CN112746122B - 水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重pcr检测引物、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR检测引物、试剂盒及方法。该双重PCR检测引物由特异性地针对水稻胡麻叶斑病菌Srm1基因的引物对和特异性地针对水稻稻黑孢霉菌tef1‑α基因的引物对组成，其序列如SEQ ID NO.1～4所示。基于所述的双重PCR检测引物，本发明还提供一种水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR检测试剂盒和检测方法，可快速、准确地对两种病原菌以及引起的水稻病害进行区分，避免错误的病害识别，其扩增效率高，检测方法简单，耗时短，靶标检测特异性强、结果易读，检测结果可帮助快速地制定相应的精准防治方案，防止病害扩散与蔓延，保障水稻生产安全。
Description
技术领域
本发明属于农作物病害防治及植物检疫领域，特别涉及水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR检测引物、试剂盒及方法。
背景技术
中国是粮食生产大国，水稻种植面积在全球持续排在前列。根据国家统计局2019年主要农作物播种面积和产量的统计数据，我国水稻播种面积为2969万hm2，产量为20961万吨，水稻播种面积占粮食作物播种总面积的25.58％，产量占粮食作物总产量的31.58％，是我国第二大粮食作物，也是我国南方地区最重要的主食。
水稻胡麻斑病，又称水稻胡麻叶枯病，是由平脐蠕孢属稻平脐蠕孢菌(Bipolarisoryzae)引起的一种水稻真菌性病害(Goodwin et al.,2006)。感染胡麻叶斑病菌的水稻叶片初期为褐色小点，逐渐扩大为椭圆形病斑，严重时连成不规则大斑。在每个水稻生产季节，该病害均会影响全世界范围内数百万公顷水稻的生产，特别是在缺水、缺营养的条件下(Barnwal et al.,2013)。水稻胡麻斑病是部分国家和地区的主要病害之一，除叶部症状外穗部也受害并导致千粒重下降及空秕粒增多，影响产量和米质。随着生产施肥水平不断提高和水利条件不断改善，该病害的危害已有所减轻，但在部分地区晚稻秧龄过长时可导致发病较多，并引起后期穗枯，且由于耕作方法和气候的改变，近年来该病在多个稻区又严重发生。
黑孢霉属稻黑孢霉菌(Nigrospora oryzae(Berk.et Br.)petch)，可引起水稻叶片产生黄褐至黑褐色病斑，病斑可扩展成黄褐色圆形或不规则黑褐斑，严重时可致整叶枯死、植株不能抽穗或结实，对水稻安全生产存在一定的威胁。该病原菌在1957年已被报道在日本东京侵染水稻引起了叶斑病，随后在全世界范围内有相关发生报道(冯爱卿等，2013年)，该病菌可在世界各地可流行分布，特别在热带地区发生普遍，可通过种子带菌和风雨传播，并可侵染冬小麦(Piech et al.,1993)、菩提树(Khodke et al.,2009)、早熟禾(Zheng et al.,，2012)、棉花(Zhang et al.,2012)等。关于稻黑孢霉菌国内外尚未见到该水稻病原真菌的分子检测技术相关报道等。在国内，见有关于玉米裂轴病病原真菌-稻黑孢霉菌的分离、培养、形态特征等鉴定方法的专利，未涉及该病原菌的分子快速检测、诊断技术；在国外，有关于根据形态特征、ITS序列、致病性等进行病原菌鉴定的论文报道，同样未涉及该病原菌的分子快速检测、诊断技术。
由于水稻育种水平的不断提高，挖掘水稻抗病种质资源，利用分子生物技术等辅助手段提高育种效率，促进了高产、优质、抗病水稻新品种或新组合的产生及应用，生产上的水稻主栽品种更新换代频率也随之加快，较大程度上改变了很多地方的水稻品种布局。对于自然界的病原菌来说，寄主—病原菌—环境三者关系也会发生较大变化，这也导致了一些次要病害在主要病害得到显著控制的情况下逐步上升为主要病害。水稻胡麻斑病菌和稻黑孢霉菌引起的水稻叶部病害近年已有逐渐上升的趋势，特别是在水稻生长中后期可对水稻生产造成较大危害，严重可导致水稻不能正常抽穗及结实。由于水稻胡麻斑病和稻黑孢霉菌引起的叶斑病在叶部病斑上较为相似，依靠病状较难判断，容易发生上述的误判，使得无法制定准确的防治措施并延误最佳防治时机。然而，传统的病原菌分离培养鉴定的方法耗时耗力，且同时依赖专业人员的扎实植物病理学背景。因此，为解决上述提到的病害误判和病原菌鉴定耗时长等问题，建立一套稳定、简便、快速、灵敏的双重分子检测方法以开展两种病原真菌和病害的同时检测、诊断是非常必要的，准确、快速的病害诊断可帮助有效、快速地制定精准防治方案，防止病害扩散与蔓延，确保水稻安全生产。
然而，国内外尚未见到这两种主要病害的双重PCR检测方法或者其他分子检测方法的相关报道或专利申请，此外，在研究该两种病害、病原真菌的PCR检测方法方面也存在较大的技术难点，比如引起水稻叶斑类病害或穗部病害的水稻禾长蠕孢菌(Setosphaeriarostrata)和新月弯孢菌(Curvularia lunata)等病原真菌与水稻胡麻叶斑病菌同属格孢腔菌目(Pleosporales)格孢腔菌科(Pleosporaceae)，亲缘关系较近，而水稻禾长蠕孢菌(Setosphaeria rostrata)、新月弯孢菌(Curvularia lunata)、水稻层出镰刀菌(Fusariumproliferatum)等重要水稻病原真菌经常可在稻区为害(Ali et al.,2020)，这使得开发水稻胡麻叶斑病菌的检测技术存在技术难点但也是非常有必要去解决的。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR检测引物。
本发明的另一目的在于提供一种水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR检测试剂盒。
本发明的再一目的在于提供所述水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR检测引物或试剂盒的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR检测引物，所述双重PCR检测引物由特异性地针对水稻胡麻叶斑病菌Srm1基因的引物对和特异性地针对水稻稻黑孢霉菌tef1-α基因的引物对组成，其中，
水稻胡麻叶斑病菌Srm1基因的引物对的序列为：
BO-Srm1-427F：5’-CGAGGACATGTAAGTAGCCCAA-3’(SEQ ID NO.1)；
BO-Srm1-1015R：5’-GATTTTAGTTGGGCGTGTTCAC-3’(SEQ ID NO.2)；
水稻稻黑孢霉菌tef1-α基因的引物对的序列为：
NO-tef1-39F：5’-CGTCTTCGCACCATTTCACT-3’(SEQ ID NO.3)；
NO-tef1-420R：5’-TTGAGGAAAGATGGGCGACG-3’(SEQ ID NO.4)。
