CN107674923B - 大豆灰斑病菌的特异性分子检测引物及其应用 - Google Patents

大豆灰斑病菌的特异性分子检测引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种大豆灰斑病菌的特异性分子检测引物及其应用，一种大豆灰斑病菌特异性分子检测引物，包括上游引物和下游引物，如序列表SEQ ID No.1‑2所示。该引物对能够在大豆灰斑病菌中特异性地扩增得到769bp的目标产物。所述的检测引物在检测大豆灰斑病中和制备检测大豆灰斑病检测试剂盒中的应用。该引物特异性强，能用于区别大豆菌核病、大豆紫斑病、大豆疫霉根腐病、大豆赤霉病、大豆立枯病等大豆常见病害的病原菌；灵敏度高，对大豆灰斑病菌基因组DNA的检测灵敏度可达1ng/μL；使用方法简单快捷，无需对PCR产物进行克隆、测序、酶切等操作。

Description

大豆灰斑病菌的特异性分子检测引物及其应用
技术领域
本发明涉及一种大豆灰斑病菌的特异性分子检测引物及其应用。
背景技术
大豆作为人类食物和牲畜饲料中蛋白质的主要来源，也是重要的油料作物，在世界范围内广泛种植。在我国，大豆已经成为继水稻、小麦、玉米、棉花之后的第五大作物，在我国农业生产中占有重要地位。大豆灰斑病是一种由大豆尾孢菌(Cercospora sojinaHara)侵染引起的真菌病害，在大豆生产上危害严重，在病害流行年份一般可造成10％-30％的减产，严重时可减产50％，还能严重影响大豆品质。病菌以菌丝体及分生孢子在病残体及种子上越冬，成为翌年的初侵染源，初侵染后在受害植株病部产生分生孢子，借助风雨进行传播，从而使得病害在田间迅速蔓延。因此，在发病初期对大豆灰斑病菌进行快速、准确的检测和鉴定，对于有效控制大豆灰斑病的发生和传播具有重要的意义。
大豆灰斑病菌传统的检测鉴定方法需要对病原物进行分离纯化，观测其培养特征和形态结构，该过程耗时长且准确度较低，受人为及环境因素的干扰较大。随着分子生物学技术的发展，PCR(Polymerase chain reaction)技术被广泛应用到了病原菌的检测鉴定工作中。病原真菌的分子鉴定多以ITS基因为基础，综合PCR扩增、基因测序、RAPD分析、系统发育分析等方法，所需时间仍然相对较长，如2010年张俊华等使用真菌ITS基因通用引物ITS1/ITS4，通过对大豆灰斑病菌ITS基因的扩增并结合3种限制性内切酶的酶切才实现了对大豆灰斑病菌16个生理小种的区分。而且，包括大豆灰斑病菌在内的部分真菌的ITS序列种间相似性很高，无法设计特异性检测引物。
发明内容
针对现有技术对大豆灰斑病菌的检测鉴定周期长，且没有特异性分子检测引物的实际问题，本发明提供一种基于真菌β-tublin基因序列的大豆灰斑病菌特异性分子检测引物及其应用，可实现对大豆灰斑病菌的一步法PCR检测。
本发明所采用的技术如下：一种大豆灰斑病菌特异性分子检测引物，包括上游引物和下游引物，
上游引物TF1，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，
下游引物TR1，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。
本发明还具有如下技术特征：
1、利用如上所述的检测引物能够在大豆灰斑病菌中特异性地扩增得到769bp的目标产物。
2、采用如上所述的检测引物PCR检测大豆灰斑病的方法，以待检测样本DNA为模板，进行PCR扩增，PCR反应体系为：2.5μL 10×PCR缓冲液，浓度25mM 1.5μL Mg2+，浓度10mM0.5μL dNTP，2.5U Taq DNA聚合酶，上游引物TF1 10μM和下游引物TR1 10μM各1.0μL，DNA模板1.5μL，ddH2O 16.5μL；PCR反应程序为：94℃3min；94℃30s，57℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min；取5.0μL PCR产物在1.5％m/v琼脂糖凝胶中电泳，经溴化乙锭染色后在紫外光下观测扩增产物大小，若能特异性地扩增出769bp的产物即判定所测样品为大豆灰斑病样品。
3、如上所述的检测引物在检测大豆灰斑病中的应用。
4、如上所述的检测引物在制备检测大豆灰斑病检测试剂盒中的应用。
5、一种大豆灰斑病检测试剂盒，包括如上所述的检测引物。
6、如上所述的试剂盒，还包括2.5μL 10×PCR缓冲液，浓度25mM 1.5μL Mg2+，浓度10mM 0.5μL dNTP，2.5U Taq DNA聚合酶，上游引物TF1 10μM和下游引物TR1 10μM各1.0μL，DNA模板1.5μL，ddH2O 16.5μL。
本发明有以下有益效果：该引物特异性强，能用于区别大豆菌核病、大豆紫斑病、大豆疫霉根腐病、大豆赤霉病、大豆立枯病等大豆常见病害的病原菌；灵敏度高，对大豆灰斑病菌基因组DNA的检测灵敏度可达1ng/μL；使用方法简单快捷，无需对PCR产物进行克隆、测序、酶切等操作，全部操作过程可以在数小时内完成。
