CN110241113B - 甘蓝型油菜闭花授粉位点的分子标记及其应用 - Google Patents

甘蓝型油菜闭花授粉位点的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及植物育种领域，具体涉及甘蓝型油菜闭花授粉位点的分子标记及其应用，本发明在国际上首次鉴定了位于甘蓝型油菜C03染色体7406473bp‑7797950bp区域内控制甘蓝型油菜闭花授粉位点，同时发现与闭花授粉位点紧密连锁的共显性/显性分子标记BnC03V1866、BnC03V2026、BnC03V2042和BnC03V2394，本发明还公开了分子标记BnC03V1866、BnC03V2026、BnC03V2042和BnC03V2394的引物对，这些分子标记在F2:3群体的表现使其在甘蓝型油菜闭花授粉育种、检测中具有非常重要的价值。

Description

甘蓝型油菜闭花授粉位点的分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及植物育种领域，具体涉及甘蓝型油菜闭花授粉位点的分子标记及其应用。
背景技术
闭花授粉及花器官成熟直接关系农作物的产量，受到研究人员的高度重视；闭花性状形成途径研究也是重要的生物学研究课题。
甘蓝型油菜(Bnssica napus)是重要的油料作物。甘蓝型油菜为常异花授粉作物，改变授粉习性仍然属于该作物遗传育种研究领域的新概念。闭花授粉可帮助实现自动自交，而无需套袋，这对于油菜品种资源保纯、防治转基因扩散、不育系选育、减少科研工作量等方面，能够起到极为有益的作用。
油菜闭花授粉性状的研究目前还比较少。过去的研究中，认为油菜闭花十分性状遗传比较复杂，也发掘了1个控制闭花授粉的的主基因位点，Lu等(2012)报导了油菜闭花授粉突变体P325L研究，发现其在遗传上由单显性(半显性)基因控制。图位克隆得到闭花授粉基因为Bn-CLG1A，编码E3泛素连接酶基因。野生型与突变体在该基因有1个碱基差异，导致突变体获得性闭花授粉。突变基因能够明显减少角质生物合成，影响萼片和花瓣细胞伸长，形成闭花授粉性状。
甘蓝型油菜闭花授粉性状紧密连锁的分子标记的开发有重要的意义。首先，为发现的遗传调控新机制、探索花器官成熟的新机制提供基础。其次，为高效育种提供技术支持，开发油菜闭花授粉新位点紧密连锁分子标记，可以在油菜苗期筛选，不用等到花期在进行观察鉴定，提高选择效率。最后，共显性标记可以为区别纯合与杂合闭花授粉单株提供技术支持，提高分离世代选择的准确性。因此，油菜闭花授粉位点的紧密连锁的分子标记开发和应用是油菜闭花授粉应用于育种的关键技术。
本发明发现了一个控制甘蓝型油菜闭花授粉性状的新位点，并且发展了其紧密连锁的分子标记技术。
发明内容
本发明的目的是提供一个位于甘蓝型油菜C03染色体上的控制油菜闭花授粉性状的新基因位点BnC03CL。
本发明的另一目的是提供了甘蓝型油菜闭花授粉性状新基因位点的分子标记BnC03V1866、BnC03V2026、BnC03V2042和BnC03V2394以及其引物对。
本发明的又一个目的是提供甘蓝型油菜闭花授粉位点的分子标记BnC03V1866、BnC03V2026、BnC03V2042和BnC03V2394或其引物对在检测所述的闭花授粉油菜及选育闭花授粉油菜品种中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：甘蓝型油菜闭花授粉位点BnC03CL，所述BnC03CL位点位于甘蓝型油菜C03染色体上BnaC03:7406473bp-7797950bp，参考基因组序列(甘蓝型油菜C03染色体序列)见NCBI数据库(GenBank:LT220467.1)。甘蓝型油菜闭花授粉位点BnC03CL与四个分子标记紧密连锁，其中紧密连锁标记(即分子标记，以下同)BnC03V1866位于甘蓝型油菜C03染色体上7678699bp-7679007bp；紧密连锁标记BnC03V2026位于甘蓝型油菜C03染色体上7714484bp-7714805bp；紧密连锁标记BnC03V2042位于甘蓝型油菜C03染色体上7716440bp-7716749bp；紧密连锁标记BnC03V2394位于甘蓝型油菜C03染色体上7797197bp-7797508bp。这四个紧密连锁分子标记BnC03V1866、BnC03V2026、BnC03V2042、BnC03V2394的序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4所示。