一种水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR检测试剂盒，含有上述水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR检测引物。
所述的试剂盒还可以含有用于PCR扩增的基础试剂(溶液)：Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgCl2、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、Taq DNA聚合酶和ddH2O中的至少一种。
所述的试剂盒进一步包括水稻胡麻叶斑病菌和/或稻黑孢霉菌的阳性对照DNA模板。
一种用于检测或区分水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR方法，所述的方法包括使用所述的水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR检测引物和/或所述的水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR检测试剂盒进行双重PCR扩增的步骤。
所述的用于检测或区分水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR方法，具体包括如下步骤：
(1)提取待测样品的基因组DNA；
(2)以提取的基因组DNA为模板，利用上述水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR检测引物进行双重PCR扩增反应，得到扩增产物；
(3)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，然后根据电泳结果进行分析：当PCR产物呈现589bp的特异条带时，说明待测样本中含有水稻胡麻叶斑病菌；当PCR产物呈现382bp的特异条带时，说明待测样本中含有稻黑孢霉菌；当PCR产物呈现589bp和382bp两种特异条带时，说明待测样本中同时含有水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌。
步骤(2)中所述的待测样品可以为水稻患病组织上直接分离的病原真菌或患病的水稻组织等。
步骤(2)中所述的双重PCR扩增反应可根据实际需要选择适用的高效、快速的常规PCR反应体系；优选为20μL反应体系：DNA模板1μL，10×PCR buffer 2μL，2.5mM dNTP(each)1.6μL，10μM双重PCR检测引物各0.3μL，5U/μL Taq酶0.2μL，ddH2O补足至20μL。
步骤(2)中所述的双重PCR扩增反应的条件优选为：94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min。
步骤(3)中所述的琼脂糖凝胶电泳检测优选为用1.5％(w/v)琼脂糖凝胶电泳进行检测。
所述的水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR检测引物，所述的水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR检测试剂盒，以及所述的用于检测或区分水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR方法在检测或区分水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明根据平脐蠕孢属(Bipolaris)和黑孢霉属(Nigrospora)同属多个种，以及多种引起水稻常见病害的病原真菌进行了分子遗传进化和基因序列比较分析等，选取Srm1基因(HOG1-related MAP kinase)作为水稻胡麻叶斑病菌(Bipolaris oryzae)的分子检测靶标位点，选取延伸因子tef1-α基因(translation elongation factor 1-alpha)作为稻黑孢霉菌(Nigrospora oryzae)的分子检测靶标位点。基于水稻胡麻叶斑病菌的Srm1基因序列和稻黑孢霉菌tef1-α基因序列，分别设计了在该种内菌株具有通用性但可明显区分于同属相近种的菌株或者引起其他水稻病害的真菌病原菌的特异性引物；优化引物组合、PCR反应体系等建立了双重PCR检测方法，并开发了水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重检测试剂盒，试剂盒还可以包含用于进行PCR的其他试剂和用于辅助结果检测的阳性对照，具有使用方便的优点。
(2)水稻胡麻斑病和稻黑孢霉菌引起的叶斑病在叶部病斑上较为相似，依靠病状较难判断，技术人员、农民经常容易发生误判；传统的病原菌分离、培养、鉴定的方法耗时耗力，且同时依赖专业人员扎实的植物病理学背景，本发明在确定合适的基因位点并设计特异的引物序列的基础上，建立了上述两种病原真菌的单项特异性检测方法，优化PCR反应体系建立了两种病原真菌的双重PCR检测方法以同步诊断两种容易误判的水稻病害，可快速地、准确地对两种病原菌以及引起的水稻病害进行区分，避免错误的病害识别。
(3)本发明提供的特异引物、试剂盒和检测方法，可在以样本总DNA作为模板的一次PCR扩增反应内同时检测样本中是否存在水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌：当PCR产物呈现589bp特异条带，即样本中含有水稻胡麻叶斑病菌；当PCR产物呈现382bp特异条带时，即样本中含有水稻稻黑孢霉菌；当PCR产物呈现589bp和382bp两种特异条带时，即样本中同时含有水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌。
(4)病原真菌的准确鉴定和水稻病害的快速诊断帮助有效、及时地制定相应的精准防治方案：本发明建立的一套稳定、简便、快速、灵敏的双重PCR检测方法进行病原菌的检测、鉴定或病害的诊断，可以实现同步检测两种可侵染水稻的病原性真菌水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌，其扩增效率高，检测方法简单，耗时短，靶标检测特异性强、结果易读，检测结果可帮助快速地制定相应的精准防治方案，防止病害扩散与蔓延，确保水稻安全生产。
(5)本发明中的水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR快速检测方法可通过应用于患病组织上直接分离的病原真菌的鉴定及检测、水稻患病组织的检测等，对水稻胡麻叶斑病菌、稻黑孢霉菌两种重要真菌病害引起的水稻病害的早期诊断、病情预报及综合防治具有重要意义。
附图说明
