CN110724760B

CN110724760B - 香樟核基因组ssr分子标记的多态性引物及其应用

Info

Publication number: CN110724760B
Application number: CN201911215058.7A
Authority: CN
Inventors: 钟永达; 杨茂霞; 胥猛; 余发新; 郦芝汀
Original assignee: INSTITUTE OF BIOLOGICAL RESOURCES JIANGXI ACADEMY OF SCIENCES; Nanjing Forestry University
Current assignee: INSTITUTE OF BIOLOGICAL RESOURCES JIANGXI ACADEMY OF SCIENCES; Nanjing Forestry University
Priority date: 2019-12-02
Filing date: 2019-12-02
Publication date: 2021-03-19
Anticipated expiration: 2039-12-02
Also published as: CN110724760A

Abstract

本发明公开了香樟核基因组SSR分子标记的多态性引物及其应用，属于林业分子生物学技术领域，引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.14所示，将其应用在香樟品种鉴定、古樟群体遗传结构和资源遗传多样性分析中的应用中，包括基因组DNA的提取、PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳及数据分析的步骤。本发明对18个古樟群体186个个体进行了遗传结构和遗传多样性研究，并根据香樟现有的遗传结构和遗传多样性格局，分析了可能形成的原因，为野生香樟资源保护利用提供理论依据。SSR分子标记重复性好，能够全面揭示香樟遗传多样性真实水平。

Description

香樟核基因组SSR分子标记的多态性引物及其应用

技术领域

本发明属于林业分子生物学技术领域，具体涉及香樟核基因组SSR分子标记的多态性引物及其应用。

背景技术

香樟(Cinnamomum camphora(L.)Presl)为亚热带常绿阔叶林代表树种，在我国长江以南地区广为分布。我国栽培利用香樟历史悠久，古樟资源丰富，蕴含着宝贵的基因资源，但其遗传变异水平及其亲缘地理关系鲜有报道。

基于DNA分子标记的研究结果来看，其结论各异。姚小华利用9对RAPD引物对10个种源的82个家系香樟进行遗传多样性分析，共扩增出146条多态性条带，多态性比例为85.9％，遗传多样性较高。邢建宏分别利用ISSR和RAPD分析了福建南平林学院校内香樟的三种化学类型和三个近缘种的亲缘关系和遗传多样性，结果均表明福建香樟不同化学型间遗传多样性较高。潘晓华利用RAPD技术对7个群体共68个香樟个体进行遗传多样性和遗传结构分析，21对引物共扩增检测到168条条带，其中多样性条带为75条，比率为44.64％，表明香樟群体间遗传多样性水平较低。

导致现有研究结论不一致的主要原因在于所选的群体数量有限。对遍布长江流域以南广大地区的香樟来说，要了解其真实的遗传多样性水平必须有足够的有代表性的群体样本。现有研究大多数只是针对局部地区，样本数最大的也只有41个种源164个个体。其次，香樟在我国具有较早的栽培历史，地区间引种栽培情频繁，其延续至今，针对群体遗传分析的样品起源有较大出入。此外，在研究手段上，早期使用的RAPD、ISSR等共显性DNA标记，重复性差、多态性低，难以全面揭示香樟遗传多样性真实水平。

SSR被称为第二代分子标记，又叫微卫星(microsatellite)，是基于PCR技术的发展起来的一种分子标记，是由几个核苷酸(一般为1到6个)为单位多次串联重复组成的特殊的DNA序列。这种序列几乎遍布所有真核生物的基因组中，含量丰富且随机均匀分布。微卫星由两侧保守的侧翼区和中间的核心区组成，核心区序列重复数的差异形成了微卫星的高度多态性，这种多态性的信息含量较为丰富。1986年Ali等人首次将微卫星技术用于人类DNA遗传分析，近些年来微卫星成为群体研究和进化生物学最常用的分子标记之一，广泛应用于遗传连锁图谱构建，遗传多样性分析，品种鉴定等研究领域。

