CN107099614A

CN107099614A - 一种用于对不同樟树进行基因分型的snp引物及检测方法

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Publication number: CN107099614A
Application number: CN201710535452.3A
Authority: CN
Inventors: 胥猛; 钟永达; 章昊; 郦芝汀; 王建文; 陈彩惠; 徐立安; 余发新
Original assignee: INSTITUTE OF BIOLOGICAL RESOURCES JIANGXI ACADEMY OF SCIENCES; Nanjing Forestry University
Current assignee: INSTITUTE OF BIOLOGICAL RESOURCES JIANGXI ACADEMY OF SCIENCES; Nanjing Forestry University
Priority date: 2017-07-04
Filing date: 2017-07-04
Publication date: 2017-08-29
Anticipated expiration: 2037-07-04
Also published as: CN107099614B

Abstract

本发明公开了一种用于对不同樟树进行基因分型的SNP引物及检测方法。本发明的引物共8对，其中7对SNP引物组合可以用于构建樟树的指纹图谱。本发明利用樟树转录组数据开发的SNP引物能够对不同樟树进行基因分型，并且本发明操作方法简单，通量高，成本低。此外，本发明开发的7对SNP引物构建了不同樟树的指纹图谱，验证的8个SNP位点还可以用来分子标记辅助育种，遗传多样性研究，基于SNP的关联分析，以及用于种质资源鉴定与分类等。

Description

一种用于对不同樟树进行基因分型的SNP引物及检测方法

技术领域:

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于对不同樟树进行基因分型的SNP引物及检测方法。

背景技术

樟树，别名香樟、芳樟、小叶樟等，隶属于樟科(Lauraceae)樟属(Cinnamomum)，在我国具有重要的经济价值，且广泛分布于我国亚热带地区，如海南、江西、湖南、浙江、重庆、等省市区。樟树具有树姿雄伟、四季浓绿、灭菌驱虫和挥发香气等特点，发挥着重要的材用、药用、香料、油用和生态环境建设等价值。樟树因其可以提取天然樟脑和芳香油，而这两者分别是重要的工业和医药原料，因此针对樟树的研究也颇受关注。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNP)主要是指由于单个核苷酸的变异而引起基因组水平上的DNA序列多态性，形式包括单碱基的缺失、插入、转换及颠换等。SNP是一种最常见的遗传变异，具有遗传稳定性高、位点丰富且分布广泛、富有代表性、检测快速、易于实现自动化分析等特点。另外，由于SNP自身具有密度高、分布广等特点，又加上先进的高通量SNP检测系统的研制，SNP标记将对未来生命科学领域产生重大的影响。

HRM(High-Resolution Melting)分析技术是应用于SNP检测分析的一项新技术，是由犹他大学和Idaho科技公司合作开发的，该技术主要利用不同双链DNA分子的片段长短、GC含量和分布不同，在加热变性时形成随温度变化的特定熔解曲线，进而利用饱和荧光染料和高精密度采集荧光信号仪器进行检测。基于HRM技术的原理，HRM检测不需要使用针对目标位点的特异性等位引物或探针，只需一对引物就可以对等位基因的变化进行识别。其灵敏度高、特异性强、简单快速、高效、经济，还具有高通量、闭管操作等优点，非常经济有效。因此，HRM大大简化了SNP检测的操作步骤，并减少了分析时间，目前该项技术主要应用于突变扫描、SNP的发现、基因分型、小片段的插入和删除、甲基化研究及混合样品的突变发现等方面。

樟树生化类型准确划分，是高效开发有着重要的经济价值的樟树精油的基础，快速、准确的基因分型对化学类型的区分至关重要，目前关于此类研究，鲜见报道。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种用于对不同樟树进行基因分型的SNP引物，为29株樟树建立指纹图谱。本发明的另一目的是提供一种上述SNP引物的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种用于对不同樟树进行基因分型的SNP引物，由8对引物组成，各引物的核苷酸序列如下表所示：

