CN113897455A - 与番茄雄性不育突变位点ms-24及其等位突变位点共分离的分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于农业生物技术工程和蔬菜遗传育种领域，具体涉及到与番茄雄性不育突变位点ms‑24及其等位突变位点ms‑10和ms‑36共分离的分子标记及其应用。所述的分子标记为可以检测番茄雄性不育突变位点ms‑10、ms‑24和ms‑36中插入片段的共显性分子标记MS24I。本发明可以替代传统的通过在开花期选择雄性不育植株以确保番茄育种材料含有雄性不育突变位点ms‑10、ms‑24或ms‑36的方法。利用本发明的分子标记可以在苗期辅助选择含有ms‑10、ms‑24或ms‑36突变位点的纯合植株和杂合植株，从而缩短育种周期、提高育种效率。
Description
技术领域
本发明属于农业生物技术工程和蔬菜遗传育种领域，具体涉及与番茄雄性不育突变位点ms-24及其等位突变位点共分离的分子标记及其应用。
背景技术
番茄是中国乃至世界上最重要的蔬菜之一。番茄的杂种优势表现比较明显，目前种植的品种多为杂交种。然而，目前番茄杂交种制种多采用人工去雄、授粉，比较费时、费工，制种成本高；而且可能因为去雄不及时或不彻底，影响杂交种纯度。
植物雄性不育广泛存在于开花植物中。利用雄性不育系制种可以简化程序、节省人工、提高纯度。目前，利用番茄雄性不育系制种，杂交种种子生产量可达到3000kg/年。所用的番茄雄性不育系有ms-10(male sterile-10)、ms-15、ms-26、ms-32、ms-35、ms-36、ms-47、ps(positional sterility)、ps-2等，其中ms-10、ms-35和ms-36为等位突变，ms-15、ms-26和ms-47为等位突变。MS-10和PS-2基因已经被图位克隆。MS-10基因编码一个bHLH转录因子。在ms-35突变体中，MS-10基因的启动子中存在一个约400bp插入片段(插入位点的物理位置为：SL4.0ch02:42224329)，从而明显降低了该基因的转录表达。然而，其等位突变体ms-10和ms-36中MS-10基因的序列变异还不清楚。PS-2基因编码一个多聚半乳糖醛酸酶。ps-2突变体中，该基因存在一个SNP，使该基因转录本剪辑发生变化，从而使该基因失去正常功能。ms-15、ms-26、ms-47和ms-32已经被精细定位。在ms-15位点中，候选基因Solyc02g084630(TM6)的编码区存在一个单碱基核酸多态，造成一个氨基酸变化(色氨酸突变为甘氨酸)。在ms-26和ms-47位点中，存在一个约13.2-kb的缺失，缺失区段的物理位置为SL4.0ch02:45728866-45742139。该缺失造成TM6基因的启动子和前5个外显子丢失，从而导致该基因功能丧失。在ms-32位点中，候选基因Solyc01g081100(编码一个bHLH转录因子)的编码区有一个G到A的SNP。这个SNP与相邻的两个碱基形成一个终止密码子TAG，使蛋白质翻译提前终止。
番茄雄性不育突变体ms-24几乎100％不育，雄蕊略小于正常植株，柱头外露率近100％，可以不需要人工去雄而直接授粉，授粉后坐果正常，因此可以用于番茄杂交种制种。但是，ms-24为隐性突变。如果通过表型鉴定以确保育种材料中含有ms-24位点，该育种材料必须含有纯合的ms-24位点，并且需等到开花期才能进行表型鉴定。这样在转育ms-24位点时，除了几轮回交过程，还需要几轮自交过程。从而导致育种周期长、效率低。如果能开发与ms-24位点共分离的共显性分子标记，利用这些分子标记可以在番茄幼苗期进行分子检测，从可育株中鉴定出含ms-24位点的杂合株，从而省去转育中的几轮自交过程；另外在制种时，可以在定植前筛选出ms-24位点的纯合突变体，从而减少定植株数、降低种植成本。
发明内容
本发明的目的是提供与番茄雄性不育突变位点ms-10、ms-24或ms-36共分离的分子标记MS24I。
本发明的再一目的是提供用于鉴定鉴定番茄雄性不育突变位点ms-10、ms-24和ms-36的特异性引物对。