图1是水稻胡麻叶斑病菌Srm1基因特异性引物PCR扩增示意图(泳道M为DNAMarker2000；泳道1为水稻胡麻叶斑病菌(Bipolaris oryzae)(菌株分离自广东台山水稻病株)；泳道2为水稻胡麻叶斑病菌(Bipolaris oryzae)(菌株分离自广东南雄水稻病株)；泳道3为稻黑孢霉菌(Nigrospora oryzae)(菌株分离自广东南雄水稻病株)；泳道4～9依次为：水稻稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、水稻层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)、水稻上分离的高粱附球菌(Epicoccum sorghinum)、水稻禾长蠕孢菌(Setosphaeria rostrata)和水稻新月弯孢菌(Curvularia lunata)；泳道10为无菌水阴性对照)。
图2是水稻胡麻叶斑病菌NRPS6、PKS1、OPS2、BLR2基因位点设计引物的PCR扩增示意图(泳道M为DNA Marker 2000；泳道1为水稻胡麻叶斑病菌(Bipolaris oryzae)(菌株分离自广东台山水稻病株)；泳道2为水稻胡麻叶斑病菌(Bipolaris oryzae)(菌株分离自广东南雄水稻病株)；泳道3为稻黑孢霉菌(Nigrospora oryzae)(菌株分离自广东南雄水稻病株)；泳道4～9依次为：水稻稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)、水稻层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)、水稻上分离的高粱附球菌(Epicoccum sorghinum)、水稻禾长蠕孢菌(Setosphaeria rostrata)和水稻新月弯孢菌(Curvularia lunata)；泳道10为无菌水阴性对照)。
图3是水稻稻黑孢霉菌tef1-α基因特异性引物PCR扩增示意图(泳道M为DNAMarker2000；泳道1为水稻胡麻叶斑病菌(Bipolaris oryzae)(菌株分离自广东台山水稻病株)；泳道2为水稻胡麻叶斑病菌(Bipolaris oryzae)(菌株分离自广东南雄水稻病株)；泳道3为稻黑孢霉菌(Nigrospora oryzae)(菌株分离自广东南雄水稻病株)；泳道4～9依次为：水稻稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、水稻层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)、水稻上分离的高粱附球菌(Epicoccum sorghinum)、水稻禾长蠕孢菌(Setosphaeria rostrata)和水稻新月弯孢菌(Curvularia lunata)；泳道10为无菌水阴性对照)。
图4是水稻稻黑孢霉菌tef1-α基因非特异性引物PCR扩增示意图(泳道M为DNAMarker2000；泳道1为水稻胡麻叶斑病菌(Bipolaris oryzae)(菌株分离自广东台山水稻病株)；泳道2为水稻胡麻叶斑病菌(Bipolaris oryzae)(菌株分离自广东南雄水稻病株)；泳道3为稻黑孢霉菌(Nigrospora oryzae)(菌株分离自广东南雄水稻病株)；泳道4～9依次为：水稻稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、水稻层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)、水稻上分离的高粱附球菌(Epicoccum sorghinum)、水稻禾长蠕孢菌(Setosphaeria rostrata)和水稻新月弯孢菌(Curvularia lunata)；泳道10为无菌水阴性对照)。
图5是双重PCR检测技术对水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的PCR扩增示意图(泳道M为DNA Marker 2000；泳道1和2为水稻胡麻叶斑病菌(Bipolaris oryzae)；泳道3和4为水稻稻黑孢霉菌(Nigrospora oryzae)；泳道5和6为水稻胡麻叶斑病菌(Bipolarisoryzae)和水稻稻黑孢霉菌(Nigrospora oryzae)双项混合；泳道7为无菌水阴性对照)。
图6是双重PCR检测技术对多种水稻病原真菌和其他重要作物叶斑类病害病原真菌的PCR扩增示意图(泳道M为DNA Marker 2000；泳道1为水稻胡麻叶斑病菌(Bipolarisoryzae)；泳道2为稻黑孢霉菌(Nigrospora oryzae)；泳道3为水稻胡麻叶斑病菌(Bipolaris oryzae)和稻黑孢霉菌(Nigrospora oryzae)双项混合；泳道4～15依次为：水稻稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、水稻层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)、水稻上分离的高粱附球菌(Epicoccum sorghinum)、水稻禾长蠕孢菌(Setosphaeria rostrata)、水稻新月弯孢菌(Curvularia lunata)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、唐菖蒲弯孢菌(Curvularia gladioli)、柠檬拟茎点霉(Phomopsiscitri)、画眉草弯孢菌(Curvularia eragrostidis)、富贵竹炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、富贵竹叶点霉(Phyllosticta dracaena-angustifolia)；泳道16为无菌水阴性对照)。
图7是双重PCR检测技术对水稻胡麻叶斑病菌DNA的灵敏度检测示意图(泳道M为DNA Marker 2000；泳道1～9分别代表100～108的9个各个稀释倍数；泳道10为无菌水阴性对照)。
图8是双重PCR检测技术对水稻稻黑孢霉菌DNA的灵敏度检测示意图(泳道M为DNAMarker 2000；泳道1～9分别代表100～108的9个稀释倍数；泳道N为无菌水阴性对照)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的病原菌、试剂、方法和设备为本技术领域常规病原菌、试剂、方法和设备。
本发明中涉及的病原菌可以分离得到或参考文献获得，具体如下：
水稻胡麻叶斑病菌(Bipolaris oryzae)在文献“A review on crop losses,epidemiology and disease management of rice brown spot to identify researchpriorities and knowledge gaps.European Journal of Plant Pathology,2013,DOI:10.1007/s10658-013-0195-6”中公开。
