CN107881251A - 与番茄雄性不育突变位点ms‑15、ms‑26、ms‑47相关的分子标记和应用 - Google Patents

与番茄雄性不育突变位点ms‑15、ms‑26、ms‑47相关的分子标记和应用 Download PDF

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Abstract

发明属于农业生物技术工程和蔬菜遗传育种领域，具体涉及与番茄雄性不育突变位点ms‑15和ms‑26或ms‑47相关的分子标记、特异性引物和应用。所述的分子标记包括可以检测ms‑15位点中SNP的共显性分子标记MS15C、检测ms‑26和ms‑47位点中InDel的共显性分子标记MS26D。使用该分子标记可以替代传统的通过在开花期选择雄性不育植株以确保番茄育种材料含有雄性不育ms‑15、ms‑26或ms‑47突变位点的方法。利用本发明的分子标记可以在苗期辅助选择含有ms‑15、ms‑26或ms‑47突变位点的纯合植株和杂合植株，从而缩短育种周期、提高育种效率。

Description

与番茄雄性不育突变位点ms-15、ms-26、ms-47相关的分子标 记和应用
技术领域
本发明涉及农业生物技术工程和蔬菜遗传育种领域，具体涉及与番茄雄性不育突变位点ms-15、ms-26、ms-47相关的分子标记、引物和应用。
背景技术
利用番茄雄性不育系制种，杂交种种子生产量可达到3000kg/年。所用的番茄雄性不育系有包括ms-10(male sterile-10)、ms-15、ms-26、ms-32、ms-35、ms-47、ps(positional sterility)、ps-2等。
番茄雄性不育系ms-15、ms-26和ms-47几乎100％不育，柱头外露，可以不需要人工去雄而直接授粉，授粉后坐果正常，因此已经被用于番茄杂交种制种。但是，ms-15、ms-26和ms-47均为隐性突变。如果通过表型鉴定以确保育种材料中含有ms-15、ms-26或ms-47位点，该育种材料必须含有纯合的ms-15、ms-26或ms-47位点，并且需等到开花期才能进行表型鉴定。这样在转育ms-15、ms-26或ms-47位点时，除了几轮回交过程，还需要几轮自交过程。从而导致育种周期长、效率低。如果能开发与ms-15、ms-26或ms-47位点共分离的共显性分子标记，利用这些分子标记可以在番茄幼苗期进行分子检测，从可育株中鉴定出含ms-15、ms-26或ms-47位点的杂合株，从而省去转育中的几轮自交过程；另外还可以在定植前筛选出ms-15、ms-26或ms-47位点的纯合突变体，从而减少定植株数、降低种植成本。
发明内容
本发明的目的是提供与番茄雄性不育性状共分离的分子标记及其鉴定方法，可以作为番茄雄性不育性状的分子标记辅助选择工具。
本发明提供了与番茄雄性不育突变位点ms-15共分离的分子标记MS15C，该分子标记的检测物理位置为番茄2号染色体上第47,716,375碱基的SNP，该碱基为C的番茄可育、该碱基为为A的番茄则雄性不育。
为了实现本发明目的，首先通过精细定位将番茄雄性不育突变位点ms-26定位到约45-kb范围内。该区间内编码四个预测的基因，其中参与番茄雄蕊发育的Solyc02g084630基因被确定为MS-26的候选基因。
进一步的测序表明，雄性不育突变体2-327S的ms-26位点中存在一个12.7-kb的缺失，缺失区段的物理位置为SL2.50ch02:47,714,277-47,726,954。该缺失造成Solyc02g084630基因的启动子和前5个外显子丢失，从而导致该基因功能丧失。随后对番茄雄性不育突变体材料2-193S(ms-15)和2-837S(ms-47)中的Solyc02g084630基因进行了测序，发现番茄雄性不育突变体材料2-837S(ms-47)中存在与雄性不育突变体2-327S(ms-26)相同的缺失区段；在2-193S(ms-15)中，Solyc02g084630基因外显子有一个由C突变为A的SNP，物理位置为SL2.50ch02:47,716,375。该SNP导致了所预测的Solyc02g084630蛋白质序列中的一个色氨酸突变为甘氨酸。
本发明还提供了与番茄雄性不育突变位点ms-26或ms-47共分离的分子标记MS26D，其特征在于，所述分子标记的检测物理位置为番茄2号染色体上从第47,714,277碱基到47,726,954碱基的片段缺失
本发明还提供了与番茄雄性不育性状共分离的分子标记的特异性引物，其中，各个分子标记的特异性引物序列及其扩增目的片段长度如下：
①MS15C
正向引物MS15C-F为：5-ACCTTTCGTTCACGAATCTCAG-3，