引物名称	上游引物(5’to 3’)	下游引物(5’to 3’)
			SNP1	AAGCTGCAAACCCATTCGAGT	GACCTGCTTGGCATACGC
SNP2	CATGGCTCTAATGGGCAATCT	GCGGGCTCTCGTAGAAA
			SNP3	CGCCAGGCAGGGTAAG	CCAACAGACAGGGCACTAAAG
SNP4	GCCTATAAGGGATAAGAGAATA	CATTTTACAAAGAGATTCCACAT
			SNP5	CAACCCTCTAATCAGTGATGA	GGGTGGATCTTATCTTGAGAT
SNP6	TGAGTTGAAACTTTATGAGGC	CATCTACTTCAGTCCCACCTT
			SNP7	CTCAAAAGGACAAGAGTGAGA	TGTTTGACTTCAGCAGAGACT
SNP8	AAGCTTCTTCTTCGATATAGACT	ACGAAAGAAGAAAGAGAAGAAC

应用所述的SNP引物构建樟树的指纹图谱，获得29个樟树对应的指纹图谱，如下表所示：

所述的应用SNP引物构建樟树的指纹图谱，采用7对SNP引物，名称分别为：SNP1，SNP2，SNP3，SNP4，SNP5，SNP6，SNP7。

所述SNP引物在不同樟树基因组DNA的SNP位点基因分型的检测中的应用。

所述的应用，包括以下步骤：

1)待测樟树样品DNA的提取；

2)使用相同反应体系及程序对樟树样本基因组DNA进行PCR扩增，得到待测樟树的PCR产物；

3)对PCR扩增产物进行高分辨率溶解曲线分析确定SNP位点的基因型；

4)Sanger测序再次验证SNP基因型。

步骤2)中，PCR反应体系20μL：30ng模板DNA；10μL 1X Forget-Me-Not^TM qPCRMaster Mix；0.1μmol/L SNP引物；剩余ddH₂O补齐。

步骤2)中，PCR反应程序：预变性95℃2min；95℃变性5s，45个循环；60℃复性30s。

步骤3)中，HRM的反应程序：95℃10s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。

本发明通过实验证明：本发明的引物共8对，其中7对SNP引物组合可以用于构建樟树的指纹图谱。本发明利用樟树数据开发的SNP引物能够对不同樟树进行基因分型，并且本发明操作方法简单，通量高，成本低。此外，本发明开发的7对SNP引物构建了不同樟树的指纹图谱，验证的8个SNP位点还可以用来分子标记辅助育种，遗传多样性研究，基于SNP的关联分析，以及用于种质资源鉴定与分类等。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下的技术优势：

1)结果高度准确、可靠：利用本发明进行检测与鉴定，检测结果100％准确，检测结果提供了高度的可靠性。

2)操作快速简便：进行不同个体间的样本检测，一般整个试验过程只需几小时即可完成，与传统的测序技术相比，省时省力，可以实现高通量。

3)无需基于凝胶电泳进行，减少试剂和耗材的使用，更佳环保，同时节省人力和减少人工误差。

4)检测结果灵敏度高：对待检测样品仅需提供模板DNA 30ng即可准确进行鉴定。

5)效率高：相比于SSR指纹图谱，虽然SNP单位点的理论信息量不如SSR丰富，但是SNP在全基因组范围内密度远高于SSR，借助HRM分型可以迅速获取指纹信息，综合效率上高于SSR指纹。

附图说明

图1是以引物SNP 7为例，根据不同樟树个体表现出的差异溶解曲线峰，对其进行基因分型结果的溶解曲线，红色为CC，橘色为TT，蓝色为TC；

图2是以引物SNP 2为例，PCR扩增产物的Sanger测序结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

1、初步筛选对樟树进行基因分型的SNP引物

1)转录组数据的获得

从野外获得多份樟树样本，提取次生代谢产物，测定其生化类型，从其中选取芳樟型F-1、F-2以及龙脑型L-1、L-2樟树叶片样品，放于-80℃超低温冰箱保存备用。根据制造商的说明书使用RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen，Hilde，Germany)进行樟树总RNA提取。提取后，在1.0％的琼脂糖凝胶上检测RNA的降解和污染。使用分光光度计(Implen，Westlake Village，CA，USA)检查RNA纯度。使用2.0Flurometer(LifeTechnologies,Carlsbad,CA,USA)中的RNAAssay Kit测定RNA的浓度。使用anAgilent Bioanalyzer 2100system(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)中的RNA Nano 6000Assay Kit评估RNA的完整性。