水稻稻黑孢霉菌(Nigrospora oryzae)在文献“冯爱卿,汪文娟,曾列先,等.一种引致水稻稻叶褐条斑的病原鉴定初报[J].广东农业科学,2013,40(12):78-79.”。
水稻稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)在文献“张景欣,杨祁云,王慧,et al.航恢七号空间诱变变异株系的稻瘟病抗性研究[J].核农学报,2010,24(3):425-429.”中公开。
水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)在文献“刘惠芳,刘世江,丁怡,赵琪君,李荣玉,杨帆.水稻纹枯病菌对己唑醇的敏感性及抗性监测[J].中国农学通报,2020,36(13):137-141”中公开。
水稻新月弯孢菌(Curvularia lunata)在文献“刘连盟.水稻穗腐病病原分离,鉴定及生物学特性[J].中国水稻科学,2012,26(003):341-350”中公开。
水稻禾长蠕孢菌(Setosphaeria rostrata)：在文献“Morphological andmolecular characterization,sexual reproduction,and pathogenicity ofSetosphaeria rostrata isolates from rice leaf spot[J].Mycologia,2016.”中公开。
高粱附球菌(Epicoccum sorghinum)在文献“Liu L,Zhao Y,Zhang Y,etal.First Report of Leaf Spot Disease on Rice Caused by Epicoccum sorghinum inChina[J].Plant Disease,2020,DOI:10.1094/PDIS-03-20-0488-PDN”。
水稻层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)在文献“刘连盟.水稻穗腐病病原分离,鉴定及生物学特性[J].中国水稻科学,2012,26(003):341-350”中公开。
腐皮镰刀菌(Fusarium solani)在文献“Kong J,Xie Y,Yu H,et al.Synergisticantifungal mechanism of thymol and salicylic acid on Fusarium solani[J].LWT-Food Science and Technology,2020,140:110787.”中公开。
唐菖蒲弯孢菌(Curvularia gladioli)在文献“Torres D P,Silva M A,FurtadoG Q.Infection process of Curvularia gladioli on gladiolus leaves[J].TropicalPlant Pathology,2015,40(6):382-387”中公开。
柠檬拟茎点霉(Phomopsis citri)在文献“戴萍香,杨素华,吴瑞洪,等.德宏州柠檬流胶病的发生及防治[J].云南农业科技,2012,(2):54-55)中公开。
画眉草弯孢菌(Curvularia eragrostidis)(菠萝弯孢叶斑病病原菌)在文献“罗志文,范鸿雁,李向宏,等.海南菠萝几种叶部真菌病害研究[J].西南农业学报,2012,25(5):1703-1707”中公开。
富贵竹炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)在文献“徐婧,夏瑞.富贵竹炭疽病菌生物学特性及抑菌力研究[J].广东农业科学,2009，(03):87-90，99”中公开。
富贵竹叶点霉(Phyllosticta dracaena-angustifolia)在文献“贲海燕.我国北方主要花卉新病害及病原鉴定.东北农业大学硕士论文，2008)。
本发明中的引物序列合成以及基因组序列测序均在生工生物工程(上海)股份有限公司进行。
实施例1：水稻胡麻叶斑病菌特异引物的设计、筛选与特异性验证
一、水稻胡麻叶斑病菌特异引物的设计
水稻胡麻叶斑病菌是平脐蠕孢属(Bipolaris)，与侵染水稻引起水稻叶斑类病害或穗部病害的水稻禾长蠕孢菌(Setosphaeria rostrata)和新月弯孢菌(Curvularialunata)同样都是属于格孢腔菌目(Pleosporales)格孢腔菌科(Pleosporaceae)，亲缘关系较近，很多保守基因的序列同源性均较高，较难设计引物，需要对不同基因序列进行筛选。现有检测技术未涉及到是否可区分水稻禾长蠕孢菌(Setosphaeria rostrata)和新月弯孢菌(Curvularia lunata)等相近病原真菌的特异性检测，在检测水稻真菌病害上容易产生假阳性。据此，本发明在筛选多个不同候选基因的基础上，获得特异性引物扩增到具有明显序列差异的目的基因位点，并特异地与其他相近的水稻病原真菌区分开，避免假阳性，具体如下：
将本实验室测序获得的水稻胡麻叶斑病菌的Srm1、NRPS6、PKS1、OPS2、BLR2基因序列与NCBI数据库中已登录的水稻胡麻叶斑病菌的上述基因序列作比对，比较分析平脐蠕孢属(Bipolaris)同属多个种的基因序列；进一步，在与同属其他种以及引起水稻常见病害的其他多种病原真菌间存在序列差异的位点上。根据上述序列差异位点序列，应用Primer3.0设计PCR特异引物，优先挑选符合合适GC含量(40～60％)，最优Tm值为60℃等原则的引物，并交由上海生工合成。设计的多对PCR引物经以下真菌DNA提取、常规PCR反应等分子生物学试验，筛选获得特异PCR产物的最优引物组合。其中：
水稻胡麻叶斑病菌的Srm1基因的引物对的序列为：
BO-Srm1-427F：5’-CGAGGACATGTAAGTAGCCCAA-3’(SEQ ID NO.1)；
BO-Srm1-1015R：5’-GATTTTAGTTGGGCGTGTTCAC-3’(SEQ ID NO.2)。
水稻胡麻叶斑病菌的NRPS6、PKS1、OPS2、BLR2基因的引物对的序列为：
BO-NPS6-472F：5’-TCTTCCAAAGCACAATCGACC-3’(SEQ ID NO.5)；
BO-NPS6-1041R：5’-GGATGGACCGTAAGCATTCAC-3’(SEQ ID NO.6)。
BO-PKS1-4127F：5’-TACGGAGACGCCAGGTCTTA-3’(SEQ ID NO.7)；
BO-PKS1-4678R：5’-TCCCCATCCGTGAGAGATGT-3’(SEQ ID NO.8)。
BO-OPS2-427F：5’-CCAAGATTGTCGAGCGTGAG-3’(SEQ ID NO.9)；
BO-OPS2-995R：5’-CGTGGACAATGAGAAGCCAAG-3’(SEQ ID NO.10)。
