CN107164530B

CN107164530B - 一种用于对不同银杏进行基因分型的snp引物及检测方法

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Publication number: CN107164530B
Application number: CN201710531477.6A
Authority: CN
Inventors: 徐立安; 吴雅琼; 王建文; 胥猛; 周琦
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2017-07-03
Filing date: 2017-07-03
Publication date: 2019-10-15
Anticipated expiration: 2037-07-03
Also published as: CN107164530A

Abstract

本发明公开了一种用于对不同银杏进行基因分型的SNP引物及检测方法。本发明的引物共22对，其中11对SNP引物组合可以用于构建银杏古树名木的指纹图谱。本发明利用银杏转录组数据开发的SNP引物能够对银杏不同个体进行基因分型，并且本发明操作方法简单，通量高，成本低。此外，本发明开发的11对SNP引物构建了不同群体中银杏古树名木的指纹图谱，验证的22个SNP位点还可以用来分子标记辅助育种，遗传多样性研究，基于SNP的关联分析，以及用于种质资源鉴定与分类等。

Description

一种用于对不同银杏进行基因分型的SNP引物及检测方法

技术领域:

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于对不同银杏进行基因分型的SNP引物及检测方法。

背景技术

银杏(Ginkgo biloba L.)作为裸子植物银杏纲(Ginkgopsida)现存唯一种，典型的中生代孑遗物种，素有“活化石”之美誉。银杏为落叶大乔木，树干高大，雌雄异株。树皮幼时浅绿色，老树呈灰褐色，深纵裂，粗糙；分枝繁茂，分长短枝。种子核果状，有臭味；中种皮骨质，白色，具2～3棱；内种皮膜质淡褐色，子叶2片；花期4～5月，9～10月种子成熟。银杏集材用、果用、叶用、园林绿化、观赏于一体，是一种全能的树种。银杏叶中含有大量的银杏黄酮类和银杏内酯类物质，对治疗神经病，骨髓病和脑病有独特的效用。银杏叶的非凡药用价值，已经使银杏叶制剂形成了一个巨大的产业。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNP)是指单个核苷酸的变异引起的基因组水平上DNA序列的多态性，其形式包括单碱基的插入、缺失、转换和颠换。在群体中，其等位基因频率大于1％，但有时也把cDNA中频率小于1％的单碱基变异称之为SNP。SNP标记是继RFLP和SSR之后发展起来的第三代分子标记，并广泛应用于植物遗传育种中，具有遗传稳定性高；密度高、分布广；二态性和等位基因性；富有代表性；易于实现高通量、自动化检测的特点。因此，SNP被认为是应用前景最好的遗传标记之一。

随着测序技术的发展，测序质量的提高和成本的降低，挖掘SNP位点并借此进行相关研究的例子越来越多。但该技术在植物中的应用多集中于农作物，在林木类方面的研究相对较少，且在银杏这一物种上的研究更是未见报道。随着时代的发展，野生资源的保护至关重要，对于孑遗树种古银杏保护不容忽视。因此，现急需一种快速、方便、可靠的银杏古树名木资源分子鉴定技术。利用DNA分子标记方法绘制DNA指纹图谱，能从本质上反映生物个体间的差异。常规的DNA指纹图谱是采用第二代分子标记简单序列重复(SSR)进行的，但是第三代分子标记SNP，无须基于凝胶电泳进行指纹图谱的检测，减少误差，省时，且高通量，准确性高。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种用于对不同银杏进行基因分型的SNP引物，为84株古树名木建立指纹图谱。本发明的另一目的是提供上述SNP引物的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种用于对不同古银杏进行基因分型的SNP引物，由22对引物组成，各引物的核苷酸序列如下表所示：

应用所述的SNP引物构建银杏古树名木的指纹图谱，获得84个银杏古树名木对应的指纹图谱，如下表所示：

所述的应用SNP引物构建银杏古树名木的指纹图谱，所使用的引物为11，名称分别：SNP1，SNP4，SNP6，SNP8，SNP10，SNP14，SNP16，SNP17，SNP19，SNP20，SNP22。