每个样品的总量为3μg RNA用作RNA样品制备的输入材料。按照制造商的说明书，使用UltraTMRNA Library Prep Kit(NEB，USA)生成测序文库，并将索引代码添加到每个样品的属性序列中。简而言之，使用poly-T oligo附着磁珠从总RNA纯化mRNA。在NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer(5X)中，在高温下使用二价阳离子打断成短片段。以mRNA为模板，使用六碱基随机引物和M-MuLV逆转录酶(RNaseH-)合成第一链cDNA。随后使用DNA聚合酶I和RNA酶H进行第二链cDNA合成。通过外切核酸酶/聚合酶活性将剩余突出部分转化为平端。在DNA片段的3'末端腺苷酸化后，连接具有发夹环结构的NEBNext适配子以进行杂交。为了选择长度优先为150-200bp的cDNA片段，文库片段用AMPure XP系统(Beckman Coulter，Beverly，USA)纯化。然后将3μL USER Enzyme(NEB，USA)与大小选择的接头连接的cDNA在37℃下使用15min，然后在95℃下PCR 5min。进而使用Phusion高保真DNA聚合酶，通用PCR引物和Index(X)引物进行PCR。最后，将PCR产物纯化(AMPure XP系统)，并在Agilent Bioanalyzer 2100系统上评估文库质量。根据制造商的说明书，使用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS(Illumia)在cBot群集生成系统上进行索引编码样本的聚类。集群生成后，在Illumina HiSeqTM 2500高通量平台上对其准备进行测序，并生成配对末端读取。

FASTQ格式的原始数据(raw reads)首先通过内部Perl脚本进行处理。在此步骤中，通过删除包含适配器的读取，包含poly-N的读取以及从原始数据读取的低质量来获取干净的数据(clean reads)。同时，计算了clean data的Q20，Q30，GC含量和序列重复水平。所有的下游分析都是以高质量的clean data为基础。然后，将所有库/样本中的左文件(read 1files)合并到一个大的left.fq文件中，将正确的文件(read 2files)合并到一个大的right.fq文件中。基于left.fq和right.fq使用Trinity完成转录组组装，默认情况下min_kmer_cov设置为2，其他所有参数设置为默认值。选择具有最长长度的每个基因的转录本作为unigenes。1.SNP的识别

本实施例通过使用Picard-tools v1.41和samtools v0.1.18来排序，删除重复读取，对齐合并获得每个样本的bam结果。采用GATK2v3.2软件用于执行SNPcalling(Mckennaet al，2010)。原始的vcf文件使用GATK标准方法过滤(参数为clusterWindowSize:10；MQ0>＝4and(MQ0/(1.0*DP))>0.1；QUAL<10；QUAL<30.0or QD<5.0or HRun>5)，最后仅保留距离大于5的SNP。

2)SNP引物的设计

根据转录组unigene序列，挑选60个SNP位点，利用Oligo 6.0软件设计60对SNP引物。设计的方法如下：首先确定SNP位点所在序列的位置，然后在SNP位点的上下游分别设计正向引物和反向引物，引物设计的参数为引物长度18-23bp；Tm 59℃-61℃，尽可能保证上下游引物的Tm值一致，一般不超过2℃；GC含量在40-60％(45-55％最佳)；PCR产物大小为150-400bp；其它还应注意引物3'端不应出现超过3个的连续G或C；引物不能形成发夹结构，即不能有4bp以上的回文序列；引物自身、引物之间尽量不能有连续4个以上的碱基互补，尤其避免3'端的互补。

