CN106834286A

CN106834286A - 一步法快速构建扩增子文库的引物组合

Info

Publication number: CN106834286A
Application number: CN201710218530.7A
Authority: CN
Inventors: 阎海; 王思振; 焦宇辰; 徐大勇; 郑乔松; 师晓
Original assignee: Beijing Genetron Health Gen Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Genetron Health Gen Technology Co Ltd
Priority date: 2017-04-05
Filing date: 2017-04-05
Publication date: 2017-06-13
Anticipated expiration: 2037-04-05
Also published as: CN106834286B

Abstract

本发明公开了一步法快速构建扩增子文库的引物组合，其包括：根据目标扩增子设计的上游融合引物，所述上游融合引物包括第一接头序列和根据目标扩增子设计的特异性上游引物序列；根据目标扩增子设计的下游融合引物，所述下游融合引物包括第二接头序列和根据目标扩增子设计的特异性下游引物序列；上游通用引物，所述上游通用引物包括第三接头序列、barcode序列和第一接头序列；和下游通用引物，所述下游通用引物包括通用序列和第二接头序列。运用该融合引物组合可以简便、快速的经1步构建扩增子文库，且由于在PCR起始前就引入barcode，使得样本及文库间交叉污染的可能性大大降低。

Description

一步法快速构建扩增子文库的引物组合

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种一步法快速构建扩增子文库的引物组合。

背景技术

下一代测序(next-generation sequencing，NGS)由于高通量、高灵敏度、高度自动化等特性，近年来在疾病的研究和诊断治疗中越来越多地被应用。NGS技术能实现多基因平行检测，比传统检测方法节省样本，且灵敏度更高，能更真实还原肿瘤变异全景。但LifeNGS平台中传统的构建扩增子文库的方法步骤繁琐，需要经过PCR扩增、消化、加接头、纯化等步骤，需要花费约5h；并且由于多步骤操作中需要开盖，因此文库易被污染，文库损失率高；另外在传统的构建扩增子文库的方法中，单个样品建立文库的成本较高，为200-1000元/例。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种一步法快速构建扩增子文库的引物组合。运用该引物组合可以简便、快速的经1步PCR构建扩增子文库，且由于在PCR起始前就引入barcode，使得样本及文库间交叉污染的可能性大大降低，并能简化实验场地分区的要求，该引物组合还能将单个样品建立文库的成本控制在30元/例。

为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

一种用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合，包括：

根据目标扩增子设计的上游融合引物，所述上游融合引物包括按照5’到3’的方向依次排列的第一接头序列(Bridge序列)和根据目标扩增子设计的特异性上游引物序列；

根据目标扩增子设计的下游融合引物，所述下游融合引物包括按照5’到3’的方向依次排列的第二接头序列(trP1序列)和根据目标扩增子设计的特异性下游引物序列；

上游通用引物，所述上游通用引物包括按照5’到3’的方向依次排列的第三接头序列(A序列)、barcode序列和第一接头序列；和

下游通用引物，所述下游通用引物包括按照5’到3’的方向依次排列的通用序列(Uni序列)和第二接头序列。

上述用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合在另一种实施方式中，所述第一接头序列包括SEQ ID:1序列，SEQ ID:1序列的核苷酸序列为GGCATACGTCCTCGTCTA。

上述用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合在另一种实施方式中，所述第二接头序列包括SEQ ID:2序列，SEQ ID:2序列的核苷酸序列为TCTATGGGCAGTCGGTGAT。

上述用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合在另一种实施方式中，所述第三接头序列包括SEQ ID:3序列，SEQ ID:3序列的核苷酸序列为CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG。

上述用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合在另一种实施方式中，所述通用序列包括SEQ ID:4序列，SEQ ID:4序列的核苷酸序列为CCACTACGCCTCCGCTTTCCTC。

上述用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合在另一种实施方式中，根据任意一种目标扩增子设计的上游融合引物、根据任意一种目标扩增子设计的下游融合引物、上游通用引物和下游通用引物的浓度均为100μM。

上述用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合在另一种实施方式中，当同一个PCR反应中的目标扩增子的数量＞1时，所述根据目标扩增子设计的上游融合引物为根据每一种目标扩增子设计的上游融合引物的组合，所述根据目标扩增子设计的下游融合引物为根据每一种目标扩增子设计的下游融合引物的组合。

上述用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合在另一种实施方式中，根据任意一种目标扩增子设计的上游融合引物和根据该目标扩增子设计的下游融合引物的摩尔比为1:1；所述上游通用引物和下游通用引物的摩尔比为1:1。上游通用引物和下游通用引物的具体用量要根据PCR扩增时目标扩增子的数量进行调整，如：PCR扩增时，需扩增5种目标扩增子和需扩增22种目标扩增子时，上游通用引物和下游通用引物的具体用量可能不同，本领域技术人员可根据本领域的常规技术手段确定上游通用引物和下游通用引物的具体用量。

上述用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合在另一种实施方式中，所述DNA样品为基因组DNA。

上述用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合在另一种实施方式中，基因组DNA提取自组织样本或福尔马林固定石蜡包埋样本。

上述用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合在另一种实施方式中，所述目标扩增子包括选自下组22种目标扩增子中的至少一个：

ALK基因的Chr2:29432588-29432707(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:5所示：TAAGGGACAAGCAGCCACACCCCATTCTTGAGGGGCTGAGGTGGAAGAGACAGGCCCGGAGGGGTGAGGCAGTCTTTACTCACCTGTAGATGTCTCGGGCCATCCCGAAGTCTCCAATCTTGGCCACTCTTCCAGGGCCTGGACAGGTCAAGAGGCAGT；

ALK基因的Chr2:29443616-29443730(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:6所示：CGGAGGAAGGACTTGAGGTCTCCCCCCGCCATGAGCTCCAGCAGGATGAACCGGGGCAGGGATTGCAGGCTCACCCCAATGCAGCGAACAATGTTCTGGTGGTTGAATTTGCTGCAGAGCAGAGAGGGATGTAACCAAAATTAACTGAGCTGAGTCTGG；