附图说明
图1为本发明所涉及的引物TF1/TR1对大豆灰斑病菌的特异性验证结果，M：DNAMarker D；泳道1：大豆灰斑病菌；泳道2：大豆菌核病菌；泳道3：大豆紫斑病菌；泳道4：大豆疫霉根腐病菌；泳道5：大豆赤霉病菌；泳道6：大豆立枯病菌；
图2为本发明所涉及的引物TF1/TR1对大豆灰斑病菌的灵敏度检测结果，M:DNAMaker D；泳道1：100ng/μL；泳道2:10ng/μL；泳道3:1ng/μL；泳道4:10-1ng/μL；泳道5：10- 2ng/μL；泳道6：10-3ng/μL；
图3为大豆灰斑病菌田间样品检测结果，M：DNA Marker D；CK-:健康大豆样品；1,4,6,9：大豆灰斑病菌阴性样品；2,3,5,7,8：大豆灰斑病菌阳性样品。
具体实施方式
为进一步阐释本发明内容，下面对具体实施方式进行详细描述。
实施例1：
大豆灰斑病菌特异性分子检测方法的建立
1.引物设计
植物病原真菌分子检测中最常用的ITS序列在部分真菌种属间相似性很高，难以直接用于精确到种的鉴定工作。本发明通过对大豆灰斑病菌及其它植物病原真菌的ITS、β-tublin、Actin、Cytb、EF-1α等基因序列的多重比对分析，最终在β-tublin基因序列内发现多个大豆灰斑病菌特异性位点，并据此设计、筛选了大豆灰斑病菌特异性检测引物。通过GenBank数据库下载大豆灰斑病菌(Cercospora sojina)及Cercospora属其他种真菌的β-tublin基因序列，使用MEGA 5.1软件进行多重比对分析，针对大豆灰斑病菌的特异性位点设计分子检测引物，所设计引物经Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)在线特异性验证的筛选，最终获得大豆灰斑病菌特异性检测引物：
上游引物TF1：5’-TGCTGCATTCTGGCAGACT-3’
下游引物TR1：5’-ACCGGACATGACGGCAGAC-3’
引物由上海生工生物有限公司合成。
2.大豆灰斑病菌基因组DNA的提取
采用SDS法提取大豆灰斑病菌的基因组DNA，具体方法如下：(1)收集大豆灰斑病菌菌丝体约20mg，在液氮中充分研磨成粉末，转移至1.5mL离心管中；(2)加入1mL SDS抽提缓冲液(3％SDS,50mM EDTA,50mM Tris-HCl,1％β-巯基乙醇)，68℃水浴1h；(3)12000rpm离心10min，取600μL上清液，加入等体积的25:24:1的苯酚:氯仿:异戊醇混合液，混匀；(4)12000rpm离心10min，取500μL上清液，加入等体积的25:24:1的苯酚:氯仿:异戊醇混合液，混匀；(5)12000rpm离心10min，取400μL上清液，加入等体积的异丙醇，-40℃沉淀1h；(6)12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用75％乙醇洗涤2次并晾干；(7)加入100μL ddH2O溶解，得到DNA样品。
3.大豆灰斑病菌的分子检测
以样品DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系包含：2.5μL 10×PCR缓冲液，1.5μLMg2+(25mM)，0.5μL dNTP(each 10mM)，2.5U Taq DNA聚合酶，上游引物TF1(10μM)和下游引物TR1(10μM)各1.0μL，DNA模板1.5μL，ddH2O 16.5μL。PCR反应程序为：94℃3min；94℃30s，57℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。取5.0μL PCR产物在1.5％(m/v)琼脂糖凝胶中电泳，经溴化乙锭染色后在紫外光下观测扩增产物大小。
4.检测结果
从大豆灰斑病菌DNA中能特异性地扩增出769bp的产物。
实施例2：
大豆灰斑病菌检测引物的特异性验证
1.待测样品基因组DNA的提取
采用上述SDS法提取大豆菌核病菌、大豆紫斑病菌、大豆疫霉根腐病菌、大豆赤霉病菌及大豆立枯病菌的基因组DNA。
2.大豆灰斑病菌检测引物的特异性检测
分别以上述供试真菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系包含：2.5μL10×PCR缓冲液，1.5μL Mg2+(25mM)，0.5μL dNTP(each 10mM)，2.5U Taq DNA聚合酶，上游引物TF1(10μM)和下游引物TR1(10μM)各1.0μL，DNA模板1.5μL，ddH2O 16.5μL。PCR反应程序为：94℃3min；94℃30s，57℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。取5.0μL PCR产物在1.5％(m/v)琼脂糖凝胶中电泳，经溴化乙锭染色后在紫外光下观测扩增产物大小。