反向引物MS15C-R为：5-GTCTGTTGATAGGCAGAGCATA-3。
含ms-15位点的番茄材料及育性正常番茄材料的扩增片段长度均为114-bp。
②MS26D
正向引物MS26D-F为：5-TAGAAGAACCCATTGCACTTTGT-3，
反向引物MS26D-R1为：5-CAGAACCTCTCCAACATCATAATC-3，
反向引物MS26D-R2为：5-TAATTACCGCTAATGTAACGACC-3。
含ms-26或ms-47位点的番茄材料扩增片段长度为589-bp，育性正常番茄材料扩增片段长度为838-bp。
根据本发明的具体实施方式，本发明还提供一种鉴定番茄雄性不育性状的方法，包括以下步骤：
1)提取待测番茄的基因组DNA。采用常规的CTAB法提取基因组DNA。
2)MS15C的PCR扩增，以待检测的番茄基因组DNA为模板，利用MS15C的特异性引物进行PCR扩增。
3)MS15C的PCR扩增产物酶切。10μl PCR产物，0.2μl NdeI(NEB)限制性内切酶，1.5μl NEB cutsmart缓冲液，3.3μl ddH2O；37℃4h。
4)MS15C的酶切产物电泳检测。酶切产物采用琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶浓度为3％。含有番茄雄性不育(ms-15)纯合突变位点的植株，分子标记MS15C可以检测到一条91-bp的条带、ms-15位点为正常纯合(野生型)的植株，分子标记MS15C可以检测到一条114-bp的条带、ms-15位点为杂合状态的植株可以同时检测到相应2条条带。
5)MS26D的PCR扩增。以待检测的番茄基因组DNA为模板，利用分子标记MS26D的特异性引物进行PCR扩增。
6)MS26D的PCR扩增产物电泳检测。PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶浓度为1.5％。含有番茄雄性不育(ms-26或ms-47)纯合突变位点的植株，分子标记MS26D可以检测到一条838-bp的条带、ms-26或ms-47位点为正常纯合(野生型)的植株，分子标记MS26D可以检测到一条589-bp的条带、ms-26或ms-47位点为杂合状态的植株可以同时检测到相应2条条带。
本发明可以替代传统的通过选择雄性不育植株以确保育种材料含有番茄雄性不育ms-15、ms-26或ms-47突变位点的方法。通过分子标记在幼苗阶段检测育种材料是否含有番茄雄性不育ms-15、ms-26或ms-47突变等位基因，可以缩短育种周期、提高育种效率。
附图说明
图1为番茄雄性不育突变体ms-26的花朵形态、花粉数量、自交与杂交坐果情况示意图。其中，a、d、g分别为雄性不育突变体ms-26(2-327S)的花朵形态、花粉数量、自交与杂交坐果情况；b、e、h分别为雄性可育株2-327F的花朵形态、花粉数量、自交坐果情况；c、f分别为雄性可育株LA1589的花朵形态、花粉数量。a、b、c中的白线代表1cm，d、e、f中的黑线代表100μm，g、h中的白线代表20cm，g、h中的红箭头代表自交坐果、蓝箭头代表杂交坐果。
图2为番茄雄性不育MS-26基因的精细定位示意图，其中，a为初步定位结果；b为精细定位结果；c为MS-26基因精细定位区间的候选基因编码情况。
图3为番茄雄性不育ms-15、ms-26或ms-47等位突变中MS-26候选基因的序列多态性示意图。
图4为分子标记MS15C和MS26D的电泳图片，其中，a为分子标记MS26D检测LA1589、2-327S(含ms-26位点)、2-327F及F2群体部分植株的电泳图片，b为分子标记MS26D检测番茄雄性不育突变体2-193S(ms-15)、2-327S(ms-26)、2-837S(ms-47)及常用番茄材料(正常型)的电泳图片，c为分子标记MS15C检测LA1589、2-193S(ms-15)、2-193F及F2群体部分植株的电泳图片，d为分子标记MS15C检测番茄雄性不育突变体2-193S(ms-15)、2-327S(ms-26)、2-837S(ms-47)及常用番茄材料(正常型)的电泳图片。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步阐明说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指出，实施方式均按照常规实验条件，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1与番茄雄性不育等位突变位点ms-15、ms-26和ms-47共分离的SNPs及InDel的确定
植物材料