BRAF基因的Chr7:140453091-140453197(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:7所示：CCTCAATTCTTACCATCCACAAAATGGATCCAGACAACTGTTCAAACTGATGGGACCCACTCCATCGAGATTTCACTGTAGCTAGACCAAAATCACCTATTTTTACTGTGAGGTCTTCATGAAGAAATATATCTGAGGTGTAGTAAGTAAAGGAAAACAGTAG；

EGFR基因的Chr7:55241604-55241726(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:8所示：TGACCCTTGTCTCTGTGTTCTTGTCCCCCCCAGCTTGTGGAGCCTCTTACACCCAGTGGAGAAGCTCCCAACCAAGCTCTCTTGAGGATCTTGAAGGAAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGGGCTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTATAAGGTAAGGTCCCTGG；

EGFR基因的Chr7:55242398-55242513(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:9所示：ACAATTGCCAGTTAACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTGTGT；

EGFR基因的Chr7:55248970-55249096(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:10所示：GAAGCCACACTGACGTGCCTCTCCCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACAC；

EGFR基因的Chr7:55259505-55259621(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:11所示：CCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAGTAAGGAGGTGGCTTTAGGTCAGCCAGCATTTTCCTGACACCAGGGACCAGGCTGCCTTCCCACTAGCTGTATTGTTTA；

ERBB2基因的Chr17:37880969-37881082(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:12所示：CATACCCTCTCAGCGTACCCTTGTCCCCAGGAAGCATACGTGATGGCTGGTGTGGGCTCCCCATATGTCTCCCGCCTTCTGGGCATCTGCCTGACATCCACGGTGCAGCTGGTGACACAGCTTATGCCCTATGGCTGCCTCTTAGACCATGTCCG；

KRAS基因的Chr12:25380261-25380363(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:13所示：AGTCCTCATGTACTGGTCCCTCATTGCACTGTACTCCTCTTGACCTGCTGTGTCGAGAATATCCAAGAGACAGGTTTCTCCATCAATTACTACTTGCTTCCTGTAGGAATCCTGAGAAGGGAGAAACACAGTCTGGATTATTACAGTGCA；

KRAS基因的Chr12:25398183-25398310(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:14所示：AAAGAATGGTCCTGCACCAGTAATATGCATATTAAAACAAGATTTACCTCTATTGTTGGATCATATTCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCTTGCCTACGCCACCAGCTCCAACTACCACAAGTTTATATTCAGTCATTTTCAGCAGGCCTT；

MET基因的Chr7:116340233-116340335(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:15所示：TCGATCTGCCATGTGTGCATTCCCTATCAAATATGTCAACGACTTCTTCAACAAGATCGTCAACAAAAACAATGTGAGATGTCTCCAGCATTTTTACGGACCCAATCATGAGCACTGCTTTAATAGGGTAAGTCACATCAGTTCCC；

MET基因的Chr7:116411880-116412005(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:16所示：CCATGATAGCCGTCTTTAACAAGCTCTTTCTTTCTCTCTGTTTTAAGATCTGGGCAGTGAATTAGTTCGCTACGATGCAAGAGTACACACTCCTCATTTGGATAGGCTTGTAAGTGCCCGAAGTGTAAGCCCAACTACAGAAATGGTTTCAAATGAATCTGTAGACTACCGAGCT；

MET基因的Chr7:116417426-116417546(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:17所示：ATGTTACGCAGTGCTAACCAAGTTCTTTCTTTTGCACAGGGCATTTTGGTTGTGTATATCATGGGACTTTGTTGGACAATGATGGCAAGAAAATTCACTGTGCTGTGAAATCCTTGAACAGTAAGTGGCATTTTATTTAACCATGGAGTATACTTTTGTGGTTTGCAAC；

MET基因的Chr7:116423399-116423499(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:18所示：CAGTCAAGGTTGCTGATTTTGGTCTTGCCAGAGACATGTATGATAAAGAATACTATAGTGTACACAACAAAACAGGTGCAAAGCTGCCAGTGAAGTGGATGGCTTTGGAAAGTCTGCAAACTCAAAAGTTTACCACCAAGTCAGATGTG；

NRAS基因的Chr1:115256507-115256586(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:19所示：TTCGCCTGTCCTCATGTATTGGTCTCTCATGGCACTGTACTCTTCTTGTCCAGCTGTATCCAGTATGTCCAACAAACAGGTTTCACCATCTATAACCACTTGTTTTCTGTAAGAATCCTGGGGGTG；

NRAS基因的Chr1:115258651-115258755(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:20所示：TGAGAGACAGGATCAGGTCAGCGGGCTACCACTGGGCCTCACCTCTATGGTGGGATCATATTCATCTACAAAGTGGTTCTGGATTAGCTGGATTGTCAGTGCGCTTTTCCCAACACCACCTGCTCCAACCACCACCAGTTTGTACTCAG；

PIK3CA基因的Chr3:178936056-178936179(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:21所示：GGAAAATGACAAAGAACAGCTCAAAGCAATTTCTACACGAGATCCTCTCTCTGAAATCACTGAGCAGGAGAAAGATTTTCTATGGAGTCACAGGTAAGTGCTAAAATGGAGATTCTCTGTTTCTTTTTCTTTATTACAGAAAAAATAACTGAATTTGGCTGATCTCAGCATGTT；

PIK3CA基因的Chr3:178952000-178952092(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:22所示：ATGCCAGAACTACAATCTTTTGATGACATTGCATACATTCGAAAGACCCTAGCCTTAGATAAAACTGAGCAAGAGGCTTTGGAGTATTTCATGAAACAAATGAATGATGCACATCATGGTGGCTGGACAACAAAAATGGATTG；

TP53基因的Chr17:7577027-7577154(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:23所示：CTTCTTGTCCTGCTTGCTTACCTCGCTTAGTGCTCCCTGGGGGCAGCTCGTGGTGAGGCTCCCCTTTCTTGCGGAGATTCTCTTCCTCTGTGCGCCGGTCTCTCCCAGGACAGGCACAAACACGCACCTCAAAGCTGTTCCGTCCCAGTAGATTACCACTACTCAGGATAGGAAAAGAG；

TP53基因的Chr17:7577507-7577613(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:24所示：GCAAGTGGCTCCTGACCTGGAGTCTTCCAGTGTGATGATGGTGAGGATGGGCCTCCGGTTCATGCCGCCCATGCAGGAACTGTTACACATGTAGTTGTAGTGGATGGTGGTACAGTCAGAGCCAACCTAGGAGATAACACAGGCCCAAGA；