发明内容

针对现有技术所存在的使用的RAPD、ISSR等共显性DNA标记，重复性差、多态性低，难以全面揭示香樟遗传多样性真实水平，本发明提供了香樟核基因组SSR分子标记的多态性引物；并且提供了香樟核基因组SSR分子标记的多态性引物在香樟品种鉴定、古樟群体遗传结构和资源遗传多样性分析中的应用；参试的18个香樟群体来自我国8个省份，相对广泛分布于全国的香樟，覆盖度广，能够更全面的揭示国内香樟的遗传多样性和遗传结构。

为了解决上述问题，本发明采用的技术方案为：

香樟核基因组SSR分子标记的多态性引物，包括7对多态性引物，其引物核苷酸序列如下：

SSR20上游引物如SEQ ID NO.1所示；

SSR20下游引物如SEQ ID NO.2所示；

SSR23上游引物如SEQ ID NO.3所示；

SSR23下游引物如SEQ ID NO.4所示；

SSR35上游引物如SEQ ID NO.5所示；

SSR35下游引物如SEQ ID NO.6所示；

SSR52上游引物如SEQ ID NO.7所示；

SSR52下游引物如SEQ ID NO.8所示；

SSR55上游引物如SEQ ID NO.9所示；

SSR55下游引物如SEQ ID NO.10所示；

SSR86上游引物如SEQ ID NO.11所示；

SSR86下游引物如SEQ ID NO.12所示；

SSRJ6上游引物如SEQ ID NO.13所示；

SSRJ6下游引物如SEQ ID NO.14所示。

香樟核基因组SSR分子标记的多态性引物在香樟品种鉴定中的应用。

香樟核基因组SSR分子标记的多态性引物在古樟群体遗传结构和资源遗传多样性分析中的应用。

上述应用，包括以下步骤：

1)提取不同品种香樟的基因组DNA；

2)用权利要求1SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.14所示的引物对步骤1)提取的基因组DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；

3)对步骤2)得到的扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；

4)数据分析核基因组SSR位点多态性，进行品种鉴定、古樟群体遗传结构和遗传多样性分析。

进一步的，PCR扩增的体系为：10×buffer 1μL；Mg²⁺25mM，0.3μL；dNTP 2mM，0.5μL；上下游引物各10μM，0.4μL；DNA 30ng/μL，0.6μL；rTaq酶5U/μL，0.05μL；ddH₂O 6.75μL；体系的总体积为10μL。

进一步的，PCR扩增的程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸3min。

有益效果：与现有技术相比，本发明提供了多对核基因组SSR引物，对18个古樟群体186个个体进行了遗传结构和遗传多样性研究，并根据香樟现有的遗传结构和遗传多样性格局，分析了可能形成的原因，为野生香樟资源保护利用提供理论依据。SSR分子标记重复性好，且为共显性标记，并且参试的18个香樟群体来自我国南方樟树自然分布最集中的8个省份，本发明更能够全面揭示香樟遗传多样性真实水平。

附图说明

图1是引物SSR19和引物SSR20的部分群体扩增聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图；

图2是基于SSR标记的古樟群体UPGAM法聚类分析图；

图3是基于SSR的古樟群体空间遗传结构分析图；

图4是基于核基因组SSR标记的古樟群体结构分析结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明，但这些实施例并不用来限制本发明。

实施例1

1)供试材料

供试材料来源于香樟自然分布区的18个群体，分别为四川泸州、江西靖安、江西宁都、四川宜宾、贵州道真、广西桂林、江西恩江、江西龙岗、安徽安庆、江西乐安、江西瑞洪、江西萍乡、广东广州、江西南昌、贵州贵阳、贵州荔波、福建武夷山和江苏南京。选择胸径大于60cm的古樟树，每个个体采集5-10片新鲜叶片干冰运输，经液氮速冻于-80℃冰箱保存。具体采集群体位置、经纬度、样本数等见表1。

