenacoccus solenopsis、甘蔗灰粉蚧Dysmicoccus boninsis、柑橘堆蜡粉蚧 Nipaecoccus viridis、石蒜绵粉蚧Phenacoccus solani、康氏粉蚧Pseudococcus comstocki、桔小粉蚧Pseudococcus cryptus、南洋臀纹粉蚧Planococcus lilacinus、Pseudococcus odermatti；以及云南省采集的大洋臀纹粉蚧Planococcus minor、美地绵粉蚧Phenacoccus madeirensis的单头成虫提取的DNA为模板，检测木瓜秀粉蚧种特异性引物效果；其中，以木瓜秀粉蚧为阳性对照，以双蒸水(ddH₂0)代替DNA做阴性对照。按上述提供的体系和参数进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测结果。

利用设计的木瓜秀粉蚧28S rDNA特异性引物28S parF/marR对上述11种粉蚧进行特异性PCR扩增。电泳结果表明，该特异性引物对木瓜秀粉蚧有良好的专属性，成功扩增得到约446 bp产物（图2）。同时，对粉蚧科不同种间的其他粉蚧均无扩增产物，因此认为该引物能特异性识别木瓜秀粉蚧，特异性效果理想。

实施例3

木瓜秀粉蚧种特异性引物的通用性检测

为检测该特异性引物对木瓜秀粉蚧的通用性扩增效果，选取不同寄主来源的木瓜秀粉蚧成虫及木瓜上的木瓜秀粉蚧若虫为模板并提取DNA，以双蒸水(ddH₂0)代替DNA做阴性对照，按实施例2提供的体系和参数进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测结果。

利用设计的木瓜秀粉蚧28S rDNA特异性引物28S parF/marR对不同寄主、不同地区的木瓜秀粉蚧雌成虫以及木瓜上不同龄期的木瓜秀粉蚧进行PCR扩增，电泳结果表明，该特异性引物对不同寄主、不同地区及不同龄期的木瓜秀粉蚧均有良好的扩增效果，均能成功扩增得到约446 bp产物（图3）。因此认为该特异性引物对木瓜秀粉蚧通用性扩增效果理想。

实施例4

木瓜秀粉蚧种特异性引物的灵敏度检测

为确定该特异性引物对模板DNA浓度的反应效果，以木瓜上单头木瓜秀粉蚧提取的DNA为起始参考依据，在NanoDrop 2000C超微量分光光度计上测得DNA浓度，并将该DNA以梯度稀释法，按10倍梯度逐级稀释成5个梯度浓度。以双蒸水代替DNA做阴性对照，按实施例2提供的体系和参数进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测结果。

通过OMEGA昆虫DNA提取试剂盒（柱提法）提取单头木瓜秀粉蚧雌成虫DNA，并在NanoDrop 2000C超微量分光光度计上测得DNA浓度为10.6 ng/μL。按梯度稀释法，将原DNA按10倍浓度梯度稀释成1.06 ng/μL，1.06×10^-1 ng/μL，1.06×10^-2 ng/μL，1.06×10^-3 ng/μL共5个梯度浓度。利用设计的木瓜秀粉蚧28S rDNA特异性引物28S-parF/marR对上述DNA进行PCR扩增。电泳检测结果表明，当DNA浓度为10.6 ng/μL和1.06 ng/μL时，能扩增得到约446 bp的条带；当DNA浓度为1.06×10^-1 ng/μL时，能得到较暗的条带；而当DNA浓度为1.06×10^-2 ng/μL及1.06×10^-3 ng/μL时，均无条带。表明当DNA浓度大于0.1 ng/μL时，能成功扩增出目的条带（图4）。因此认为，该引物对目标DNA浓度有较好的响应。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所

<120> 用于鉴定木瓜秀粉蚧的特异性引物及其检测方法

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cggaattcag aatttgtggc gtttac 26

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cggccatatt acaagaat 18

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gagagttmaa sagtacgtga aac 23

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcggarggaa ccagctacta 20

Claims (5)

1.用于鉴定木瓜秀粉蚧的特异性引物，其特征在于：所述特异性引物序列如下：

28S-parF：5’-CGGAATTCAGAATTTGTGGCGTTTAC-3’；

28S-marR：5’-CGGCCATATTACAAGAAT-3’。

2.权利要求1所述的引物在鉴定木瓜秀粉蚧中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：以待测样本的基因组DNA为模板，以权利要求1所述的特异性引物作为扩增引物进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测：如果电泳结果出现446 bp DNA目的条带，则待测样本为木瓜秀粉蚧。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述PCR扩增体系为为：2xTaq PCRMasterMix12.5 μL，上游引物、下游引物各1.5 μL，模板DNA 1 μL，ddH₂O 8.5 μL；

PCR反应参数为：94℃预变性4 min，94℃变性1 min，56℃退火1 min,72℃延伸1.5min，运行30个循环；最后72℃延伸10 min。

5.一种包含权利要求1所述的引物的试剂盒。