TP53基因的Chr17:7578182-7578298(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:25所示：CCCCAGTTGCAAACCAGACCTCAGGCGGCTCATAGGGCACCACCACACTATGTCGAAAAGTGTTTCTGTCATCCAAATACTCCACACGCAAATTTCCTTCCACTCGGATAAGATGCTGAGGAGGGGCCAGACCTAAGAGCAATCAGTGAGGAATCAGAGG；

TP53基因的Chr17:7578389-7578537(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:26所示：ACCATCGCTATCTGAGCAGCGCTCATGGTGGGGGCAGCGCCTCACAACCTCCGTCATGTGCTGTGACTGCTTGTAGATGGCCATGGCGCGGACGCGGGTGCCGGGCGGGGGTGTGGAATCAACCCACAGCTGCACAGGGCAGGTCTTGGCCAGTTGGCAAAACATCTTGTTGAGGGCAGGGGAGTACTG。

上述用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合在另一种实施方式中，根据ALK基因的Chr2:29432588-29432707(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:27所示：ACTGCCTCTTGACCTGTCC；根据ALK基因的Chr2:29432588-29432707(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:28所示：TAAGGGACAAGCAGCCACAC。

上述用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合在另一种实施方式中，根据ALK基因的Chr2:29443616-29443730(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:29所示：CCAGACTCAGCTCAGTTAATTTTGG；根据ALK基因的Chr2:29443616-29443730(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:30所示：CGGAGGAAGGACTTGAGGT。

上述用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合在另一种实施方式中，根据BRAF基因的Chr7:140453091-140453197(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:31所示：CTACTGTTTTCCTTTACTTACTACACCTC；根据BRAF基因的Chr7:140453091-140453197(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:32所示：CCTCAATTCTTACCATCCACAAAATGG。

上述用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合在另一种实施方式中，根据EGFR基因的Chr7:55241604-55241726(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:33所示：TGACCCTTGTCTCTGTGTTCTTG；根据EGFR基因的Chr7:55241604-55241726(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:34所示：CCAGGGACCTTACCTTATACACC。

上述用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合在另一种实施方式中，根据EGFR基因的Chr7:55242398-55242513(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:35所示：ACAATTGCCAGTTAACGTCTTCC；根据EGFR基因的Chr7:55242398-55242513(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:36所示：ACACAGCAAAGCAGAAACTCAC。

上述用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合在另一种实施方式中，根据EGFR基因的Chr7:55248970-55249096(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:37所示：GAAGCCACACTGACGTGC；根据EGFR基因的Chr7:55248970-55249096(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:38所示：GTGTTCCCGGACATAGTCCAG。

上述用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合在另一种实施方式中，根据EGFR基因的Chr7:55259505-55259621(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:39所示：CCGCAGCATGTCAAGATCACA；根据EGFR基因的Chr7:55259505-55259621(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:40所示：TAAACAATACAGCTAGTGGGAAGGC。

上述用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合在另一种实施方式中，根据ERBB2基因的Chr17:37880969-37881082(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:41所示：CATACCCTCTCAGCGTACCC；根据ERBB2基因的Chr17:37880969-37881082(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:42所示：CGGACATGGTCTAAGAGGCAG。

上述用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合在另一种实施方式中，根据KRAS基因的Chr12:25380261-25380363(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:43所示：TGCACTGTAATAATCCAGACTGTGT；根据KRAS基因的Chr12:25380261-25380363(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:44所示：AGTCCTCATGTACTGGTCCCTC。

上述用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合在另一种实施方式中，根据KRAS基因的Chr12:25398183-25398310(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:45所示：AAGGCCTGCTGAAAATGACTGA；根据KRAS基因的Chr12:25398183-25398310(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:46所示：AAAGAATGGTCCTGCACCAGTA。

上述用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合在另一种实施方式中，根据MET基因的Chr7:116340233-116340335(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:47所示：TCGATCTGCCATGTGTGCATT；根据MET基因的Chr7:116340233-116340335(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:48所示：GGGAACTGATGTGACTTACCCT。

上述用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合在另一种实施方式中，根据MET基因的Chr7:116411880-116412005(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:49所示：CCATGATAGCCGTCTTTAACAAGC；根据MET基因的Chr7:116411880-116412005(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:50所示：AGCTCGGTAGTCTACAGATTCATTT。

上述用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合在另一种实施方式中，根据MET基因的Chr7:116417426-116417546(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:51所示：ATGTTACGCAGTGCTAACCAAG；根据MET基因的Chr7:116417426-116417546(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:52所示：GTTGCAAACCACAAAAGTATACTCCA。

上述用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合在另一种实施方式中，根据MET基因的Chr7:116423399-116423499(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:53所示：CAGTCAAGGTTGCTGATTTTGGTC；根据MET基因的Chr7:116423399-116423499(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:54所示：CACATCTGACTTGGTGGTAAACTT。

上述用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合在另一种实施方式中，根据NRAS基因的Chr1:115256507-115256586(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:55所示：CACCCCCAGGATTCTTACAGAAAA；根据NRAS基因的Chr1:115256507-115256586(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:56所示：TTCGCCTGTCCTCATGTATTGG。

上述用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合在另一种实施方式中，根据NRAS基因的Chr1:115258651-115258755(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:57所示：CTGAGTACAAACTGGTGGTGGT；根据NRAS基因的Chr1:115258651-115258755(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:58所示：TGAGAGACAGGATCAGGTCAGC。

上述用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合在另一种实施方式中，根据PIK3CA基因的Chr3:178936056-178936179(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQID:59所示：GGAAAATGACAAAGAACAGCTCAAAG；根据PIK3CA基因的Chr3:178936056-178936179(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:60所示：AACATGCTGAGATCAGCCAAATTC。

上述用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合在另一种实施方式中，根据PIK3CA基因的Chr3:178952000-178952092(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQID:61所示：ATGCCAGAACTACAATCTTTTGATGAC；根据PIK3CA基因的Chr3:178952000-178952092(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:62所示：CAATCCATTTTTGTTGTCCAGCC。