BO-BLR2-417F：5’-CGAATTTATCCACCCAGACGAC-3’(SEQ ID NO.11)；
BO-BLR2-1005R：5’-GGTCAGCATCTCGATTGTCTC-3’(SEQ ID NO.12)。
二、水稻胡麻叶斑病菌特异引物的筛选和特异性验证
(1)真菌培养
水稻胡麻叶斑病菌(Bipolaris oryzae)(菌株分离自广东台山和南雄的水稻病株)的菌种以孢子悬浮液-80℃保存在25％甘油中。孢子悬浮液接种至PDA试管斜面(市售马铃薯葡萄糖琼脂培养基)，25℃培养7天，然后用5mL无菌水冲洗培养菌表面，得到孢子悬浮液，吸取1mL孢子悬浮液加入装有150mL PDA液体培养基的250mL三角瓶中，28℃，150rpm培养3天后，3层擦镜纸过滤菌丝。
(2)真菌DNA提取
a.取菌丝，液氮研磨成细粉；
b.取数个2mL的离心管，各加0.5mL体积的粉末，然后加入800μL的FPCB solution(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)，加完后立即涡旋，混匀，65℃温浴30min，其中每10min摇晃一次；
c.加氯仿800μL，摇匀，4℃12000r/min离心10min；
d.取上清液，加入等量氯仿(800μL)，摇匀，4℃12000r/min离心10min，重复一次；
e.取上清于1.5mL离心管中，加相同体积的无水乙醇，轻轻混匀，-20℃静置10min，4℃12000r/min离心10min；
f.倒掉上清，加1mL预冷的70％(v/v)乙醇水溶液清洗，混匀，然后4℃12000r/min离心2min；
g.倒掉乙醇，4℃12000r/min再离心2min，将离心管壁上的乙醇甩掉后，用移液器将乙醇吸出，放入通风橱中风干大约5min；
h.加200μL dd H2O，溶解DNA，-20℃保存。
(3)PCR反应体系
以水稻胡麻叶斑病菌及其余7个对照菌株的基因组DNA为模板，以无菌水为阴性对照，分别以上述设计的Srm1、NRPS6、PKS1、OPS2、BLR2基因的引物对为正反向引物；其中，7个对照菌株为：稻黑孢霉菌(Nigrospora oryzae)(菌株分离自广东南雄水稻病株)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、水稻层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)、水稻上分离的高粱附球菌(Epicoccum sorghinum)、水稻禾长蠕孢菌(Setosphaeria rostrata)、水稻新月弯孢菌(Curvularia lunata)。
PCR反应体系(20μL)：10×PCR buffer 2μL，Forward primer(正向引物)(10μM)和Backward primer(反向引物)(10μM)各0.4μL，dNTP(2.5mM each)1.6μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，模板DNA 1μL，DNase-Free water(无DNA酶水)补足20μL。
PCR反应条件是:94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min。
(4)结果分析
扩增产物使用1.5％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1和图2(泳道M为DL2000；泳道1为水稻胡麻叶斑病菌(Bipolaris oryzae)(菌株分离自广东台山水稻病株)；泳道2为水稻胡麻叶斑病菌(Bipolaris oryzae)(菌株分离自广东南雄水稻病株)；泳道3为稻黑孢霉菌(Nigrospora oryzae)；泳道4～9依次为：水稻稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)水稻层出镰刀菌(Fusariumproliferatum)、水稻上分离的高粱附球菌(Epicoccum sorghinum)、水稻禾长蠕孢菌(Setosphaeria rostrata)、水稻新月弯孢菌(Curvularia lunata)；泳道10为无菌水阴性对照)。
由图1可见，水稻胡麻叶斑病菌(泳道1和2)可扩增出清晰明显的589bp特异条带，但其余菌株和阴性对照则无扩增，表明所筛选的引物对BO-Srm1-427F/BO-Srm1-1015R具有高度特异性，可用于水稻胡麻叶斑病菌的检测、鉴定。
然而，使用扩增其他基因位点(如NRPS6、PKS1、OPS2、BLR2)的多对引物均会出现很明显的假阳性扩增(图2)，特别是上述提到的水稻禾长蠕孢菌(Setosphaeria rostrata)和新月弯孢菌(Curvularia lunata)这两个水稻病原真菌可呈现与水稻胡麻叶斑病菌(Bipolaris oryzae)相同的PCR扩增产物条带(泳道8和9)。
因此，在实施例1中，本发明基于水稻胡麻叶斑病菌Srm1基因位点差异序列设计的特异引物具有高度特异性，不受水稻禾长蠕孢菌(Setosphaeria rostrata)和新月弯孢菌(Curvularia lunata)等相近的水稻病原真菌影响。
最终筛选获得BO-Srm1-427F/BO-Srm1-1015R一对最适引物，分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
实施例2：稻黑孢霉菌特异引物的设计、筛选与特异性验证
一、稻黑孢霉菌特异引物的设计
本发明在稻黑孢霉菌和黑孢霉属(Nigrospora)同属多个种、多种引起水稻常见病害的病原真菌的基因序列比较分析的基础上，确定了tef1-α基因作为该病原菌检测的靶标位点。具体为：
将本实验室测序获得的水稻稻黑孢霉菌(Nigrospora oryzae)tef1-α基因与NCBI数据库中已登录的水稻稻黑孢霉菌tef1-α基因序列作比对，比较分析黑孢霉属(Nigrospora)同属多个种的该基因序列；进一步，在与同属其他种以及其他多种引起水稻常见病害的病原真菌间存在序列差异的位点上，设计特异引物。根据上述序列差异位点序列，应用Primer 3.0设计PCR特异引物，优先挑选符合合适GC含量(40～60％)，最优Tm值为60℃等原则的引物，并交由上海生工合成。设计的多对PCR引物经以下真菌DNA提取、常规PCR反应等分子生物学试验，筛选获得特异PCR产物的最优引物组合。其中：
稻黑孢霉菌tef1-α基因引物对的序列为：
NO-tef1-39F：5’-CGTCTTCGCACCATTTCACT-3’(SEQ ID NO.3)；
NO-tef1-420R：5’-TTGAGGAAAGATGGGCGACG-3’(SEQ ID NO.4)。
水稻稻黑孢霉菌tef1-α基因非特异性引物序列为：
NO-tef1-56F：5’-ACTATGATGGGTCGACGCTG-3’(SEQ ID NO.13)；
NO-tef1-436R：5’-AGAGAACATAATGAGCTTGAGGA-3’(SEQ ID NO.14)。