本发明的再一目的是提供鉴定番茄雄性不育突变位点ms-10、ms-24和ms-36的方法。
本发明的再一目的是提供与番茄雄性不育突变位点ms-10、ms-24或ms-36共分离的分子标记MS24I的应用。
为了实现本发明目的，根据本发明的具体实施方式，首先通过精细定位将番茄雄性不育突变位点ms-24定位到约149-kb范围内。该区间内编码22个预测基因。其中Solyc02g079810基因是文献报道参与番茄雄蕊发育调控的MS-10基因。等位测试表明ms-24与ms-10为等位突变体。进一步的测序表明，雄性不育突变体ms-24的MS-10基因第一个内含子中插入一个约4.9-kb的转座子，插入的物理位置为SL4.0ch02:42223991。随后对雄性不育突变体ms-10和ms-36中的MS-10基因进行了测序，发现ms-10与ms-24一样，在MS-10基因中相同的位置插入了一个序列完全相同的转座子；而ms-36中MS-10基因的第二个外显子在物理位置为SL4.0ch02:42223840处也插入了一个序列几乎完全相同(相似性99.98％)的转座子。
因此本发明的与番茄雄性不育突变位点ms-10、ms-24或ms-36共分离的分子标记MS24I可检测ms-10或ms-24位点中物理位置为番茄2号染色体上第42223991碱基(SL4.0版本)以及ms-36位点中物理位置为番茄2号染色体上第42223840碱基(SL4.0版本)旁边的插入片段。不含上述插入片段番茄植株可育，含上述插入片段的番茄纯合植株则雄性不育。
根据本发明的与番茄雄性不育突变位点ms-10、ms-24或ms-36共分离的分子标记MS24I，该分子标记MS24I的特异性引物序列如下：
正向引物MS24I-F为：5-TTCCCCAGTACCCCATTTG-3，
正向引物MS24I-F1为：5-GCCGACGGTATACAATGTTG-3。
反向引物MS24I-R为：5-ACCTACCTCTATGCCCCA-3。
含ms-10或ms-24位点的纯合番茄植株扩增片段长度为548-bp，育性正常纯合番茄植株扩增片段长度为475-bp；含ms-36位点的纯合番茄植株扩增片段长度为396-bp，育性正常纯合番茄植株扩增片段长度为475-bp。
本发明还提供一种鉴定番茄雄性不育性状的方法，包括以下步骤：
1)提取待测番茄的基因组DNA；
2)以待检测的番茄基因组DNA为模板，利用MS24I的特异性引物进行PCR扩增。
3)MS24I的PCR扩增产物电泳检测，其中，含有番茄雄性不育突变位点ms-10或ms-24的纯合植株检测到一条548-bp的条带；育性纯合正常植株检测到一条475-bp的条带；杂合植株可以同时检测到上述2条条带，含有番茄雄性不育突变位点ms-36的纯合植株检测到一条396-bp的条带；育性纯合正常植株检测到一条475-bp的条带；杂合植株可以同时检测到上述2条条带。
本发明可以替代传统的通过选择雄性不育植株以确保育种材料含有番茄雄性不育突变位点ms-10、ms-24或ms-36的方法。通过分子标记在幼苗阶段检测育种材料是否含有番茄雄性不育ms-10、ms-24或ms-36等位突变，可以缩短育种周期、提高育种效率。
附图说明
图1显示番茄雄性不育突变体ms-24的花朵形态、花粉数量、花器官长度，其中，a、c分别为雄性可育株WT-24的花朵形态、花粉数量；b、d分别为雄性不育突变体ms-24的花朵形态、花粉数量；e为花器官长度。a、b中的白线代表1cm，c、d中的黑线代表100μm；
图2显示番茄雄性不育突变体ms-24的自交和杂交坐果情况示，其中，a为雄性可育株WT-24的自交坐果情况；b、c分别为雄性不育突变体ms-24的自交、杂交坐果情况，图中的白线代表20cm；白箭头代表自交坐果，蓝箭头代表杂交坐果；
图3显示番茄雄性不育MS-24基因的精细定位，其中，a为初步定位结果；b为精细定位结果；c为MS-24基因精细定位区间的基因编码情况；d为候选基因MS-10(Solyc02g079810)的外显子/内含子及序列变异示意图；