所述SNP引物在不同古银杏基因组DNA的SNP位点基因分型检测中的应用。

所述的应用，包括以下步骤：

1)待测银杏样品DNA的提取；

2)使用相同反应体系及程序对银杏样本基因组DNA进行PCR扩增，得到待测银杏的PCR产物；

3)对PCR扩增产物进行高分辨率溶解曲线分析确定SNP位点的基因型；

4)Sanger测序再次验证SNP基因型。

步骤2)中，PCR反应体系10μL：25ng模板DNA；1X Forget-Me-Not^TM qPCR MasterMix；0.1μmol/L SNP引物；剩余ddH₂O补齐。

步骤2)中，PCR反应程序：预变性95℃2min；95℃变性5s，45个循环；60℃复性30s。

步骤3)中，HRM的反应程序：95℃10s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。

本发明通过实验证明：本发明的引物共22对，其中11对SNP引物组合可以用于构建银杏古树名木的指纹图谱。本发明利用银杏转录组数据开发的SNP引物能够对银杏进行基因分型，并且本发明操作方法简单，通量高，成本低。此外，本发明开发的11对SNP引物构建了不同银杏古树名木的指纹图谱，验证的22个SNP位点还可以用来分子标记辅助育种，遗传多样性研究，基于SNP的关联分析，以及用于种质资源鉴定与分类等。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下的技术优势：

1)结果高度准确、可靠：利用本发明进行检测与鉴定，检测结果100％准确，检测结果提供了高度的可靠性，为银杏古树名木提供指纹图谱，对野生资源的保护意义重大。

2)操作快速简便：进行不同个体间的样本检测，一般整个试验过程只需几小时即可完成，与传统的测序技术相比，省时省力，可以实现高通量。

3)无需基于凝胶电泳进行，减少试剂和耗材的使用，更佳环保，同时节省人力和减少人工误差。

4)检测结果灵敏度高：对待检测样品仅需提供模板DNA25ng即可准确进行鉴定。

附图说明

图1是从银杏转录组测序数据中鉴定出的SNP及其变异类型和数目结果图；

图2是以引物SNP18为例，在不同古银杏个体表现出的扩增曲线图；

图3是以引物SNP 18为例，利用高分辨率溶解曲线分析后，不同古银杏个体表现出不同的溶解曲线峰图；

图4是以引物SNP 18为例，根据不同古银杏个体表现出的差异溶解曲线峰，对其进行基因分型结果的溶解曲线，红色为CC，蓝色为CT，绿色为TT。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

1、初步筛选对银杏进行基因分型的SNP引物

1)转录组数据的获得

根据制造商的说明书使用RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen，Hilde，Germany)进行银杏总RNA提取。提取后，在1.0％的琼脂糖凝胶上检测RNA的降解和污染。使用

分光光度计(Implen，Westlake Village，CA，USA)检查RNA纯度。使用

2.0Flurometer(Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)中的RNA AssayKit测定RNA的浓度。使用an Agilent Bioanalyzer 2100system(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)中的RNA Nano 6000Assay Kit评估RNA的完整性。

每个样品的总量为3μg RNA用作RNA样品制备的输入材料。按照制造商的说明书，使用UltraTMRNA Library Prep Kit

(NEB，USA)生成测序文库，并将索引代码添加到每个样品的属性序列中。简而言之，使用poly-T oligo附着磁珠从总RNA纯化mRNA。在NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer(5×)中，在高温下使用二价阳离子打断成短片段。以mRNA为模板，使用六碱基随机引物和M-MuLV逆转录酶(RNaseH-)合成第一链cDNA。随后使用DNA聚合酶I和RNA酶H进行第二链cDNA合成。通过外切核酸酶/聚合酶活性将剩余突出部分转化为平端。在DNA片段的3'末端腺苷酸化后，连接具有发夹环结构的NEBNext适配子以进行杂交。为了选择长度优先为150-200bp的cDNA片段，文库片段用AMPure XP系统(Beckman Coulter，Beverly，USA)纯化。然后将3μL USER Enzyme(NEB，USA)与大小选择的接头连接的cDNA在37℃下使用15min，然后在95℃下PCR 5min。进而使用Phusion高保真DNA聚合酶，通用PCR引物和Index(X)引物进行PCR。最后，将PCR产物纯化(AMPure XP系统)，并在Agilent Bioanalyzer 2100系统上评估文库质量。根据制造商的说明书，使用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS(Illumia)在cBot群集生成系统上进行索引编码样本的聚类。集群生成后，在Illumina HiSeqTM 2500高通量平台上对其准备进行测序，并生成配对末端读取。