二、稻黑孢霉菌特异引物的筛选和特异性验证
(1)真菌培养
水稻稻黑孢霉菌(菌株分离自广东南雄水稻病株)的菌种以孢子悬浮液-80℃保存在25％甘油中。孢子悬浮液接种至PDA试管斜面(市售马铃薯葡萄糖琼脂培养基)，25℃培养7天，然后用5mL无菌水冲洗培养菌表面，得到孢子悬浮液，吸取1mL孢子悬浮液加入装有150mL PDA液体培养基的250mL三角瓶中，28℃，150rpm培养3天后，3层擦镜纸过滤菌丝。
(2)真菌DNA提取
参照实施例1。
(3)PCR反应体系
以水稻稻黑孢霉菌及其余8个对照菌株的基因组DNA为模板，以无菌水为阴性对照。分别以上述设计的引物对为正反向引物；其中，8个对照菌株为：水稻胡麻叶斑病菌(Bipolaris oryzae)(菌株分离自广东台山水稻病株)、水稻胡麻叶斑病菌(Bipolarisoryzae)(菌株分离自广东南雄水稻病株)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、水稻层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)、水稻上分离的高粱附球菌(Epicoccum sorghinum)、水稻禾长蠕孢菌(Setosphaeria rostrata)和水稻新月弯孢菌(Curvularia lunata)。
PCR反应体系(20μL)：10×PCR buffer 2μL，Forward primer(正向引物)(10μM)和Backward primer(反向引物)(10μM)各0.4μL，dNTP(2.5mM each)1.6μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，模板DNA 1μL，DNase-Free water(无DNA酶水)补足20μL。
PCR反应条件是:94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min。
(4)结果分析
扩增产物使用1.5％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图3和图4(M为DL2000；泳道1为水稻胡麻叶斑病菌(Bipolaris oryzae)(菌株分离自广东台山水稻病株)；泳道2为水稻胡麻叶斑病菌(Bipolaris oryzae)(菌株分离自广东南雄水稻病株)；泳道3为稻黑孢霉菌(Nigrospora oryzae)(菌株分离自广东南雄水稻病株)；泳道4～9依次为：水稻稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、水稻层出镰刀菌(Fusariumproliferatum)、水稻上分离的高粱附球菌(Epicoccum sorghinum)、水稻禾长蠕孢菌(Setosphaeria rostrata)、水稻新月弯孢菌(Curvularia lunata)；泳道10为无菌水阴性对照)。
由图3可见，水稻稻黑孢霉菌(泳道3)可扩增出清晰明显的382bp特异条带，但其余菌株和阴性对照则无扩增，表明所筛选的引物对NO-tef1-39F/NO-tef1-420R具有高度特异性，可用于水稻稻黑孢霉菌的检测、鉴定。图3结果表明了tef1-α基因可作为检测水稻稻黑孢霉菌的合适靶标位点，并确定了该病原菌的特异扩增引物对：NO-tef1-39F/NO-tef1-420R。
然而，基于该基因位点设计的引物并非是全部合适的，是需要经过严格筛选的，如设计的其他引物在扩增上述9个病原真菌菌株时可出现明显的非特异性扩增，结果可见图4。
最终筛选获得NO-tef1-39F/NO-tef1-420R一对最适引物，分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
实施例3：双重PCR检测体系的建立
以分离得到的水稻胡麻叶斑病菌、水稻稻黑孢霉菌的DNA为模板(DNA具体参考实施例1中的方法进行提取)，使用水稻胡麻叶斑病菌Srm1基因的上游引物BO-Srm1-427F(5’-CGAGGACATGTAAGTAGCCCAA-3’)、下游特异引物BO-Srm1-1015R(5’-GATTTTAGTTGGGCGTGTTCAC-3’)，稻黑孢霉菌tef1-α基因上游特异引物NO-tef1-39F(5’-CGTCTTCGCACCATTTCACT-3’)、NO-tef1-420R(5’-TTGAGGAAAGATGGGCGACG-3’)，进行双重PCR扩增反应。其中DNA模板分别为单独水稻胡麻叶斑病菌DNA模板、单独水稻稻黑孢霉菌、混合水稻胡麻叶斑病菌和水稻稻黑孢霉菌DNA模板(按体积比1:1)，并以无菌水为阴性对照。
双重PCR扩增反应体系(20μL)：DNA模板1μL，10×PCR buffer 2μL，dNTP(2.5mMeach)1.6μL，4个引物(10μM)各0.3μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，ddH2O补足至20μL；
即反应溶液成分及浓度如下：
具体反应体系如下：
| 反应溶液类别 | 浓度 | 体积 | 终浓度(20.0μL体积) |
| 10×PCR buffer | 10× | 2.0μL | 1× |
| dNTP | 2.5mM(每种，共4种) | 1.6μL | 0.2mM(每种dNTP) |
| BO-Srm1-427F | 10μM | 0.3μL | 0.15μM |
| BO-Srm1-1015R | 10μM | 0.3μL | 0.15μM |
| NO-tef1-39F | 10μM | 0.3μL | 0.15μM |
| NO-tef1-420R | 10μM | 0.3μL | 0.15μM |
| Taq DNA聚合酶 | 5U | 0.2μL | 1U |
| DNA | / | 1.0μL | / |
| <![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]> | / | 14.0μL | / |
| 合计 | / | 20.0μL | / |
反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min。
使用1.5％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果见图5(M为DL2000；泳道1、2为水稻胡麻叶斑病菌(Bipolaris oryzae)；泳道3、4为水稻稻黑孢霉菌(Nigrosporaoryzae)；泳道5、6为水稻胡麻叶斑病菌(Bipolaris oryzae)和水稻稻黑孢霉菌(Nigrospora oryzae)双项混合；泳道7为无菌水阴性对照)。
结果表明，泳道1、2均呈现589bp特异条带，泳道3、4均呈现382bp特异条带，目标扩增结果特异，未出现其他非特异性扩增产物条带；泳道5、6可呈现589bp和382bp两个特异条带，符合预期扩增结果，且未出现其他非特异性扩增产物条带；阴性对照则无扩增。