图4显示番茄雄性不育等位突变ms-10、ms-24或ms-36中MS-10基因的序列多态性示及分子标记MS24I的电泳图片，其中，a为番茄雄性不育等位突变ms-10、ms-24或ms-36中MS-10基因的序列多态性示意图；b为分子标记MS24I检测LA1589、ms-24、WT-24及F2群体部分植株的电泳图片，F代表可育株，S代表不育株；c为分子标记MS24I检测番茄雄性不育突变体ms-10、ms-24、ms-36及常用番茄材料(育性正常)的电泳图片。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步阐明说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指出，实施方式均按照常规实验条件，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1与番茄雄性不育等位突变位点ms-10、ms-24和ms-36共分离的插入片段的确定
植物材料
番茄雄性不育突变体材料2-277(ms-24)、2-635(ms-36)和LA3132(ms-10)，野生醋栗番茄LA1589及普通栽培番茄Heinz1706的种子均来自美国番茄遗传资源中心(TomatoGenetic Resource Center，TGRC)。番茄雄性不育突变体材料2-277(ms-24)、2-635(ms-36)和LA3132(ms-10)为混合种子，种植后的纯合可育株分别命名为WT-24、WT-36和WT-10，杂合株分别命名为H-24、H-36和H-10，不育株则分别命名为ms-24、ms-36和ms-10。ms-24与LA1589杂交获得F1，F1单株自交繁殖成F2代分离群体。番茄雄性不育突变体ms-24自交或与Heinz1706杂交，观测坐果情况。所有材料种植于中国农业科学院蔬菜花卉研究所所内基地或顺义基地，常规水肥管理。
花器官形态学观察
待番茄植株第二穗花序开花时，进行花器官的形态学观察。如图1所示，雄性不育突变体ms-24与正常植株WT-24相比，其花朵略小、花药筒缩短且颜色略淡，柱头完全外露。
花粉检测
待番茄植株第二穗花序开花时，分别从WT-24和雄性不育突变体ms-24取当天盛开花的花药，放入2.0ml离心管中。然后震荡使花粉散出，加入1％醋酸洋红(acetocarmine)250μl着色2分钟，随后振荡混匀，取一滴着色液于洁净载玻片上，盖上盖玻片，制成临时玻片，显微镜检观察并保存图片。如图1所示，正常植株WT-24表现为花粉较多、花粉粒饱满、活力正常；而雄性不育突变体ms-24未检出花粉。
自交坐果检测
当植株开花后振荡授粉，调查坐果情况。如图2所示，WT-24均能正常自交坐果，雄性不育突变体ms-24不能自交坐果。该结果说明突变体ms-24完全不育。
杂交坐果检测
雄性不育突变体ms-24为母本，取Heinz1706的花粉授粉。如图2所示，杂交后坐果正常，果实可产生正常数量的种子。
基因组DNA提取
分单株取子叶或幼嫩叶片，采用常规的CTAB法提取基因组DNA。
分子标记引物设计
依据番茄国际基因组计划测序的番茄品种Heinz1706和醋栗番茄LA1589之间的序列差异，开发分子标记。根据ms-24位点遗传定位范围，有间隔的将Heinz1706(番茄参考基因组测序材料，普通栽培番茄)与LA1589进行序列比对，找出所含InDel的位置及其侧翼序列并设计引物。
PCR扩增与电泳检测
(1)PCR体系(10μl)：50-100ng/μl DNA模板1μl，10×PCR反应缓冲液(含Mg离子)1μl，2.5mMd NTPs 1μl，10μM引物对各0.2μl，2.5U/μl Taq DNA聚合酶0.2μl，ddH2O 6.2μl。(2)PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸5min。(3)采用3％琼脂糖凝胶进行电泳检测。
亲本分子标记多态性筛选