番茄雄性不育突变体材料2-193(ms-15)、2-327(ms-26)和2-837(ms-47)，野生醋栗番茄LA1589及普通栽培番茄Monkey Marker的种子均来自TGRC(Tomato GeneticResource Center)。番茄雄性不育突变体材料2-193(ms-15)、2-327(ms-26)和2-837(ms-47)为混合种子，种植后表现为可育株及其自交后代中的可育株，分别命名为2-193F、2-327F和2-837F，不育株则分别命名为2-193S(ms-15)、2-327S(ms-26)和2-837S(ms-47)。2-327S(ms-26)与野生醋栗番茄LA1589杂交获得F1，F1单株自交繁殖成F2代分离群体。不育株2-327S(ms-26)自交或与可育株2-327F、野生醋栗番茄LA1589杂交，观测坐果情况。
花器官形态学观察
待番茄植株第二穗花序开花时，进行花器官的形态学观察。雄性不育突变体2-327S(ms-26)与正常植株2-327F相比，其花朵略小、花药筒开裂呈畸形状、花药筒颜色略淡，柱头完全外露。野生醋栗番茄LA1589的花朵柱头虽然外露，但是花药筒正常(图1)。
花粉检测
待番茄植株第二穗花序开花时，分别从不育株2-327S(ms-26)、可育株2-327F和野生醋栗番茄LA1589取当天盛开花的花药，放入2.0mL离心管中。然后震荡使花粉散出，加入1％醋酸洋红(acetocarmine)250μl着色2分钟，随后振荡混匀，取一滴着色液于洁净载玻片上，盖上盖玻片，制成临时玻片，显微镜检观察并保存图片。可育株2-327F和野生醋栗番茄LA1589表现为花粉较多、花粉粒饱满、活力正常；而不育株2-327S(ms-26)未检出花粉(图1)。
自交坐果检测
当植株开花后振荡授粉，调查坐果情况。可育株2-327F和野生醋栗番茄LA1589均能正常自交坐果，不育株2-327S(ms-26)不能自交坐果(图2)，该结果说明不育株2-327S(ms-26)完全不育。
杂交坐果检测
以不育株2-327S(ms-26)为母本，分别取可育株2-327F和野生醋栗番茄LA1589的花粉授粉。杂交后坐果正常(图2)，果实可产生正常数量的种子。
基因组DNA提取
分单株取子叶或幼嫩叶片，采用常规的CTAB法提取基因组DNA。
分子标记引物设计
依据番茄国际基因组计划测序的番茄品种Heinz1706和醋栗番茄LA1589之间的序列差异，开发分子标记。根据ms-15位点遗传定位范围，有间隔的将Heinz1706(番茄参考基因组测序材料，普通栽培番茄)与LA1589进行序列比对，找出所含InDel的位置及其侧翼序列，并设计引物。
PCR扩增与电泳检测
(1)PCR体系(10μl)：PCR体系(10μl)：50-100ng/μl DNA模板1μl，10×PCR反应缓冲液(含Mg离子)1μl，2.5mMd NTPs 1μl，10μM引物对各0.2μl，2.5U/μl Taq DNA聚合酶0.2μl，ddH2O 6.4μl。(2)PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。(3)采用3％琼脂糖凝胶进行电泳检测。
亲本分子标记多态性筛选
所设计引物分别扩增不育株2-327S(ms-26)、醋栗番茄LA1589及其F1的基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳检测8个具有多态性的InDel分子标记。
雄性不育突变体ms-26的遗传分析
雄性不育突变体2-327S(ms-26)与野生醋栗番茄LA1589杂交，所得F1代植株全部表现为可育。F2群体864株中，648可育、156不育。可育株与不育株的分离比例接近3:1，卡平方检验为2.22(χ2 0.05＝3.84)。上述结果表明了ms-26雄性不育性状是由一个细胞核单基因隐性突变控制。
MS-26基因的初步定位
根据1987年的番茄经典遗传图谱，番茄雄性不育ms-26的等位突变位点ms-15位于are和d两个位点之间。ARE和D基因已经被克隆分别位于SL2.50ch02:47,121,965和SL2.50ch02:51,046,998附近。因此在这两个标记之间开发了11对引物，从中筛选了4对有多态性的分子标记HP679、HP451、CP39和HP689。利用2015年的F2群体中的142株不育株进行初步定位分析，最终将雄性不育基因MS-26基因定位在分子标记HP679到HP451之间，约610-kb的区间内(图2)。
MS-26基因的精细定位