上述用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合在另一种实施方式中，根据TP53基因的Chr17:7577027-7577154(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:63所示：CTCTTTTCCTATCCTGAGTAGTGGTAATC；根据TP53基因的Chr17:7577027-7577154(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:64所示：CTTCTTGTCCTGCTTGCTTACC。

上述用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合在另一种实施方式中，根据TP53基因的Chr17:7577507-7577613(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:65所示：TCTTGGGCCTGTGTTATCTCCTAG；根据TP53基因的Chr17:7577507-7577613(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:66所示：GCAAGTGGCTCCTGACCTG。

上述用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合在另一种实施方式中，根据TP53基因的Chr17:7578182-7578298(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:67所示：CCTCTGATTCCTCACTGATTGCTC；根据TP53基因的Chr17:7578182-7578298(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:68所示：CCCCAGTTGCAAACCAGAC。

上述用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合在另一种实施方式中，根据TP53基因的Chr17:7578389-7578537(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:69所示：CAGTACTCCCCTGCCCTCAA；根据TP53基因的Chr17:7578389-7578537(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:70所示：ACCATCGCTATCTGAGCAGC。

上述用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合在另一种实施方式中，所述目标扩增子为以下22种：

ALK基因的Chr2:29432588-29432707(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:5所示；

ALK基因的Chr2:29443616-29443730(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:6所示；

BRAF基因的Chr7:140453091-140453197(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:7所示；

EGFR基因的Chr7:55241604-55241726(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:8所示；

EGFR基因的Chr7:55242398-55242513(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:9所示；

EGFR基因的Chr7:55248970-55249096(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:10所示；

EGFR基因的Chr7:55259505-55259621(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:11所示；

ERBB2基因的Chr17:37880969-37881082(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:12所示；

KRAS基因的Chr12:25380261-25380363(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:13所示；

KRAS基因的Chr12:25398183-25398310(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:14所示；

MET基因的Chr7:116340233-116340335(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:15所示；

MET基因的Chr7:116411880-116412005(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:16所示；

MET基因的Chr7:116417426-116417546(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:17所示；

MET基因的Chr7:116423399-116423499(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:18所示；

NRAS基因的Chr1:115256507-115256586(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:19所示；

NRAS基因的Chr1:115258651-115258755(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:20所示；

PIK3CA基因的Chr3:178936056-178936179(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:21所示；

PIK3CA基因的Chr3:178952000-178952092(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:22所示；

TP53基因的Chr17:7577027-7577154(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:23所示；

TP53基因的Chr17:7577507-7577613(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:24所示；

TP53基因的Chr17:7578182-7578298(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:25所示；和

TP53基因的Chr17:7578389-7578537(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:26所示。

上述用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合在另一种实施方式中，根据上述22种目标扩增子设计的上游融合引物的组合、根据上述22种目标扩增子设计的下游融合引物的组合、上游通用引物和下游通用引物之间的摩尔比为：0.1-0.3：0.1-0.3：0.5-1：0.5-1，例如0.1:0.1:0.5:0.5。

上述用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合在另一种实施方式中，根据ALK基因的Chr2:29432588-29432707(Hg19)扩增子设计的上游融合引物、根据ALK基因的Chr2:29443616-29443730(Hg19)扩增子设计的上游融合引物、根据BRAF基因的Chr7:140453091-140453197(Hg19)扩增子设计的上游融合引物、根据EGFR基因的Chr7:55241604-55241726(Hg19)扩增子设计的上游融合引物、根据EGFR基因的Chr7:55242398-55242513(Hg19)扩增子设计的上游融合引物、根据EGFR基因的Chr7:55248970-55249096(Hg19)扩增子设计的上游融合引物、根据EGFR基因的Chr7:55259505-55259621(Hg19)扩增子设计的上游融合引物、根据ERBB2基因的Chr17:37880969-37881082(Hg19)扩增子设计的上游融合引物；KRAS基因的Chr12:25380261-25380363(Hg19)扩增子设计的上游融合引物、根据KRAS基因的Chr12:25398183-25398310(Hg19)扩增子设计的上游融合引物；根据MET基因的Chr7:116340233-116340335(Hg19)扩增子设计的上游融合引物、根据MET基因的Chr7:116411880-116412005(Hg19)扩增子设计的上游融合引物、根据MET基因的Chr7:116417426-116417546(Hg19)扩增子设计的上游融合引物、根据MET基因的Chr7:116423399-116423499(Hg19)扩增子设计的上游融合引物、根据NRAS基因的Chr1:115256507-115256586(Hg19)扩增子设计的上游融合引物、根据NRAS基因的Chr1:115258651-115258755(Hg19)扩增子设计的上游融合引物、根据PIK3CA基因的Chr3:178936056-178936179(Hg19)扩增子设计的上游融合引物、根据PIK3CA基因的Chr3:178952000-178952092(Hg19)扩增子设计的上游融合引物、根据TP53基因的Chr17:7577027-7577154(Hg19)扩增子设计的上游融合引物、根据TP53基因的Chr17:7577507-7577613(Hg19)扩增子设计的上游融合引物、根据TP53基因的Chr17:7578182-7578298(Hg19)扩增子设计的上游融合引物和根据TP53基因的Chr17:7578389-7578537(Hg19)扩增子设计的上游融合引物的摩尔比为1:2:1:4:2:1:2:4:2:2:2:2:1:4:2:2:2:2:4:2:4:2。

上述用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合在另一种实施方式中，所述引物组合进行PCR时的PCR反应体系包括以下组分：

上述用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合在另一种实施方式中，所述PCR预混液为KAPA HiFi PCR Kits 2×。

上述用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合在另一种实施方式中，用于构建同一个DNA样品的扩增子文库的引物组合中，上游通用引物中的barcode序列相同；用于构建不同DNA样品的扩增子文库的引物组合中，上游通用引物中的barcode序列不同。barcode序列是与样品相对应的，不同样品之间的barcode序列不同，只要能区分不同样品就可以，因此barcode序列不是特异性的，其序列可以变动。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明基于PGM平台设计的，使用其可以准确的同时对多个目标区域(扩增子)进行有效扩增。在使用其进行建库的过程中，本发明只涉及一轮PCR反应及1轮产物纯化步骤，大大的简化了现有商业化试剂盒的实验操作(如PCR过程、纯化步骤以及消化加接头等步骤)，节省了建库时间，整个建库流程只需2.5小时(包括了同一样本的DNA和RNA建库)。