表1 18个古樟群体采样信息

来源	样本量	群体	经度E°	纬度N°
					四川泸州	11	SCLZ	105.26	28.58
四川宜宾	5	SCYB	104.25	28.25
					江西靖安	7	JXJA	115.15	28.54
江西宁都	10	JAND	115.51	26.26
					江西恩江	6	JXEJ	115.43	27.31
江西龙岗	5	JXLG	115.60	26.75
					江西瑞洪	21	JXRH	116.43	28.88
江西萍乡	10	JXPX	114.06	27.64
					江西南昌	31	JXNC	115.82	28.75
江西乐安	11	JXLA	115.73	27.28
					贵州道真	5	GZDZ	107.43	28.45
贵州贵阳	15	GZGY	106.72	26.63
					贵州荔波	5	GZLB	107.89	25.42
广西桂林	5	GXGL	110.30	25.17
					安徽安庆	14	AHAQ	117.04	30.51
广东广州	5	GDGZ	113.36	23.19
					福建武夷山	10	FJWYS	117.96	27.67
江苏南京	15	JSNJ	118.84	32.05

2)香樟总DNA提取与检测

采用改良后的CTAB法进行香樟总DNA的提取，具体操作步骤如下：

打开水浴锅，设置65℃预热；

取10mL离心管，加入4mL CTAB裂解液与80μL的β-巯基乙醇，放入水浴锅中进行预热；

取2g左右香樟叶片，放入预先准备好的研钵中，导入液氮研磨，直至样品呈均匀粉末状，加入上一步骤中的离心管中，放入水浴锅65℃水浴30min，期间每隔5min颠倒混匀；

取出离心管，置于冰上冷却三分钟后，加入等体积的氯仿异戊醇混合液(氯仿：异戊醇＝24：1)，充分混匀后放入离心机中4℃、12000r离心10min；

准备新的10mL离心管，用移液器吸取上清液至新离心管中，再次加入等体积的氯仿异戊醇混合液，混匀后置于离心机中，4℃、12000r离心10min；

分别吸取500μL的上清液，分装入3个1.5mL离心管中并分别加入1mL的乙醇和50μL的醋酸钠溶液，颠倒混匀放入冰箱-20℃静置2h，等待絮状物析出；将剩余上清液移至2mL离心管，置于冰箱-20℃备用；

准备新的1.5mL离心管，分别加入1mL75％的乙醇溶液，将3个离心管中析出的絮状物挑入新离心管中，涡旋1min，10000r离心5min；

小心倒掉乙醇溶液，再加入新的1mL75％乙醇溶液，重复上一步骤；

再次倒掉乙醇溶液，利用真空干燥仪进行干燥；

加入200μL 1×TE溶液，溶解3h，取出后进行离心，上清液即为所提取的DNA。

取少量提取好的香樟总DNA，利用NanoDrop 2000c(ThermoFisher Scientific)进行DNA样品质量和浓度检测；同时利用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，通过观察条带是否弥散来检测DNA有无降解。

将DNA稀释至30ng/μL，-20℃保存。

3)核基因组SSR引物扩增及筛选

基于现有的香樟转录组测序结果，设计了100对SSR引物(南京金斯瑞生物有限公司合成)。经筛选，共得到21对特异性较好且多态性较高的SSR引物，从中挑选10对多态性较好的SSR引物，见表2。其中，SSR11，SSR19，SSR74,选自CN108384885A《一种香樟SSR引物组合及其品种鉴定方法》。

表2核基因组SSR引物序列信息

注：F：上游引物；R：下游引物。

反应体系如下：10×buffer 1μL；Mg²⁺25mM，0.3μL；dNTP 2mM，0.5μL；上下游引物各10μM，0.4μL；DNA 30ng/μL，0.6μL；rTaq酶5U/μL，0.05μL；ddH₂O 6.75μL；体系的总体积为10μL。

扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸3min。

4)数据分析

利用软件popgen32进行MAF(最小等位基因频率)、h(Nei多样性指数)、I(shannon多样性指数)的估算并根据Nei’s 1972算法进行遗传距离的估算，并基于UPGMA法，利用软件MEGA 6进行系统发生树的构建。

利用软件powermarker进行PIC(多态信息含量)值的估算。

为进一步研究古樟群体间遗传结构的差异，利用软件Genalex v6.5计算Fst(群体间遗传分化系数)。利用软件Structure根据贝叶斯聚类方法，采用混合祖先模型(admixture ancestry model)和等位基因频率关联模型(correlated allele frequencymodel)进行马尔科夫链的模拟算法(markov chain monte caril，MCMC)。length of burn-in period和MCMC均设为100000，对每个K值模拟重复计算10次，并使用Evanno的方法确定最佳K值。