根据番茄雄性不育基因MS-26初步定位结果，我们在定位区间内又开发了4对有多态性的分子标记用于精细定位工作(表3.1)。精细定位群体使用2015年的864株F2群体和2016年的1916株F2群体总共2780株。通过交换单株的筛选及表型调查的结果，我们最终将番茄雄性不育基因MS-26精细定位在分子标记CP81和HP1543之间，约45-kb的区间内(图2)。
ms-26及其等位位点ms-15和ms-47中的SNPs及InDel分析
根据番茄全基因组功能注释ITAG2.40版本，精细定位的45Kb区间内编码四个基因(图2)。其中第三个基因Solyc02g084630编码一个MADS-box转录因子，与番茄雄蕊发育相关，该基因突变会引起雄蕊发育异常。因此，Solyc02g084630为番茄雄性不育基因MS-26的候选基因。
对Solyc02g084630基因及其侧翼序列进行测序，发现雄性不育突变体2-327S的ms-26位点中存在一个12.7-kb的缺失，缺失区段的物理位置为SL2.50ch02:47,714,277-47,726,954。该缺失造成Solyc02g084630基因的启动子和前5个外显子丢失，从而导致该基因功能丧失。2-837S(ms-47)中存在与雄性不育突变体2-327S(ms-26)相同的缺失区段。在2-193S(ms-15)中，Solyc02g084630基因外显子有一个由C突变为A的SNP，物理位置为SL2.50ch02:47,716,375。该SNP导致了所预测的Solyc02g084630蛋白质序列中的一个色氨酸突变为甘氨酸(图3)。
实施例2分子标记MS26D和MS15C的开发与验证
分子标记MS15C和MS26D的引物设计
根据上述InDel和SNPs的序列及其侧翼序列，设计了2组引物：
1)MS15C
正向引物MS15C-F为：5-ACCTTTCGTTCACGAATCTCAG-3，
反向引物MS15C-R为：5-GTCTGTTGATAGGCAGAGCATA-3。
2)MS26D
正向引物MS26D-F为：5-TAGAAGAACCCATTGCACTTTGT-3，
反向引物MS26D-R1为：5-CAGAACCTCTCCAACATCATAATC-3，
反向引物MS26D-R2为：5-TAATTACCGCTAATGTAACGACC-3。
分子标记MS15C和MS26D的多态性检测
PCR扩增
MS15C和MS26D分子标记多态性检测及群体验证的DNA模板为：2-193(ms-15)雄性不育株和正常植株，2-327(ms-26)雄性不育株和正常植株，2-837(ms-47)雄性不育株和正常植株；野生型亲本醋栗番茄LA1589；2-193雄性不育株与LA1589组配的F1，2-327雄性不育株与LA1589组配的F1；樱桃番茄Yellow Pear和LA1221；栽培番茄Heinz1706、Ailsa Craig、T909、Rio Grand、Howard German、Monkey Marker、TS400、1052、M82和zhongshu NO.4。
RCR反应体系及反应程序
MS26D(1)PCR体系(10μl)：50-100ng/μl DNA模板1μl，10×PCR反应缓冲液(含Mg离子)1μl，2.5Mm dNTPs 1μl，10μM引物对各0.2μl，2.5U/μl Taq DNA聚合酶0.2μl，ddH2O 6.2μl。(2)PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸5min。
MS15C(1)PCR体系(10μl)：PCR体系(10μl)：50-100ng/μl DNA模板1μl，10×PCR反应缓冲液(含Mg离子)1μl，2.5mM dNTPs 1μl，10μM引物对各0.2μl，2.5U/μl Taq DNA聚合酶0.2μl，ddH2O 6.4μl。(2)PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。
PCR扩增产物的酶切
MS15C的PCR反应产物用0.2μl限制性内切酶NdeI，1.5μl cutsmart缓冲液，3.3μlddH2O，37℃酶切4h。
PCR扩增产物及酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测
当所用的分子标记为MS26D时，琼脂糖凝胶浓度为1.5％。2-327S(ms-26)和2-837S(ms-47)可以检测到一条589-bp的条带，野生醋栗番茄LA1589检测到一条838-bp的条带，ms-26位点为杂合状态的F1单株可以同时检测到上述2条条带(图4)。
当所用的分子标记为MS15C时，琼脂糖凝胶浓度为3％。2-193S(ms-15)可以检测到一条91-bp的条带，野生醋栗番茄LA1589检测到一条114-bp的条带，ms-15位点为杂合状态的F1单株可以同时检测到上述2条条带(图4)。