3)CTAB法提取樟树基因组DNA：打开水浴锅，调节至65℃预热备用。将50-100mg的樟树叶片在液氮中充分研磨成粉末，并转移只1.5mL的离心管中。向离心管中加入4mLCTAB，80μl 120％巯基乙醇。放入65℃水浴锅中预热30min后取出，置于冰水中冷却至室温。加入4mL氯仿(异戊二醇：氯仿＝1:24)，12000rpm，离心4min。取上清至一干净离心管中，加入3mL氯仿，抽提第二次，12000rpm，离心4min。将上清分装在四个离心管中(1个2mL离心管装备用液、3个1.5mL离心管)，每个1.5mL离心管分装500μl。向每个离心管中加入2倍体积(1000μl)冰无水乙醇，再加50μL醋酸钠，放置在-20℃冰箱，2h后取出，若无絮状物，12000rpm离心5min。准备一个新的1.5mL离心管，加入1000μL 70％乙醇。将三个离心管中的絮状物全部用枪头挑出，加入新的离心管中。涡旋，12000rpm离心2min。再取一新的离心管，第二次用70％乙醇漂洗、涡旋、离心。小心的吸出离心管中的酒精，注意不要吸到絮状物。加热干燥，使酒精全部蒸发。向离心管中加入200μl dd H2O，溶解1h，置于-20℃冰箱保存备用。

4)SNP引物的有效性验证

以樟树基因组DNA为模板，采用待检测SNP引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；反应结束后，取3μL的PCR产物加入4μL Loading buffer，再加3μL ddH₂O，利用8％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，然后采用银染方法对PCR扩增产物进行检测。能检测到目的条带且无其它杂带和引物二聚体的，该待检测引物即为有效引物。

10μL的LA-taq酶PCR反应体系如下：5μL的Premix Taq(LA Taq Version 2.0plusdye)；0.2μmol/L SNP引物；40ng DNA模版；剩余ddH₂O补齐。

PCR的反应程序为：预变性94℃3min；35循环的94℃30s，最佳Tm 55℃30s，72℃30s；延伸72℃1min，最终4℃保存。

结果表明：挑选的60对SNP引物中，有45对引物能够扩增出条带，但其中的35对引物扩增出的条带不单一，可能存在多个SNP位点，暂不考虑进行HRM分析，另外10对引物(见下表)扩增条带单一且产物大小与预期一致，暂为有效SNP引物，用于HRM分析。1对引物对应1个目标SNP位点，1对引物的扩增产物为含有对应SNP位点的DNA片段。

2、再次筛选对樟树进行基因分型的SNP引物

1)PCR扩增及高分辨率溶解曲线(HRM)分析进行基因分型

以33个樟树个体(其中4个樟树个体为转录组测序的樟树，芳樟型F-1、F-2和龙脑型L-1、L-2；其余29棵樟树来源见表1)的基因组DNA为模板，分别采用上述10对SNP有效性引物进行PCR扩增，得到每个个体的10个引物对应的PCR扩增产物，每个引物对的PCR扩增产物为含有某个SNP位点的DNA片段。

PCR反应体系20μL：30ng模板DNA；1X Forget-Me-Not^TM qPCR Master Mix 10μL；0.1μmol/L SNP引物；剩余ddH₂O补齐。采用ViiA 7中的High Resolution Melt进行PCR及基因分型。第一步，10μL的PCR反应程序：预变性95℃2min；45个循环的95℃变性5s，60℃复性30s；第二步，HRM的反应程序：95℃10s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。

结果表明：有8对引物能够进行基因分型，其余2对引物因有杂峰(SNP9，SNP10)，所以被淘汰。采用AppliedHRM Software v2.0进行溶解曲线分析。8对引物对应的SNP位点得到HRM验证，其中，高分辨率溶解曲线部分结果如下：图1为以SNP引物7为例，根据不同樟树个体表现出的差异溶解曲线峰，对其进行基因分型结果的溶解曲线，红色为CC，橘色为TT，蓝色为TC。8对SNP引物对樟树个体的基因分型结果如表2所示：

表1樟树材料来源

樟树样品号	采集地	樟树样品号	采集地
				Y-1	江西崇义	Y-16	江西崇义
Y-2	江西安福	Y-17	湖南郴州
				Y-3	江西龙南	Y-18	四川宜宾
Y-4	江西分宜	Y-19	四川达州
				Y-5	江西资溪	Y-20	四川成都
Y-6	江西广丰	Y-21	四川广元
				Y-7	江西广昌	Y-22	湖北黄冈
Y-8	江西瑞昌	Y-23	湖北襄阳
				Y-9	江西瑞金	Y-24	江苏南通
Y-10	江西信丰	Y-25	江苏连云港
				Y-11	江西乐安	Y-26	江苏徐州
Y-12	江西赣县	Y-27	江苏盐城
				Y-13	江西丰城	Y-29	福建龙岩
Y-14	湖南长沙	Y-29	福建厦门
				Y-15	湖南长沙