FASTQ格式的原始数据(raw reads)首先通过内部Perl脚本进行处理。在此步骤中，通过删除包含适配器的读取，包含poly-N的读取以及从原始数据读取的低质量来获取干净的数据(clean reads)。同时，计算了clean data的Q20，Q30，GC含量和序列重复水平。所有的下游分析都是以高质量的clean data为基础。然后，将所有库/样本中的左文件(read 1files)合并到一个大的left.fq文件中，将正确的文件(read 2files)合并到一个大的right.fq文件中。基于left.fq和right.fq使用Trinity(Grabherr et al.，2011)完成转录组组装，默认情况下min_kmer_cov设置为2，其他所有参数设置为默认值。选择具有最长长度的每个基因的转录本作为unigenes。

2)SNP的识别

本实施例通过使用Picard-tools v1.41和samtools v0.1.18来排序，删除重复读取，对齐合并获得每个样本的bam结果。采用GATK2v3.2软件用于执行SNP calling(Mckennaet al，2010)。原始的vcf文件使用GATK标准方法过滤(参数为clusterWindowSize:10；MQ0>＝4and(MQ0/(1.0*DP))>0.1；QUAL<10；QUAL<30.0or QD<5.0or HRun>5)，最后仅保留距离大于5的SNP。通过该方法鉴定出65535个SNP，SNP变异的形式有多种，但类型主要有转换和颠换，转换是颠换的2倍左右，如图1所示。

3)SNP引物的设计

根据转录组unigenes序列，挑选60个SNP位点，利用Oligo 6.0软件设计60对SNP引物。设计的方法如下：首先确定SNP位点所在序列的位置，然后在SNP位点的上下游分别设计正向引物和反向引物，引物设计的参数为引物长度18-23bp；Tm 60℃左右，尽可能保证上下游引物的Tm值一致，一般不超过2℃；GC含量在40-60％(45-55％最佳)；PCR产物大小为100-300bp；其它还应注意引物3'端不应出现超过3个的连续G或C；引物不能形成发夹结构，即不能有4bp以上的回文序列；引物自身、引物之间尽量不能有连续4个以上的碱基互补，尤其避免3'端的互补。

4)SNP引物的有效性验证

提取银杏基因组DNA，以银杏基因组DNA为模板，采用待检测SNP引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；反应结束后，取3μL的PCR产物加入4μL Loading buffer，再加3μLddH₂O，利用8％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，然后采用银染方法对PCR扩增产物进行检测。能检测到目的条带且无其它杂带和引物二聚体的，该待检测引物即为有效引物。

10μL的PCR反应体系中包括：10×buffer；0.2mmol/L dNTPs；2.5mmol/L Mg²⁺；0.2μmol/L SNP引物；1U Taq DNA聚合酶和40ng DNA模版；剩余ddH₂O补齐。

PCR的反应程序为：预变性94℃5min；30循环的94℃30s，最佳Tm 55℃30s，72℃30s；延伸72℃3min，最终4℃保存。

结果表明：挑选的60对SNP引物中，有45对引物能够扩增出条带，说明引物设计的方法较好，但其中的18对引物扩增出的条带不单一，可能存在多个SNP位点，暂不考虑进行HRM分析，另外27对引物扩增条带单一且产物大小与预期一致，暂为有效SNP引物，用于HRM分析。1对引物对应1个目标SNP位点，1对引物的扩增产物为含有对应SNP位点的DNA片段。

2、再次筛选对银杏进行基因分型的SNP引物

1)PCR扩增及高分辨率溶解曲线(HRM)分析进行基因分型

以90个银杏个体(其中6个银杏个体为转录组测序的银杏；84棵银杏古树名木，分别来自3个群体，贵州盘县28株，浙江天目山28株和湖北安陆28株)的基因组DNA为模板，分别采用上述27对SNP有效性引物进行PCR扩增，得到每个个体的27个引物对应的PCR扩增产物，每个引物对的PCR扩增产物为含有某个SNP位点的DNA片段。

PCR反应体系10μL：25ng模板DNA；1×Forget-Me-Not^TM qPCR Master Mix；0.1μmol/L SNP引物；剩余ddH₂O补齐。采用ViiA 7中的High Resolution Melt进行PCR及基因分型。第一步，10μL的PCR反应程序：预变性95℃2min；45个循环的95℃变性5s，60℃复性30s；第二步，HRM的反应程序：95℃10s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。