本发明所述的甘蓝型闭花授粉位点的分子标记BnC03V1866、BnC03V2026、BnC03V2042和BnC03V2394分别对应的引物对，这四个紧密连锁的分子标记的上游引物序列分别为Seq V1866-F(SEQ ID NO.5)、Seq V2026-F(SEQ ID NO.7)、Seq V2042-F(SEQ IDNO.9)和Seq V2394-F(SEQ ID NO.11)，下游引物序列分别为Seq V1866-R(SEQ ID NO.6)、Seq V2026-R(SEQ ID NO.8)、Seq V2042-R(SEQ ID NO.10)和Seq V2394-R(SEQ IDNO.12)。
本发明所述的甘蓝型油菜闭花授粉位点的分子标记BnC03V1866、BnC03V2026、BnC03V2042和BnC03V2394，在含所述的甘蓝型油菜闭花授粉性状位点的甘蓝型油菜品种或种质检测中的应用。
本发明所述的甘蓝型油菜闭花授粉位点的分子标记BnC03V1866、BnC03V2026、BnC03V2042和BnC03V2394在选育闭花授粉油菜品种或种质中的应用。
一种利用本发明所述分子标记或引物对选育闭花授粉油菜品种的方法，优选用所述BnC03V1866、BnC03V2026、BnC03V2042和BnC03V2394引物对扩增油菜基因组DNA，扩增产物在40％聚丙烯酰胺凝胶电泳后，如果获得NIAU7130的扩增片段，则表明存在本发明所述的甘蓝型油菜闭花授粉位点，预测该油菜是闭花授粉油菜。如果获得亲本NJAU135的扩增片段，则表明存在本发明所述的甘蓝型油菜开花授粉位点，预测该油菜是开花授粉油菜。
本发明甘蓝型油菜闭花授粉位点连锁的分子标记是通过下列步骤筛选的：
(1)在甘蓝型油菜品种南农油二号的育种过程中发现一株闭花授粉突变体NJAUCB088，用这个材料连续自交多代，得到纯合闭花授粉系，逐步纯化，获得稳定闭花授粉系纯系NJAU7130；利用NJAU7130与本实验室开花授粉的优异种质资源NJAU135杂交，得到杂种F1，F1自交得到846个F2单株，其中闭花型和开放型单株数分别为617株和238株。卡方测验表明，闭花与开花性状符合3:1的孟德尔分离比例，该杂交组合的回交世代以及F2:3世代呈现出相同的遗传规律，说明闭花遗传上受单显性基因控制。
(2)根据F2:3群体中71个单株的SNP标记数据结果，每一个SNP位点等位基因的基因型读取由基因分型软件Genome Studio v2011.1(Illumina,Inc.)完成，根据每个位点上所有单株的基因型的聚类结果进行基因型的读取。SNP标记的名称由“M”加上分型软件GenomeStudio产生的SNP顺序编号组成。
(3)将71个用于SNP芯片的DNA样品的表型数据与其SNP分型数据一起进行定位分析，控制甘蓝型油菜闭花授粉性状的BnC03CL位点被定位到C03连锁群，定位区间位于7406473bp-7797950bp的区段内；
(4)利用油菜C03染色体7406473bp-7797950bp的SSR信息，设计分子标记；
(5)利用“NJAU135×NJAU7130”产生的F2:3群体，共2608个单株，测定甘蓝型油菜表型，同时鉴定新设计分子标记的遗传带型；
(6)根据F2:3群体表型数据和分子标记数据，发现紧密连锁共显性/显性分子标记BnC03V1866、BnC03V2026、BnC03V2042和BnC03V2394，而且其遗传带型清晰可见。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明在国际上首次鉴定了一个位于甘蓝型油菜C03染色体7406473bp-7797950bp区域内控制甘蓝型油菜闭花授粉位点，同时发现与闭花授粉位点紧密连锁的共显性/显性分子标记BnC03V1866、BnC03V2026、BnC03V2042和BnC03V2394，这些分子标记在F2:3群体的表现使其在甘蓝型油菜闭花授粉育种中具有非常重要的价值。
1)首次鉴定了一个位于甘蓝型油菜C03染色体7406473bp-7797950bp区域内控制甘蓝型油菜闭花授粉位点，同时发现与闭花授粉位点紧密连锁的共显性/显性分子标记BnC03V1866、BnC03V2026、BnC03V2042和BnC03V2394；
2)在F2:3群体中，甘蓝型油菜闭花授粉性状与这四个分子标记呈极显著相关，F2:3单株基因型和表型一致，因此这四个分子标记在今后的闭花授粉油菜辅助选择育种中具有巨大的应用前景；
3)本发明能够在甘蓝型油菜中找到纯合闭花授粉油菜，对闭花授粉株型育种有很大帮助。
附图说明
图1：闭花授粉油菜表型图；左侧为闭花授粉油菜表型图，右侧为开花授粉油菜表型图；