所设计引物分别扩增ms-24、LA1589及其F1的基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳检测到13个具有多态性的InDel分子标记(表1)。
表1分子标记引物信息
雄性不育突变体ms-24的遗传分析
雄性不育突变体ms-24与野生醋栗番茄LA1589杂交，所得F1代植株全部表现为可育。F2群体738株中，563株可育、175株不育。可育株与不育株的分离比例接近3:1，卡平方检验为0.65(χ2 0.05＝3.84)。上述结果表明了ms-24雄性不育性状是由一个细胞核单基因隐性突变控制。
MS-24基因的初步定位
利用雄性不育突变体ms-24与LA1589杂交后自交所得的F2代分离群体中的46株不育株，进行初步定位分析。如图3所示，最终将雄性不育基因MS-24定位在分子标记W2J13到HP2503之间，约540-kb的区间内。
MS-24基因的精细定位
根据番茄雄性不育基因MS-24初步定位结果，在定位区间内开发了6个有多态性的分子标记用于精细定位工作。精细定位群体使用F2群体所有的738个单株。结合交换单株的基因型和表型结果，最终将番茄雄性不育基因MS-24精细定位在分子标记HP629和HP477之间，约149-kb的区间内(图3)。
ms-24及其等位位点ms-10和ms-36中的转座子插入分析
根据番茄全基因组功能注释ITAG4.0版本，精细定位的149-kb区间内编码22个基因(图3)。其中第7个基因Solyc02g079810是文献报道参与番茄雄蕊发育调控的MS-10基因。等位测试表明ms-24与ms-10为等位突变体。
对雄性不育突变体ms-24中的MS-10基因及其侧翼序列进行测序，发现该基因中存在一个约4.9-kb的转座子插入，插入的物理位置为SL4.0ch02:42223991。该插入造成MS-10基因不能正常转录表达。雄性不育突变体ms-10与ms-24相同，在相同的位置插入了一个序列相同的转座子。在雄性不育突变体ms-36中，MS-10基因在物理位置SL4.0ch02:42223840处也插入了一个序列几乎完全相同(相似性99.98％)的转座子。
实施例2分子标记MS24I的开发与验证
分子标记MS24I的引物设计
根据上述转座子序列及其侧翼序列，设计了1套引物：
正向引物MS24I-F为：5-TTCCCCAGTACCCCATTTG-3，
正向引物MS24I-F1为：5-GCCGACGGTATACAATGTTG-3。
反向引物MS24I-R为：5-ACCTACCTCTATGCCCCA-3。
分子标记MS24I的多态性检测
PCR扩增
MS24I分子标记多态性检测及群体验证的DNA模板为：雄性不育株ms-10、育性正常纯合植株WT-10和杂合株H-10；雄性不育株ms-24、育性正常纯合植株WT-24和杂合株H-24；雄性不育株ms-36、育性正常纯合植株WT-36和杂合株H-36；野生型亲本醋栗番茄LA1589；ms-24雄性不育株与LA1589组配的F1，F1自交后产生的F2植株；野生番茄LA1028；樱桃番茄Yellow Pear；栽培番茄Ailsa Craig、Indigo Rose、Heinz1706、M82、Monkey Marker、Howard German、Zhongshu NO.4和TS400。
RCR反应体系及反应程序
(1)PCR体系(10μl)：50-100ng/μl DNA模板1μl，10×PCR反应缓冲液(含Mg离子)1μl，2.5mM dNTPs 1μl，10μM引物对各0.2μl，2.5U/μl Taq DNA聚合酶0.2μl，ddH2O 6.2μl。(2)PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸5min。
PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测