利用软件Ntsys进行群体间遗传距离和群体间地理距离矩阵的相关性检验(Mantel检验)。

5)核基因组SSR位点多态性分析

利用10对SSR引物，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对186个古樟个体进行了检测(图1)。共检测到41个等位基因，每对引物扩增的等位基因数为2(SSR19、SSR52)～6(SSR20、SSR55)个不等，平均为4.1；有效等位基因为1.386(SSR35)～3.983(SSR86)，平均有效等位基因数为2.633。Nei多样性指数(h)为0.278(SSR35)～0.763(SSR55)，平均值为0.422；shannon多样性指数(I)为0.474(SSR35)～1.527(SSR55)，平均值为1.019；PIC值为0.350(SSR35)～0.776(SSR55)，平均值为0.593。三个多样性指数表现出相同的趋势，见表3。

表3 SSR位点多样性检测

注：Na：观测等位基因；Ne：有效等位基因；Ho：观测杂合度；He：期望杂合度；PIC：多态信息含量；h：Nei多样性指数；I：shannon多样性指数

6)基于核基因组的古樟群体遗传多样性分析

利用10对SSR标记对18个古樟群体进行遗传多样性分析，结果表明不同群体的遗传多样性具有较大差异。shannon多样性指数(I)为0.457(GZDZ)～0.918(JXLA)，平均值为0.695；Nei多样性指数(h)为0.294(GZDZ)～0.530(JXLA)，平均值为0.422。两个指标均显示遗传多样性最高的群体为江西乐安(JXLA)，最低的为贵州道真(GZDZ)，见表4。

表4基于SSR的古樟各群体遗传多样性比较

注：I：shannon多样性指数；h：Nei多样性指数

7)基于核基因组SSR标记的古樟群体聚类分析

利用核基因组SSR标记，通过popgen32软件，基于Nei’s 1972算法计算18个群体间的遗传距离。18个群体间的遗传距离为0.083～0.693之间，平均值为0.317；遗传相似系数为0.500～0.920，平均值为0.748。通过UPGMA法进行聚类分析，结果如图2。若以遗传距离0.33为分界线，可以将18个群体分为4类，贵州荔波(GZLB)和江西龙岗(JXLG)分别单独为一类，江西宁都(JXND)、江西恩江(JXEJ)、江西萍乡(JXPX)和福建武夷山(FJWYS)聚为一类，剩余群体聚为一类。利用ntsys软件对18个香樟群体的遗传距离和地理距离进行Mantel检验(图3)，结果显示古樟群体遗传距离与地理空间距离无显著相关性(r＝0.15404，p＝0.8899)，表明香樟群体间变异的主要因素并非地理距离。

8)基于核基因组的古樟群体遗传结构分析

通过F统计量对古樟群体的遗传分化进行分析，基于核基因组SSR研究结果的Fst矩阵见表5，群体间遗传分化系数较小，平均为0.134，表明由13.4％的变异存在于群体之间，由86.6％的变异存在于群体之内，群体间具有较低的遗传分化，基因流Nm为1.616，表明群体间存在较大的基因流。

利用Structure软件分析18个古樟群体的共祖关系，对群体的K值设置区间为2～19，每个K值重复运算10次。当K值为4时，ΔK值达到最大，见图4，则认为该K值为最佳祖先模型。

当K值为2～3时，江西萍乡(JXPX)和贵州道真(GZDZ)群体的绝大部分遗传信息表现为单一祖先群体，福建武夷山(FJWYS)和江苏南京(JSNJ)的遗传信息显示拥有共同的祖先群体，江西南昌、江西乐安、贵州贵阳、贵州荔波、广西桂林、安徽安庆、广东广州、福建武夷山和江苏南京的大部分遗传信息具有相同的祖先来源。