图2：分子标记BnC03V1866对部分单株基因分型，其中泳道1、4、7和8-开花授粉带型；2、3和5-杂合闭花授粉带型；7和9-纯合闭花授粉带型；
图3：分子标记BnC03V2026对部分单株基因分型，其中泳道1、2、4和8-开花授粉带型；3、5、6、7和9-杂合闭花授粉或纯合闭花授粉带型；
图4：分子标记BnC03V2042对部分单株基因分型，其中泳道6和9-开花授粉带型；1、2、3、4和7-杂合闭花授粉带型，5和8-纯合闭花授粉带型；
图5：分子标记BnC03V2394对部分单株基因分型，其中泳道5、6、7和8-开花授粉带型；1、2、3、4和9-杂合闭花授粉或纯合闭花授粉带型。
具体实施方式
下面结合说明书附图对本发明创造作进一步说明。下述实施方法中的实验方法均为常规方法，所涉及实验材料均为常规生化试剂。
实施例1：甘蓝型油菜闭花授粉位点的获得
(1)遗传群体构建
利用两个甘蓝型油菜材料“NJAU7130”与NJAU135进行杂交，得到杂种F1，F1自交得到846个F2单株。选择单株自交法获得F2:3群体。
(2)甘蓝型油菜F2和F2:3群体表型测定
对上述F2和F2:3单株群体中单株进行表型观察以及农艺性状调查。
(3)遗传图谱的构建
选择F2:3群体中的71个单株叶片DNA样品用于SNP标记的数据获取，其中有22株为野生型单株和49株闭花授粉突变型单株。SNP芯片共有52157个位点，但此F2:3群体的DNA样品并不是在所有位点上都有多态性。在去除无效标记(无多态标记以及单个基因型所占比例大于95％)后，剩余14268个具有多态性、可以进行关联分析。
(4)结果与分析
将71个用于SNP芯片的DNA样品的表型数据与其SNP分型数据一起进行定位分析，控制甘蓝型油菜闭花授粉性状的BnC03CL位点被定位到C03连锁群，定位区间位于BnaC03:7406473bp-7797950bp的区段内。
实施例2：甘蓝型油菜闭花授粉位点紧密分子标记的获得
(1)分子标记开发
本研究利用SNP芯片技术将闭花授粉位点定位在油菜C03染色体的7406473bp-7797950bp区段内，下载油菜参考基因组序列，利用SSR hunter 1.3软件查找SSR位点，在其上下游各增加150bp设计引物，SSR标记位点命名为“BnC03V+SSR位点”，采用PrimerPremier 5.0软件在BnaC03:7406473bp-7797950bp区域内设计多个分子标记。
(2)F2:3群体分子标记鉴定
采用CTAB法提取F2：3群体油菜材料叶片的基因组DNA，PCR反应体系(10ul)，其中含有0.5ulDNA模板、上、下游引物(1mmol/L)各0.25ul、5ulMix，和4ulddH2O。PCR反应程序：95℃变性5min；随后进行35个循环的95℃变性30s，Tm值退火30s，72℃延伸30s；再经72℃延伸10min；最后4℃保存。PCR扩增产物用40％聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色。胶片在BIO-RADvisadoc3.0(Bio-RAD，USA)成像系统中扫描分析。
(3)结果与分析
在设计的多个分子标记中，BnC03V1866、BnC03V2026、BnC03V2042和BnC03V2394分子标记与表型一致性达到99％，认为这四个分子标记与甘蓝型油菜闭花授粉位点是紧密连锁。在F2:3群体中这四个紧密连锁分子标记分别有三种带型，BnC03V1866是共显性标记，条带大小分别为224bp，221bp和同时拥有两条带，拥有224bp带型的单株是纯合闭花授粉单株，拥有221bp带型的单株是开花授粉油菜，同时具有224bp与221bp条带的为闭花授粉杂合体；BnC03V2026是显性标记，条带大小分别为223bp和没有条带，拥有223bp带型的单株是纯合闭花授粉单株或闭花授粉杂合体，无带型的单株是开花授粉油菜。BnC03V2042是共显性标记，条带大小分别为135bp，140bp和同时拥有两条带，拥有135bp带型的单株是纯合闭花授粉单株，拥有140bp带型的单株是开花授粉油菜，同时具有135bp与140bp条带的为闭花授粉杂合体；BnC03V2394是显性标记，条带大小分别为179bp和没有条带，拥有179bp带型的单株是纯合闭花授粉单株或闭花授粉杂合体，无带型的单株是开花授粉油菜。这四个紧密连锁的分子标记的上游引物序列分别为Seq V1866-F、Seq V2026-F、Seq V2042-F和SeqV2394-F，下游引物序列分别为Seq V1866-R、Seq V2026-R、Seq V2042-R和Seq V2394-R(图2-5)。