琼脂糖凝胶浓度为3.0％。雄性不育株ms-10和ms-24可以检测到一条548-bp的条带，WT-10、WT-24和野生醋栗番茄LA1589可以检测到一条475-bp的条带，ms-10和ms-24位点为杂合状态的植株H-10和H-24分别可以同时检测到上述2条条带(图4)。雄性不育株ms-36可以检测到一条396-bp的条带，WT-36可以检测到一条475-bp的条带，杂合植株H-36可以同时检测到上述2条条带(图4)。
分子标记MS24I的F2群体验证
用分子标记MS24I对F2群体植株进行分子检测。发现MS24I与ms-24位点共分离(图4)。
分子标记MS24I的广适性验证
利用分子标记MS24I分别对番茄雄性不育突变体ms-10、ms-24、ms-36和一些常用的育性正常的番茄材料进行分子检测。发现分子标记MS24I可以成功地区分含突变位点ms-10、ms-24、ms-36的番茄雄性不育突变体和育性正常番茄材料(图4)。上述结果说明了分子标记MS24I可以用于分子标记辅助育种。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但是对于本领域技术人员而言，在本发明基础上，对之作一些修改或改进是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所
<120> 与番茄雄性不育突变位点ms-24及其等位突变位点共分离的分子标记及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttccccagta ccccatttg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gccgacggta tacaatgttg 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acctacctct atgcccca 18
Claims (5)
1.与番茄雄性不育突变位点ms-10、ms-24或ms-36共分离的分子标记MS24I，其特征在于，所述分子标记的特异性引物对如下：
正向引物MS24I-F为：5’-TTCCCCAGTACCCCATTTG-3’，
正向引物MS24I-F1为：5’-GCCGACGGTATACAATGTTG-3’。
反向引物MS24I-R为：5’-ACCTACCTCTATGCCCCA-3’。
2.用于鉴定鉴定番茄雄性不育突变位点ms-10、ms-24和ms-36的特异性引物对，其特征在于，所述特异性引物对的序列如下：
正向引物MS24I-F为：5’-TTCCCCAGTACCCCATTTG-3’，
正向引物MS24I-F1为：5’-GCCGACGGTATACAATGTTG-3’。
反向引物MS24I-R为：5’-ACCTACCTCTATGCCCCA-3’。
3.一种鉴定番茄雄性不育突变位点ms-10、ms-24和ms-36的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)提取待测番茄植株的基因组DNA；
2)PCR扩增，以待检测的番茄基因组DNA为模板，利用权利要求2所述的用于鉴定鉴定番茄雄性不育突变位点ms-10、ms-24和ms-36的特异性引物对进行PCR扩增；
3)PCR扩增产物进行电泳分离，其中，
含有番茄雄性不育突变位点ms-10或ms-24的纯合植株的扩增产物为一条548-bp的条带；纯合育性正常植株的扩增产物为一条475-bp的条带；杂合植株的扩增产物为一条548-bp的条带和一条475-bp的条带；
含有番茄雄性不育突变位点ms-36的纯合植株的扩增产物为一条396-bp的条带；纯合育性正常植株的扩增产物为一条475-bp的条带；杂合植株的扩增产物为一条396-bp的条带和一条475-bp的条带。
4.权利要求1所述的与番茄雄性不育突变位点ms-10、ms-24或ms-36共分离的分子标记MS24I在番茄种质资源鉴定中的应用。
5.权利要求1所述的与番茄雄性不育突变位点ms-10、ms-24或ms-36共分离的分子标记MS24I在番茄分子标记辅助育种的应用。
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