结果表明：有22对引物能够进行基因分型，其余5对引物(SNP23，SNP24，SNP25，SNP26，SNP27)因有杂峰或基因分型时可信度不高，所以被淘汰。采用Applied

HRM Software v2.0进行溶解曲线分析。22对引物对应的SNP位点得到HRM验证，其中，高分辨率溶解曲线部分结果如下：

图2为以SNP 18为例，在不同银杏个体表现出的扩增曲线；图3为以SNP18为例，利用高分辨率溶解曲线分析后，不同银杏个体表现出不同的溶解曲线峰；图4为以SNP 18为例，根据不同银杏个体表现出的差异溶解曲线峰，对其进行基因分型结果的溶解曲线，红色为CC，蓝色为CT，绿色为TT。22对SNP引物对90个银杏个体的基因分型结果如下表所示：

其中，11对SNP引物组合(SNP1，SNP4，SNP6，SNP8，SNP10，SNP14，SNP16，SNP17，SNP19，SNP20，SNP22)构建银杏古树名木指纹代码，获得84个银杏古树名木对应的指纹图谱，序号1-28为贵州盘县这个群体的28株古银杏，序号29-56为浙江天目山这个群体的28株古银杏，序号57-84为湖北安陆这个群体的28株古银杏，如下表所示:

2)高分辨率溶解曲线分析结果的验证

通过对PCR产物测序对高分辨率溶解曲线分析得到的基因分型的结果进行验证。具体步骤如下：挑选SNP的不同分型的PCR产物10μL，进行Sanger测序，根据测序峰图和等位基因出现的频率确定基因型，并与HRM技术的SNP基因分型结果进行比较，以验证引物基因分型的准确性。

经过Sanger测序验证本发明的引物通过HMR分析对银杏进行基因分型的结果100％正确，结果可靠。

Claims

1.一种用于对不同银杏进行基因分型的SNP引物，其特征在于，由11对引物组成，各引物的核苷酸序列如下表所示：

引物名称上游引物（5’ to 3’）下游引物（5’ to 3’） SNP1 TTTGTATGAATGCCCTCTTGCT CAAGGAAGTCGTGCAGAAGCTC SNP4 CATTGACAGAGATTAGAAAGG TCAAACGATACAAAAAGTGAC SNP6 ACTTTTGGTGCTCAGACTGGTT TATTCTCAAGGATGCCCCCACA SNP8 CTTGTAGCCATTTGTCACTGC AAGGCTTAGGATTGACATCTC SNP10 CTTAGGGTCCGATTTGGGCTG AGCGTATTTTGGATGCGGATT SNP14 AGACTGTGTTACTGGTATCAT GCATCTGGTCATCACTACTAA SNP16 GCTTACCTGAAACACGGCAC CAAGCGATGTTGTACGAGACC SNP17 ATAATGTCTCCAGGCAGT GCCAGAGTGAGAAGTCGT SNP19 GTATTATTGTATGGCAGGGAAG TGGAAGAAGGAATGACAGTGCT SNP20 ATCTATCTACCCCTTGTTATG GCCTTCAATCAAAGTATTCTG SNP22 GTGATTGAGGAAGCCCATTAG CACAGAACAGTCAGATAAACC

其中，银杏为下表中的84种：

。

2.权利要求1所述SNP引物在不同古银杏基因组DNA的SNP位点基因分型检测中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1）待测银杏样品DNA的提取；

2）使用相同反应体系及程序对银杏样本基因组DNA进行PCR扩增，得到待测银杏的PCR产物；

3）对PCR扩增产物进行高分辨率溶解曲线分析确定SNP位点的基因型；

4）Sanger测序再次验证SNP基因型。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤2）中，PCR反应体系10μL：25ng模板DNA；1X Forget-Me-Not^TM qPCR Master Mix；0.1 μmol/L SNP引物；剩余ddH₂O补齐。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤2）中，PCR反应程序：预变性 95℃2min； 95℃变性5s，45个循环；60℃复性30s。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤3）中，HRM的反应程序：95℃ 10s，60℃1min，95℃ 15s，60℃ 15s。