实施例3:紧密连锁分子标记在闭花授粉油菜选择上的应用
(1)双亲本基因组扩增检测
用于验证闭花授粉油菜亲本分别为亲本“NJAU7130”(BnC03V1866等位条带为224bp；BnC03V2026等位条带为223bp；BnC03V2042等位条带为135bp；BnC03V2394等位条带为179bp，)，亲本NJAU135(BnC03V1866等位条带为218bp；BnC03V2026无等位条带；BnC03V2042等位条带为140bp；BnC03V2394无等位条带)。
(2)群体扩增检测及标记分析
用以上两个亲本进行杂交，得到F1代种子种植后长成一个F1代单株，其自交结实收获得F2代种子，后者种植长成一个包含分离性状的F2群体，在其中选择单株，自交得到F2:3分离群体，测定群体单株农艺性状和表型。
采用CTAB法分别提取每份F2单株叶片的基因组DNA。PCR反应体系(10ul)，其中含有0.5ulDNA模板、上、下游引物(1mmol/L)各0.25ul、5ulMix，和4ulddH2O。PCR反应程序：95℃变性5min；随后进行35个循环的95℃变性30s，Tm值退火30s，72℃延伸30s；再经72℃延伸10min；最后4℃保存。PCR扩增产物用40％聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色。胶片在BIO-RADvisadoc3.0(Bio-RAD，USA)成像系统中扫描分析。分析BnC03V1866、BnC03V2026、BnC03V2042和BnC03V2394在亲本条带类型。
(3)结果与分析
在NJAU7130和NJAU135的杂交组合后代F2:3检测中，发现BnC03V1866、BnC03V2026、BnC03V2042和BnC03V2394分子标记与表型一致性达到99％。结果表明了用BnC03V1866、BnC03V2026、BnC03V2042和BnC03V2394分子标记预测油菜高闭花授粉有较好的预测效果(表1)。
表1分子标记与表型一致性统计
Figure BDA0002134758680000061
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 甘蓝型油菜闭花授粉位点的分子标记及其应用
<130> xhx2019071801
<141> 2019-07-18
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 309
<212> DNA
<213> Bnssica napus
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aggcaagcct gaaccaga 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gatcactgag ccaaagac 18
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gaacctggta caattaagaa 20

Claims (5)

1.甘蓝型油菜闭花授粉位点的分子标记，其特征在于，所述分子标记为BnC03V1866，其序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的甘蓝型油菜闭花授粉位点的分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对的上游引物为Seq V1866-F，其序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物为SeqV1866-R，其序列如SEQ ID NO.6所示。
3.权利要求1所述的甘蓝型油菜闭花授粉位点的分子标记的引物对在甘蓝型油菜品种或种质检测中的应用。
4.权利要求1所述的甘蓝型油菜闭花授粉位点的分子标记的引物对在选育闭花授粉油菜品种或种质中的应用。
5.一种选育闭花授粉油菜品种的方法，其特征在于，采用权利要求2所述的引物对扩增油菜基因组DNA，根据得到的扩增片段判断该油菜是闭花授粉油菜或开花授粉油菜；扩增得到224bp条带的为纯合闭花授粉油菜；扩增得到221bp条带的为开花授粉油菜；扩增得到同时具有224bp与221bp条带的为闭花授粉油菜杂合体。
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