3.特异性检测结果
如图1，大豆灰斑病菌特异性地扩增出了769bp的目标条带，而大豆菌核病菌、大豆紫斑病菌、大豆根腐病菌、大豆赤霉病菌及大豆立枯病菌均没有769bp的扩增条带，表明本发明的检测引物和方法对大豆灰斑病菌具有很好的特异性。
实施例3：
大豆灰斑病菌检测引物的灵敏度检测
1.大豆灰斑病菌基因组DNA的提取
采用上述SDS法提取大豆灰斑病菌的基因组DNA
2.DNA浓度测定与稀释
使用NanoDrop超微量分光光度计测定上述基因组DNA的浓度，用ddH2Oy依次梯度稀释至100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、10-1ng/μL、10-2ng/μL和10-3ng/μL。
3.分别以上述不同浓度的DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系包含：2.5μL10×PCR缓冲液，1.5μL Mg2+(25mM)，0.5μL dNTP(each 10mM)，2.5U Taq DNA聚合酶，上游引物TF1(10μM)和下游引物TR1(10μM)各1.0μL，DNA模板1.5μL，ddH2O 16.5μL。PCR反应程序为：94℃3min；94℃30s，57℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。取5.0μL PCR产物在1.5％(m/v)琼脂糖凝胶中电泳，经溴化乙锭染色后在紫外光下观测扩增产物大小。
4.灵敏度检测结果
如图2，浓度为100ng/μL、10ng/μL和1ng/μL的样品中扩增得到了769bp的目标条带，而浓度为10-1ng/μL、10-2ng/μL和10-3ng/μL的样品中没有扩增出清晰的目标条带，表明本发明的检测引物和方法的灵敏度可达1ng/μL。
实施例4：
大豆灰斑病田间样品的分子检测
1.待测植物材料总DNA的提取
取带有疑似大豆灰斑病病斑的大豆叶片约0.2g，在液氮中充分研磨成粉末，采用上述SDS法提取待测材料的总DNA。
2.大豆灰斑病田间样品的分子检测
以上述待测材料DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系包含：2.5μL 10×PCR缓冲液，1.5μL Mg2+(25mM)，0.5μL dNTP(each 10mM)，2.5U Taq DNA聚合酶，上游引物TF1(10μM)和下游引物TR1(10μM)各1.0μL，DNA模板1.5μL，ddH2O 16.5μL。PCR反应程序为：94℃3min；94℃30s，57℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。取5.0μL PCR产物在1.5％(m/v)琼脂糖凝胶中电泳，经溴化乙锭染色后在紫外光下观测扩增产物大小。
3.检测结果
如图3，在9份待测样品中有5份样品扩增得到了769bp的目标条带，大豆灰斑病的检出率为55.6％。
序列表
<110> 东北农业大学
<120> 大豆灰斑病菌的特异性分子检测引物及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> TF1
<400> 1
tgctgcattc tggcagact 19
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> TR1
<400> 1
accggacatg acggcagac 19

Claims (1)

1.一种大豆灰斑病的PCR检测方法，以待检测样本DNA为模板，进行PCR扩增，PCR反应体系为：2.5μL 10×PCR缓冲液，浓度25mM 1.5μL Mg2+，浓度10mM 0.5μL dNTP，2.5U Taq DNA聚合酶，上游引物TF1 10μM和下游引物TR1 10μM各1.0μL，DNA模板1.5μL，ddH2O 16.5μL；PCR反应程序为：94℃ 3min；94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 1min，35个循环；72℃ 10min；取5.0μL PCR产物在1.5％m/v琼脂糖凝胶中电泳，经溴化乙锭染色后在紫外光下观测扩增产物大小，若能特异性地扩增出769bp的产物即判定所测样品为大豆灰斑病样品，所述的上游引物TF1，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，下游引物TR1，其核苷酸序列如序列表SEQID No.2所示。
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