有效杜绝样本及文库污染。操作流程的大大简化使我们建库过程更加的安全可靠，操作过程及步骤的减少有效的杜绝了建库过程中有可能造成的文库污染。

简化的生物信息学分析流程。该方法所得到的扩增子文库结构单一，数据可靠，所得文库的DNA链组成简单明了，后续的生物信息学分析更加的简化。

文库构建完成之后，只需Qubit 2.0定量即可，省去了qPCR定量环节，进一步缩短了建库时间并减少了相应的操作步骤，避免繁琐的实验流程可能造成的实验误差。

附图说明

图1是本发明实施例1中扩增子文库构建完成后检测得到的扩增产物分布图。

图2是本发明实施例1中所得文库里22个扩增子的相关参数。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

实施例1

待测样本为6份FFPE样本(即：福尔马林固定石蜡包埋样本，FFPE代表Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded)，其中4份为非小细胞肺癌患者的FFPE样本，另外2份为非肿瘤患者的FFPE样本。利用特异性设计的融合引物采用一步法对6份FFPE样本构建扩增子DNA文库，具体过程如下：

1、基因组DNA的提取：使用Qiagen FFPE DNA Kit(离心柱型)试剂盒提取FFPE样本中的基因组DNA，具体步骤参照试剂盒操作说明，将所得基因组DNA溶解于Tris-HCl缓冲液，Nano Drop检测DNA提取质量，用Qubit 3.0检测样本DNA浓度后，将每份基因组DNA样本稀释到浓度为20ng/μl。

2、设计并合成引物：

根据目标扩增子设计的上游融合引物，所述上游融合引物包括按照5’到3’的方向依次排列的第一接头序列和根据目标扩增子设计的特异性上游引物序列；

根据目标扩增子设计的下游融合引物，所述下游融合引物包括按照5’到3’的方向依次排列的第二接头序列和根据目标扩增子设计的特异性下游引物序列；

上游通用引物，所述上游通用引物包括按照5’到3’的方向依次排列的第三接头序列、barcode序列和第一接头序列；和

下游通用引物，所述下游通用引物包括按照5’到3’的方向依次排列的通用序列和第二接头序列。

构建DNA样品的扩增子文库的引物组合中，根据目标扩增子设计的特异性上游引物序列和特异性下游引物序列的信息如下：

以下表格中给出了不同目标扩增子的信息，并给出了针对这些扩增子设计的特异性上游引物序列Special Primer Start和特异性下游引物序列Special Primer End。另外还给出了根据目标扩增子设计的上游融合引物、根据目标扩增子设计的下游融合引物、上游通用引物和下游通用引物的序列。Puf代表可选择的上游通用引物，Pur代表下游通用引物。

第一接头序列为GGCATACGTCCTCGTCTA，第二接头序列为TCTATGGGCAGTCGGTGAT，第三接头序列为CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG，通用序列为CCACTACGCCTCCGCTTTCCTC。

3、形成PCR反应体系，具体PCR反应体系如下：

用于构建同一个DNA样品的扩增子文库的引物组合通过以下方法配制：(1)将步骤2中合成的上游通用引物、下游通用引物、根据22种目标扩增子设计的各上游融合引物和各下游融合引物分别加水溶解至浓度100μM；(2)将22条序列号从小到大浓度分别为100μM的上游融合引物按照摩尔比为1:2:1:4:2:1:2:4:2:2:2:2:1:4:2:2:2:2:4:2:4:2混合得到上游融合引物组合，将22条浓度分别为100μM的下游融合引物按照与相应上游融合引物等体积的量进行混合得到下游融合引物组合，再将上游融合引物组合和下游融合引物组合等体积混合；(3)将浓度分别为100μM的上游通用引物和下游通用引物等体积混合；(4)再将上游融合引物组合、下游融合引物组合、上游通用引物和下游通用引物按照摩尔比为：0.1：0.1：0.5：0.5进行混合，即得准备好的用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合。6组不同的待检样本需要含有6个不同的barcode序列标签的引物组合分别对应。

4、进行PCR程序，PCR仪使用Applied bio-system的2720Thermal Cycler，PCR反应程序如下：

5、PCR反应结束后，用Beckman Coulter公司的Agencourt AMPure XP Kit(货号A63880/A63881/A63882)进行纯化。操作步骤如下：

1)提前30分钟取出Agencourt AMPure XP Kit，充分涡旋后，室温静置。

2)PCR反应结束后，将磁珠再次充分涡旋，向体系中加入20ul磁珠，反复吹打5次以上或充分涡旋，室温静置5分钟。

3)将EP管转移至置于磁力架上，静置5分钟至溶液澄清后，用移液枪小心除去上清，注意不要触碰磁珠。

4)每管加入100ul新鲜配置的80％乙醇溶液，EP管置于磁力架上缓慢旋转2圈，静置5m，弃去上清。

5)重复4步一次。

6)将EP管打开，室温静置，使液体挥发干净，以磁珠表面无光泽为准，注意不要过分干燥磁珠。

7)从磁力架上取下EP管，加入30ul PCR级纯化水，涡旋混匀后，室温静置10分钟。

8)将上步的EP管置于磁力架上2分钟或直至溶液澄清后，用移液枪在远离磁石的一面小心吸取上清液，注意不要触碰磁珠。

至此，扩增子文库构建完成，图1为文库构建完成后Agilent 2200TapeStationSystems检测得到的扩增产物分布图，横坐标为片段长度，纵坐标为信号强度(FU)，lower峰为25bp位置marker，upper峰为1500bp位置marker，如图1所示经PCR扩增后所得PCR产物集中在241-271bp范围内，图1说明实验结果和实验设计相符合，从图1可以判断所构建文库的大小及文库浓度。

6、上机测序及结果分析

上述通过融合引物一步法获得的扩增子文库，使用Ion PGM平台的318芯片，进行扩增子测序，每个文库的数据量为50M bps。每个样本平均测序深度不低于1600X，单个扩增子测序深度均达到600X。所得测序结果如图2所示，从图2可以进一步对22扩增子的各扩增子是否进行了扩增以及各扩增子的扩增均一性进行分析。