当K值为4时，江西萍乡(JXPX)的大部分遗传信息来源于同一祖先群体，贵州道真(GZDZ)的几乎所有的遗传信息也来自于同一祖先群体且与其他群体的遗传组成拥有较大差异，福建武夷山(FJWYS)和江苏南京(JSNJ)的大部分遗传信息均来自同一祖先群体，其余群体的遗传信息均表现为来自三个不同祖先群体的混合。

随着K值的增加，各群体内遗传信息来源变得越来越多样化。贵州道真(GZDZ)的几乎所有遗传信息依然表现为拥有单一的祖先来源，而其余群体的遗传信息则表现为几个不同祖先群体的混合。

整体而言，各个古樟树群体的遗传信息组成较为复杂，通常均表现为来自数个祖先群体的混合，推测可能各个群体之间拥有较大的基因流。贵州道真(GZDZ)和江西萍乡(JXPX)的遗传信息组成较为单一，推测拥有较小的基因流。

表5基于核基因组SSR的古樟群体间遗传分化(Fst)矩阵表

需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 江西省科学院生物资源研究所；南京林业大学

<120> 香樟核基因组SSR分子标记的多态性引物及其应用

<130> 1

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> SSR20 primer F(artificial)

<400> 1

gggccaacat gctacctcgt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> SSR20 primer R(artificial)

<400> 2

tgggcttgtt gcttggacct 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> SSR23 primer F(artificial)

<400> 3

gactgtcgct gccctcttcc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> SSR23 primer R(artificial)

<400> 4

catctgcttt cacacgcgcc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> SSR35 primer F(artificial)

<400> 5

agccagattc agggcctggt 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> SSR35 primer R(artificial)

<400> 6

gccgttctac gccgggaaat 20

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> SSR52 primer F(artificial)

<400> 7

acctcaccag catattgatg gact 24

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> SSR52 primer R(artificial)

<400> 8

aagcagcttg catttgggca 20

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> SSR55 primer F(artificial)

<400> 9

tgagggttct tactgcaata gcg 23

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> SSR55 primer R(artificial)

<400> 10

acagaagccg gatgacgcag 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> SSR86 primer F(artificial)

<400> 11

cagcaccagc agtggcagta 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> SSR86 primer R(artificial)

<400> 12

cgggctatgc tgcttacggt 20

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> SSRJ6 primer F(artificial)

<400> 13

tttcttcctc accaccattt gaggg 25

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> SSRJ6 primer R(artificial)

<400> 14

acctttcatc acctgcgctt 20

Claims

1.香樟核基因组SSR分子标记的多态性引物，其特征在于，包括7对多态性引物，其引物核苷酸序列如下：

SSR20上游引物如SEQ ID NO.1所示；

SSR20下游引物如SEQ ID NO.2所示；

SSR23上游引物如SEQ ID NO.3所示；

SSR23下游引物如SEQ ID NO.4所示；

SSR35上游引物如SEQ ID NO.5所示；

SSR35下游引物如SEQ ID NO.6所示；

SSR52上游引物如SEQ ID NO.7所示；

SSR52下游引物如SEQ ID NO.8所示；

SSR55上游引物如SEQ ID NO.9所示；

SSR55下游引物如SEQ ID NO.10所示；

SSR86上游引物如SEQ ID NO.11所示；

SSR86下游引物如SEQ ID NO.12所示；

SSRJ6上游引物如SEQ ID NO.13所示；

SSRJ6下游引物如SEQ ID NO.14所示。

2.权利要求1所述的香樟核基因组SSR分子标记的多态性引物在香樟品种鉴定中的应用。

3.权利要求1所述的香樟核基因组SSR分子标记的多态性引物在古樟群体遗传结构和资源遗传多样性分析中的应用。

4.权利要求2或3所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取不同品种香樟的基因组DNA；

3)对步骤2)得到的扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的体系为：10×buffer 1μL；Mg²⁺25mM，0.3μL；dNTP 2mM，0.5μL；上下游引物各10μM，0.4μL；DNA 30ng/μL，0.6μL；rTaq酶5U/μL，0.05μL；ddH₂O 6.75μL；体系的总体积为10μL。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸3min。