表2樟树样本分型结果

其中，7对SNP引物组合(SNP1-7)构建樟树指纹代码，获得29个香樟对应的指纹图谱，如表3所示。

表3 29个香樟对应的指纹图谱

样品号	SNP指纹代码	样品号	SNP指纹代码
				Y-1	5221543	Y-16	3515254
Y-2	3515553	Y-17	1511245
				Y-3	3551545	Y-18	5211243
Y-4	5511553	Y-19	3521435
				Y-5	3255543	Y-20	1521253
Y-6	3521243	Y-21	5213253
				Y-7	5555253	Y-22	1115253
Y-8	3551543	Y-23	5155253
				Y-9	3525243	Y-24	5511253
Y-10	5525254	Y-25	5555543
				Y-11	1221233	Y-26	5255253
Y-12	5211233	Y-27	1523243
				Y-13	3215243	Y-28	1551545
Y-14	1215233	Y-29	1551535
				Y-15	1515243

注：纯合型AA，GG，TT，CC对应1，2，3，4，突变型对应5。

实施例2高分辨率溶解曲线分析结果的验证

通过PCR产物测序对高分辨率溶解曲线分析得到的基因分型的结果进行验证。具体步骤如下：挑选SNP的不同分型的PCR产物20μL，进行Sanger测序，根据测序峰图和等位基因出现的频率确定基因型，并与HRM基因分型结果进行比较，以验证引物基因分型的准确性。

经过Sanger测序验证本发明的引物通过HMR分析对银杏进行基因分型的结果是可靠的。测序结果如下：通过测序获得基因峰图，以SNP 2引物为例(图2的a，b)，其扩增片段的SNP位点为G/A突变，图2a基因型为A/T，图2b基因型为A/A，均符合HRM基因分型结果，认为SNP为阳性SNP位点且HRM基因分型结果准确。

Claims

1.一种用于对不同樟树进行基因分型的SNP引物，其特征在于，由8对引物组成，各引物的核苷酸序列如下表所示：

引物名称上游引物(5’to3’) 下游引物(5’to3’) SNP1 AAGCTGCAAACCCATTCGAGT GACCTGCTTGGCATACGC SNP2 CATGGCTCTAATGGGCAATCT GCGGGCTCTCGTAGAAA SNP3 CGCCAGGCAGGGTAAG CCAACAGACAGGGCACTAAAG SNP4 GCCTATAAGGGATAAGAGAATA CATTTTACAAAGAGATTCCACAT SNP5 CAACCCTCTAATCAGTGATGA GGGTGGATCTTATCTTGAGAT SNP6 TGAGTTGAAACTTTATGAGGC CATCTACTTCAGTCCCACCTT SNP7 CTCAAAAGGACAAGAGTGAGA TGTTTGACTTCAGCAGAGACT SNP8 AAGCTTCTTCTTCGATATAGACT ACGAAAGAAGAAAGAGAAGAAC

2.应用权利要求1所述的SNP引物构建樟树的指纹图谱，获得29个樟树对应的指纹图谱，如下表所示：

3.根据权利要求2所述的应用SNP引物构建樟树的指纹图谱，其特征在于，采用7对SNP引物，名称分别为：SNP1，SNP2，SNP3，SNP4，SNP5，SNP6，SNP7。

4.权利要求1所述SNP引物在不同樟树基因组DNA的SNP位点基因分型的检测中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1)待测樟树样品DNA的提取；

4)Sanger测序再次验证SNP基因型。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤2)中，PCR反应体系20μL：30ng模板DNA；10μL 1X Forget-Me-Not^TM qPCR Master Mix；0.1μmol/L SNP引物；剩余ddH₂O补齐。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤2)中，PCR反应程序：预变性95℃2min；95℃变性5s，45个循环；60℃复性30s。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤3)中，HRM的反应程序：95℃10s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。