分子标记MS15C和MS26D的F2群体验证
分别用分子标记MS15C和MS26D对F2群体植株进行分子检测。发现MS15C和MS26D分别与ms-15和ms-26共分离(图4)。
分子标记MS15C和MS26D的广适性验证
利用分子标记MS15C和MS26D分别对番茄雄性不育突变体2-193S(ms-15)、2-327S(ms-26)、2-837S(ms-47)和一些常用的育性正常的番茄进行分子检测。发现分子标记MS15C和MS26D可以成功地区分含突变位点ms-15、ms-26、ms-47的番茄雄性不育突变体和育性正常番茄材料(图4)。上述结果说明了分子标记MS15C和MS26D可以用于分子标记辅助育种。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但是对于本领域技术人员而言，在本发明基础上，对之作一些修改或改进是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所
<120> 与番茄雄性不育突变位点ms-15、ms-26、ms-47相关的分子标记和应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acctttcgtt cacgaatctc ag 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtctgttgat aggcagagca ta 22
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tagaagaacc cattgcactt tgt 23
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cagaacctct ccaacatcat aatc 24
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
taattaccgc taatgtaacg acc 23

Claims (7)

1.与番茄雄性不育突变位点ms-15共分离的分子标记MS15C，其特征在于，该分子标记的检测物理位置为番茄2号染色体上第47,716,375碱基的SNP，该碱基为C的番茄可育、该碱基为为A的番茄则雄性不育。
2.与番茄雄性不育突变位点ms-15共分离的分子标记MS15C的特异性引物对，其特征在于，所述引物对包括以下引物，
正向引物MS15C-F为：5-ACCTTTCGTTCACGAATCTCAG-3，
反向引物MS15C-R为：5-GTCTGTTGATAGGCAGAGCATA-3。
3.一种鉴定番茄雄性不育性状的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
以权利要求2所述的与番茄雄性不育突变位点ms-15共分离的分子标记MS15C的特异性引物对进行PCR扩增；
酶切PCR产物；
电泳分离，含有番茄雄性不育ms-15纯合突变位点的植株检测到一条91-bp的条带；纯合正常植株检测到一条114-bp的条带；杂合植株可以同时检测到上述2条条带。
4.与番茄雄性不育突变位点ms-26或ms-47共分离的分子标记MS26D，其特征在于，所述分子标记的检测物理位置为番茄2号染色体上从第47,714,277碱基到47,726,954碱基的片段缺失。
5.与番茄雄性不育突变位点ms-26或ms-47共分离的分子标记MS26D的特异性引物对，其特征在于，包括以下引物
正向引物MS26D-F为：5-TAGAAGAACCCATTGCACTTTGT-3，
反向引物MS26D-R1为：5-CAGAACCTCTCCAACATCATAATC-3，
反向引物MS26D-R2为：5-TAATTACCGCTAATGTAACGACC-3。
6.一种鉴定番茄雄性不育性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：
以权利要求5所述的与番茄雄性不育突变位点ms-15共分离的分子标记MS15C的特异性引物对进行PCR扩增；
酶切PCR产物；
PCR扩增产物电泳分离后，含有番茄雄性不育ms-26或ms-47纯合突变位点的植株检测到一条589-bp的条带；纯合正常植株检测到一条838-bp的条带；杂合植株可以同时检测到上述2条条带。
7.权利要求1所述的与番茄雄性不育突变位点ms-15共分离的分子标记MS15C在番茄种质资源鉴定中的应用。
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