测序的结果经过数据处理、生物信息学分析之后得到检测基因的突变情况。数据处理过程包括测序数据的转换、质控、序列比对(参考基因组为NCBI GRCh37/Hg19)、突变位点分析等过程，通过数据处理分析后得到检测样本的突变信息。

实际收集的样本检测情况如下：6例受检者的FFPE样本中，2例正常人样本未检测到肿瘤相关突变，4例肿瘤患者的FFPE样本检测结果中，Sample1检测到p.R248W突变，sample2检测到p.T790M突变，sample3检测到p.G12A突变，Sample4检测到p.E545K突变。该结果和sanger检测的结果一致。充分说明了本发明的实际应用性和良好特异性。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京泛生子基因科技有限公司

<120> 一步法快速构建扩增子文库的引物组合

<130> P170584DD1F

<160> 70

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggcatacgtc ctcgtcta 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tctatgggca gtcggtgat 19

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag 30

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccactacgcc tccgctttcc tc 22

<210> 5

<211> 159

<212> DNA

<213> 人ALK基因的Chr2:29432588-29432707 扩增子

<400> 5

taagggacaa gcagccacac cccattcttg aggggctgag gtggaagaga caggcccgga 60

ggggtgaggc agtctttact cacctgtaga tgtctcgggc catcccgaag tctccaatct 120

tggccactct tccagggcct ggacaggtca agaggcagt 159

<210> 6

<211> 159

<212> DNA

<213> 人ALK基因的Chr2: 29443616-29443730扩增子

<400> 6

cggaggaagg acttgaggtc tccccccgcc atgagctcca gcaggatgaa ccggggcagg 60

gattgcaggc tcaccccaat gcagcgaaca atgttctggt ggttgaattt gctgcagagc 120

agagagggat gtaaccaaaa ttaactgagc tgagtctgg 159

<210> 7

<211> 163

<212> DNA

<213> 人BRAF基因的Chr7: 140453091-140453197扩增子

<400> 7

cctcaattct taccatccac aaaatggatc cagacaactg ttcaaactga tgggacccac 60

tccatcgaga tttcactgta gctagaccaa aatcacctat ttttactgtg aggtcttcat 120

gaagaaatat atctgaggtg tagtaagtaa aggaaaacag tag 163

<210> 8

<211> 169

<212> DNA

<213> 人EGFR基因的Chr7: 55241604-55241726扩增子

<400> 8

tgacccttgt ctctgtgttc ttgtcccccc cagcttgtgg agcctcttac acccagtgga 60

gaagctccca accaagctct cttgaggatc ttgaaggaaa ctgaattcaa aaagatcaaa 120

gtgctgggct ccggtgcgtt cggcacggtg tataaggtaa ggtccctgg 169

<210> 9

<211> 161

<212> DNA

<213> 人EGFR基因的Chr7: 55242398-55242513扩增子

<400> 9

acaattgcca gttaacgtct tccttctctc tctgtcatag ggactctgga tcccagaagg 60

tgagaaagtt aaaattcccg tcgctatcaa ggaattaaga gaagcaacat ctccgaaagc 120

caacaaggaa atcctcgatg tgagtttctg ctttgctgtg t 161

<210> 10

<211> 166

<212> DNA

<213> 人EGFR基因的Chr7: 55248970-55249096扩增子

<400> 10

gaagccacac tgacgtgcct ctccctccct ccaggaagcc tacgtgatgg ccagcgtgga 60

caacccccac gtgtgccgcc tgctgggcat ctgcctcacc tccaccgtgc agctcatcac 120

gcagctcatg cccttcggct gcctcctgga ctatgtccgg gaacac 166

<210> 11

<211> 163

<212> DNA

<213> 人EGFR基因的Chr7: 55259505-55259621扩增子

<400> 11

ccgcagcatg tcaagatcac agattttggg ctggccaaac tgctgggtgc ggaagagaaa 60

gaataccatg cagaaggagg caaagtaagg aggtggcttt aggtcagcca gcattttcct 120

gacaccaggg accaggctgc cttcccacta gctgtattgt tta 163

<210> 12

<211> 155

<212> DNA

<213> 人ERBB2基因的Chr17: 37880969-37881082扩增子

<400> 12

cataccctct cagcgtaccc ttgtccccag gaagcatacg tgatggctgg tgtgggctcc 60

ccatatgtct cccgccttct gggcatctgc ctgacatcca cggtgcagct ggtgacacag 120

cttatgccct atggctgcct cttagaccat gtccg 155

<210> 13

<211> 150

<212> DNA

<213> 人KRAS基因的Chr12: 25380261-25380363扩增子

<400> 13

agtcctcatg tactggtccc tcattgcact gtactcctct tgacctgctg tgtcgagaat 60

atccaagaga caggtttctc catcaattac tacttgcttc ctgtaggaat cctgagaagg 120

gagaaacaca gtctggatta ttacagtgca 150

<210> 14

<211> 172

<212> DNA

<213> 人KRAS基因的Chr12: 25398183-25398310扩增子

<400> 14

aaagaatggt cctgcaccag taatatgcat attaaaacaa gatttacctc tattgttgga 60

tcatattcgt ccacaaaatg attctgaatt agctgtatcg tcaaggcact cttgcctacg 120

ccaccagctc caactaccac aagtttatat tcagtcattt tcagcaggcc tt 172

<210> 15

<211> 146

<212> DNA

<213> 人MET基因的Chr7: 116340233-116340335扩增子

<400> 15

tcgatctgcc atgtgtgcat tccctatcaa atatgtcaac gacttcttca acaagatcgt 60

caacaaaaac aatgtgagat gtctccagca tttttacgga cccaatcatg agcactgctt 120

taatagggta agtcacatca gttccc 146

<210> 16

<211> 175

<212> DNA

<213> 人MET基因的Chr7: 116411880-116412005扩增子

<400> 16

ccatgatagc cgtctttaac aagctctttc tttctctctg ttttaagatc tgggcagtga 60

attagttcgc tacgatgcaa gagtacacac tcctcatttg gataggcttg taagtgcccg 120

aagtgtaagc ccaactacag aaatggtttc aaatgaatct gtagactacc gagct 175

<210> 17

<211> 169

<212> DNA

<213> 人MET基因的Chr7: 116417426-116417546扩增子

<400> 17

atgttacgca gtgctaacca agttctttct tttgcacagg gcattttggt tgtgtatatc 60

atgggacttt gttggacaat gatggcaaga aaattcactg tgctgtgaaa tccttgaaca 120

gtaagtggca ttttatttaa ccatggagta tacttttgtg gtttgcaac 169

<210> 18

<211> 149

<212> DNA

<213> MET基因的Chr7: 116423399-116423499扩增子

<400> 18

cagtcaaggt tgctgatttt ggtcttgcca gagacatgta tgataaagaa tactatagtg 60

tacacaacaa aacaggtgca aagctgccag tgaagtggat ggctttggaa agtctgcaaa 120

ctcaaaagtt taccaccaag tcagatgtg 149

<210> 19

<211> 126

<212> DNA

<213> 人NRAS基因的Chr1: 115256507-115256586 扩增子

<400> 19

ttcgcctgtc ctcatgtatt ggtctctcat ggcactgtac tcttcttgtc cagctgtatc 60

cagtatgtcc aacaaacagg tttcaccatc tataaccact tgttttctgt aagaatcctg 120

ggggtg 126

<210> 20

<211> 149

<212> DNA

<213> 人NRAS基因的Chr1: 115258651-115258755扩增子

<400> 20

tgagagacag gatcaggtca gcgggctacc actgggcctc acctctatgg tgggatcata 60

ttcatctaca aagtggttct ggattagctg gattgtcagt gcgcttttcc caacaccacc 120

tgctccaacc accaccagtt tgtactcag 149

<210> 21

<211> 174

<212> DNA

<213> 人PIK3CA基因的Chr3: 178936056-178936179扩增子

<400> 21

ggaaaatgac aaagaacagc tcaaagcaat ttctacacga gatcctctct ctgaaatcac 60

tgagcaggag aaagattttc tatggagtca caggtaagtg ctaaaatgga gattctctgt 120

ttctttttct ttattacaga aaaaataact gaatttggct gatctcagca tgtt 174

<210> 22

<211> 143

<212> DNA

<213> 人PIK3CA基因的Chr3: 178952000-178952092扩增子