实施例4：双重PCR检测体系对多种植物病原真菌的检测
以水稻胡麻叶斑病菌、水稻稻黑孢霉菌单种模板DNA、混合模板DNA为阳性对照，以无菌水为阴性对照，使用水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌双重PCR方法检测水稻多种病原真菌、其他重要作物叶斑类病害病原真菌，验证该双重PCR检测方法在生产应用上的靶标检测特异性。其中，水稻多种病原真菌和其他叶斑类病害病原真菌如下：水稻稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、水稻层出镰刀菌(Fusariumproliferatum)、水稻上分离的高粱附球菌(Epicoccum sorghinum)、水稻禾长蠕孢菌(Setosphaeria rostrata)、水稻新月弯孢菌(Curvularia lunata)、腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)、唐菖蒲弯孢菌(Curvularia gladioli)、柠檬拟茎点霉(Phomopsis citri)、画眉草弯孢菌(Curvularia eragrostidis)(菠萝弯孢叶斑病病原菌)、富贵竹炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、富贵竹叶点霉(Phyllosticta dracaena-angustifolia)。
双重PCR扩增反应体系(20μL)：DNA模板1μL，10×PCR buffer 2μL，dNTP(2.5mM)1.6μL，引物BO-Srm1-427F(10μM)、BO-Srm1-1015R(10μM)、NO-tef1-39F(10μM)、NO-tef1-420R(10μM)各0.3μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，ddH2O补足至20μL；
反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min。
使用1.5％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果见图6(M为DL2000；泳道1为水稻胡麻叶斑病菌(Bipolaris oryzae)；泳道2为稻黑孢霉菌(Nigrospora oryzae)；泳道3为水稻胡麻叶斑病菌(Bipolaris oryzae)和稻黑孢霉菌(Nigrospora oryzae)双项混合；泳道4～15依次为：水稻稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)、水稻层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)、水稻上分离的高粱附球菌(Epicoccum sorghinum)、水稻禾长蠕孢菌(Setosphaeria rostrata)、水稻新月弯孢菌(Curvularia lunata)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、唐菖蒲弯孢菌(Curvulariagladioli)、柠檬拟茎点霉(Phomopsis citri)、画眉草弯孢菌(Curvularia eragrostidis)(菠萝弯孢叶斑病病原菌)、富贵竹炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、富贵竹叶点霉(Phyllosticta dracaena-angustifolia)；泳道16为无菌水阴性对照)。
由图6可见，水稻胡麻叶斑病菌单项DNA模板(泳道1)可扩增出589bp特异条带，水稻稻黑孢霉菌单项DNA模板(泳道2)可扩增出382bp特异条带，两个病原菌混合DNA模板(泳道3)则可扩增出589bp和382bp两个清晰明显的特异条带，但其余菌株和阴性对照则无扩增。结果验证了，该双重PCR检测方法可专门用于水稻胡麻叶斑病菌、水稻稻黑孢霉菌的特异性检测，检测结果可靠，适合在实际生产上应用。
实施例5：双重PCR检测体系灵敏度鉴定
取28℃、150r/min培养7天的水稻胡麻叶斑病菌、水稻稻黑孢霉菌的菌丝0.1g，分别提取基因组DNA，DNA提取办法参照实施例1，提取的DNA溶解于100μL无菌水中。
提取的DNA使用无菌水调整至浓度为100ng/μL，并使用无菌水依次作10倍浓度的系列稀释，共稀释9个浓度，即100×，101×，102×，103×，104×、105×、106×、107×、108×。以上述10个不同稀释浓度的DNA为模板(1μL)，PCR反应体系同实施例4。
PCR反应结束后，取5μL PCR产物用1.5％(w/v)琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果见图7和图8。结果表明，该方法检测水稻胡麻叶斑病菌、水稻稻黑孢霉菌的灵敏度是一致的，均是在使用100～102稀释浓度的DNA模板时可有效扩增目标特异片段，其他稀释浓度DNA模板以及阴性对照均未得到扩增，即水稻胡麻叶斑病菌、水稻稻黑孢霉菌的双重PCR检测方法可检测低至1ng/μL的病原菌DNA模板。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广东省农业科学院植物保护研究所
<120> 水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR检测引物、试剂盒及方法
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> BO-Srm1-427F
<400> 1
cgaggacatg taagtagccc aa 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> BO-Srm1-1015R
<400> 2
gattttagtt gggcgtgttc ac 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> NO-tef1-39F
<400> 3
cgtcttcgca ccatttcact 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> NO-tef1-420R
<400> 4
ttgaggaaag atgggcgacg 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> BO-NPS6-472F
<400> 5
tcttccaaag cacaatcgac c 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> BO-NPS6-1041R