<400> 22

atgccagaac tacaatcttt tgatgacatt gcatacattc gaaagaccct agccttagat 60

aaaactgagc aagaggcttt ggagtatttc atgaaacaaa tgaatgatgc acatcatggt 120

ggctggacaa caaaaatgga ttg 143

<210> 23

<211> 179

<212> DNA

<213> 人TP53基因的Chr17: 7577027-7577154扩增子

<400> 23

cttcttgtcc tgcttgctta cctcgcttag tgctccctgg gggcagctcg tggtgaggct 60

cccctttctt gcggagattc tcttcctctg tgcgccggtc tctcccagga caggcacaaa 120

cacgcacctc aaagctgttc cgtcccagta gattaccact actcaggata ggaaaagag 179

<210> 24

<211> 150

<212> DNA

<213> 人TP53基因的Chr17: 7577507-7577613扩增子

<400> 24

gcaagtggct cctgacctgg agtcttccag tgtgatgatg gtgaggatgg gcctccggtt 60

catgccgccc atgcaggaac tgttacacat gtagttgtag tggatggtgg tacagtcaga 120

gccaacctag gagataacac aggcccaaga 150

<210> 25

<211> 160

<212> DNA

<213> 人TP53基因的Chr17: 7578182-7578298扩增子

<400> 25

ccccagttgc aaaccagacc tcaggcggct catagggcac caccacacta tgtcgaaaag 60

tgtttctgtc atccaaatac tccacacgca aatttccttc cactcggata agatgctgag 120

gaggggccag acctaagagc aatcagtgag gaatcagagg 160

<210> 26

<211> 189

<212> DNA

<213> 人TP53基因的Chr17: 7578389-7578537扩增子

<400> 26

accatcgcta tctgagcagc gctcatggtg ggggcagcgc ctcacaacct ccgtcatgtg 60

ctgtgactgc ttgtagatgg ccatggcgcg gacgcgggtg ccgggcgggg gtgtggaatc 120

aacccacagc tgcacagggc aggtcttggc cagttggcaa aacatcttgt tgagggcagg 180

ggagtactg 189

<210> 27

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

actgcctctt gacctgtcc 19

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

taagggacaa gcagccacac 20

<210> 29

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

ccagactcag ctcagttaat tttgg 25

<210> 30

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

cggaggaagg acttgaggt 19

<210> 31

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

ctactgtttt cctttactta ctacacctc 29

<210> 32

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

cctcaattct taccatccac aaaatgg 27

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

tgacccttgt ctctgtgttc ttg 23

<210> 34

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

ccagggacct taccttatac acc 23

<210> 35

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

acaattgcca gttaacgtct tcc 23

<210> 36

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

acacagcaaa gcagaaactc ac 22

<210> 37

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

gaagccacac tgacgtgc 18

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

gtgttcccgg acatagtcca g 21

<210> 39

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

ccgcagcatg tcaagatcac a 21

<210> 40

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

taaacaatac agctagtggg aaggc 25

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

cataccctct cagcgtaccc 20

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

cggacatggt ctaagaggca g 21

<210> 43

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

tgcactgtaa taatccagac tgtgt 25

<210> 44

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

agtcctcatg tactggtccc tc 22

<210> 45

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

aaggcctgct gaaaatgact ga 22

<210> 46

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

aaagaatggt cctgcaccag ta 22

<210> 47

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

tcgatctgcc atgtgtgcat t 21

<210> 48

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

gggaactgat gtgacttacc ct 22

<210> 49

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

ccatgatagc cgtctttaac aagc 24

<210> 50

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

agctcggtag tctacagatt cattt 25

<210> 51

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

atgttacgca gtgctaacca ag 22

<210> 52

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

gttgcaaacc acaaaagtat actcca 26

<210> 53

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

cagtcaaggt tgctgatttt ggtc 24

<210> 54

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

cacatctgac ttggtggtaa actt 24

<210> 55

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

cacccccagg attcttacag aaaa 24

<210> 56

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

ttcgcctgtc ctcatgtatt gg 22

<210> 57

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

ctgagtacaa actggtggtg gt 22

<210> 58

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

tgagagacag gatcaggtca gc 22

<210> 59

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

ggaaaatgac aaagaacagc tcaaag 26

<210> 60

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

aacatgctga gatcagccaa attc 24

<210> 61

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 61

atgccagaac tacaatcttt tgatgac 27

<210> 62

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 62

caatccattt ttgttgtcca gcc 23

<210> 63

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 63

ctcttttcct atcctgagta gtggtaatc 29

<210> 64

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 64

cttcttgtcc tgcttgctta cc 22

<210> 65

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 65

tcttgggcct gtgttatctc ctag 24

<210> 66

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 66

gcaagtggct cctgacctg 19

<210> 67

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 67

cctctgattc ctcactgatt gctc 24

<210> 68

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 68

ccccagttgc aaaccagac 19

<210> 69

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 69

cagtactccc ctgccctcaa 20

<210> 70

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 70

accatcgcta tctgagcagc 20

Claims

1.一种用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合，其特征在于，包括：

2.如权利要求1所述的用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合，其特征在于：所述第一接头序列包括SEQ ID:1序列；可选的，所述第二接头序列包括SEQ ID:2序列；可选的，所述第三接头序列包括SEQ ID:3序列；可选的，所述通用序列包括SEQ ID:4序列。

3.如权利要求1所述的用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合，其特征在于：用于构建同一个DNA样品的扩增子文库的引物组合中，上游通用引物中的barcode序列相同；用于构建不同DNA样品的扩增子文库的引物组合中，上游通用引物中的barcode序列不同。

4.如权利要求1所述的用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合，其特征在于：当同一个PCR反应中的目标扩增子的数量＞1时，所述根据目标扩增子设计的上游融合引物为根据每一种目标扩增子设计的上游融合引物的组合，所述根据目标扩增子设计的下游融合引物为根据每一种目标扩增子设计的下游融合引物的组合。

5.如权利要求1所述的用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合，其特征在于：所述DNA样品为基因组DNA；可选的，基因组DNA提取自组织样本或福尔马林固定石蜡包埋样本。

6.如权利要求1所述的用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合，其特征在于：所述目标扩增子包括选自下组22种目标扩增子中的至少一个：

TP53基因的Chr17:7578182-7578298(Hg19)扩增子，其序列如SEQ ID:25所示；

7.如权利要求6所述的用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合，其特征在于：

根据ALK基因的Chr2:29432588-29432707(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:27所示；根据ALK基因的Chr2:29432588-29432707(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:28所示；

可选的，根据ALK基因的Chr2:29443616-29443730(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:29所示；根据ALK基因的Chr2:29443616-29443730(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:30所示；

可选的，根据BRAF基因的Chr7:140453091-140453197(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:31所示；根据BRAF基因的Chr7:140453091-140453197(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:32所示；

可选的，根据EGFR基因的Chr7:55241604-55241726(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:33所示；根据EGFR基因的Chr7:55241604-55241726(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:34所示；

可选的，根据EGFR基因的Chr7:55242398-55242513(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:35所示；根据EGFR基因的Chr7:55242398-55242513(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:36所示；

可选的，根据EGFR基因的Chr7:55248970-55249096(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:37所示；根据EGFR基因的Chr7:55248970-55249096(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:38所示；。

可选的，根据EGFR基因的Chr7:55259505-55259621(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:39所示；根据EGFR基因的Chr7:55259505-55259621(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:40所示；

可选的，根据ERBB2基因的Chr17:37880969-37881082(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:41所示；根据ERBB2基因的Chr17:37880969-37881082(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:42所示；

可选的，根据KRAS基因的Chr12:25380261-25380363(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:43所示；根据KRAS基因的Chr12:25380261-25380363(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:44所示；

可选的，根据KRAS基因的Chr12:25398183-25398310(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:45所示；根据KRAS基因的Chr12:25398183-25398310(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:46所示；

可选的，根据MET基因的Chr7:116340233-116340335(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:47所示；根据MET基因的Chr7:116340233-116340335(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:48所示；

可选的，根据MET基因的Chr7:116411880-116412005(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:49所示；根据MET基因的Chr7:116411880-116412005(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:50所示；

可选的，根据MET基因的Chr7:116417426-116417546(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:51所示；根据MET基因的Chr7:116417426-116417546(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:52所示；

可选的，根据MET基因的Chr7:116423399-116423499(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:53所示；根据MET基因的Chr7:116423399-116423499(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:54所示；

可选的，根据NRAS基因的Chr1:115256507-115256586(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:55所示；根据NRAS基因的Chr1:115256507-115256586(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:56所示；

可选的，根据NRAS基因的Chr1:115258651-115258755(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:57所示；根据NRAS基因的Chr1:115258651-115258755(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:58所示；

可选的，根据PIK3CA基因的Chr3:178936056-178936179(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:59所示；根据PIK3CA基因的Chr3:178936056-178936179(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:60所示；

可选的，根据PIK3CA基因的Chr3:178952000-178952092(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:61所示；根据PIK3CA基因的Chr3:178952000-178952092(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:62所示；

可选的，根据TP53基因的Chr17:7577027-7577154(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:63所示；根据TP53基因的Chr17:7577027-7577154(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:64所示；

可选的，根据TP53基因的Chr17:7577507-7577613(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:65所示；根据TP53基因的Chr17:7577507-7577613(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:66所示；

可选的，根据TP53基因的Chr17:7578182-7578298(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:67所示；根据TP53基因的Chr17:7578182-7578298(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:68所示；

可选的，根据TP53基因的Chr17:7578389-7578537(Hg19)扩增子设计的特异性上游引物序列如SEQ ID:69所示；根据TP53基因的Chr17:7578389-7578537(Hg19)扩增子设计的特异性下游引物序列如SEQ ID:70所示。

8.如权利要求1所述的用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合，其特征在于：所述目标扩增子为以下22种：

9.如权利要求8所述的用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合，其特征在于：根据权利要求8中的22种目标扩增子设计的上游融合引物的组合、根据上述22种目标扩增子设计的下游融合引物的组合、上游通用引物和下游通用引物之间的摩尔比为：0.1-0.3：0.1-0.3：0.5-1：0.5-1。

10.如权利要求9所述的用于构建DNA样品的扩增子文库的引物组合，其特征在于：所述引物组合进行PCR时的PCR反应体系包括以下组分：