<400> 6
ggatggaccg taagcattca c 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> BO-PKS1-4127F
<400> 7
tacggagacg ccaggtctta 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> BO-PKS1-4678R
<400> 8
tccccatccg tgagagatgt 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> BO-OPS2-427F
<400> 9
ccaagattgt cgagcgtgag 20
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> BO-OPS2-995R
<400> 10
cgtggacaat gagaagccaa g 21
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> BO-BLR2-417F
<400> 11
cgaatttatc cacccagacg ac 22
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> BO-BLR2-1005R
<400> 12
ggtcagcatc tcgattgtct c 21
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> NO-tef1-56F
<400> 13
actatgatgg gtcgacgctg 20
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> NO-tef1-436R
<400> 14
agagaacata atgagcttga gga 23
Claims (10)
1.一种水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR检测引物，其特征在于：所述的双重PCR检测引物由特异性地针对水稻胡麻叶斑病菌Srm1基因的引物对和特异性地针对水稻稻黑孢霉菌tef1-α基因的引物对组成，其中，
水稻胡麻叶斑病菌Srm1基因的引物对的序列为：
BO-Srm1-427F：5’-CGAGGACATGTAAGTAGCCCAA-3’；
BO-Srm1-1015R：5’-GATTTTAGTTGGGCGTGTTCAC-3’；
水稻稻黑孢霉菌tef1-α基因的引物对的序列为：
NO-tef1-39F：5’-CGTCTTCGCACCATTTCACT-3’；
NO-tef1-420R：5’-TTGAGGAAAGATGGGCGACG-3’。
2.一种水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR检测试剂盒，其特征在于：含有权利要求1所述的双重PCR检测引物。
3.根据权利要求2所述的水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR检测试剂盒，其特征在于：
所述的试剂盒还含有用于PCR扩增的基础试剂：Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgCl2、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、Taq DNA聚合酶和ddH2O中的至少一种。
4.根据权利要求2或3所述的水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR检测试剂盒，其特征在于：
所述的试剂盒还含有水稻胡麻叶斑病菌和/或稻黑孢霉菌的阳性对照DNA模板。
5.一种用于检测或区分水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR方法，其特征在于：所述的方法包括使用权利要求1所述的双重PCR检测引物或权利要求2~4任一项所述的双重PCR检测试剂盒进行双重PCR扩增的步骤。
6.根据权利要求5所述的用于检测或区分水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
（1）提取待测样品的基因组DNA；
（2）以提取的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的双重PCR检测引物进行双重PCR扩增反应，得到扩增产物；
（3）将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，然后根据电泳结果进行分析：当PCR产物呈现589 bp的特异条带时，说明待测样本中含有水稻胡麻叶斑病菌；当PCR产物呈现382 bp的特异条带时，说明待测样本中含有稻黑孢霉菌；当PCR产物呈现589 bp 和382 bp两种特异条带时，说明待测样本中同时含有水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌。
7.根据权利要求6所述的用于检测或区分水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR方法，其特征在于：
步骤（2）中所述的双重PCR扩增反应的体系为20 μL反应体系：DNA 模板1 μL，10×PCRbuffer 2 μL，2.5 mM dNTP 1.6 μL，10 μM双重PCR检测引物各 0.3 μL，5 U/μL Taq酶0.2μL，ddH2O 补足至20 μL。
8.根据权利要求6所述的用于检测或区分水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR方法，其特征在于：
步骤（2）中所述的双重PCR扩增反应的条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸60s，35个循环；72℃ 延伸10 min。
9.根据权利要求6所述的用于检测或区分水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR方法，其特征在于：
步骤（3）中所述的琼脂糖凝胶电泳检测为用1.5%（w/v）琼脂糖凝胶电泳进行检测。
10.权利要求1所述的双重PCR检测引物，权利要求2~4任一项所述的双重PCR检测试剂盒，以及权利要求5~9任一项所述的用于检测或区分水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR方法在检测或区分水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌中的应用。
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