CN114410649A - 一种热胁迫下水稻内参基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种热胁迫下水稻内参基因及其应用，涉及分子生物学领域，本发明提供一种热胁迫下水稻内参基因及其应用，以LOC_Os06g23160基因作为内参基因，该LOC_Os06g23160基因的基因序列如SEQ ID No1所示，LOC_Os06g23160基因是高温敏感品种HT13中表达最稳定的基因，而LOC_Os06g23160是一个比常见的内参基因如18S RNA更稳定的新候选基因。

Description

一种热胁迫下水稻内参基因及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种热胁迫下水稻内参基因及其应用。

背景技术

水稻是养活世界绝大多数人口的最重要粮食作物之一，在亚洲广泛种植。其粮食营养价值高，食用价值和经济价值高。水稻产量一直是国内外水稻育种关注的主要问题之一。随着半矮秆基因(sd1)的发现和杂种优势的利用，水稻产量比过去有了很大提高。然而，随着全球人口的不断增加，如何进一步提高水稻产量和品质仍然是水稻育种的主要关注点和目的。

近年来，随着人类活动和工业化的加剧，环境问题日益突出。高温胁迫是影响水稻产量和品质的主要非生物因素之一。热害导致水稻频繁减产，也严重制约了稻米品质。在高温胁迫下，水稻的内部代谢和调控发生了显著变化，各种基因表达上调或下调。为了探索高温下水稻的基因表达，必须有合适的内参基因进行比较。

目前，稳定表达的管家基因如UBQ10和GAPDH通常被选择。然而，管家基因(包括肌动蛋白-1)的表达在特定环境中也会发生变化。某些基因如UBQ10在不同发育阶段的不同组织或细胞类型中的表达稳定性较低。因此，选择能够在高温下稳定表达的内参基因是研究水稻热应激反应分子机制的关键。

发明内容

本发明的目的在于提供一种热胁迫下水稻内参基因及其应用，解决背景所提出的至少一个技术问题。

本发明提供一种热胁迫下水稻内参基因，所述内参基因的基因序列如SEQ ID No1所示。

本发明还提供了上述热胁迫下水稻内参基因在荧光定量PCR检测中的应用。

进一步的，所述内参基因的荧光定量PCR引物的核苷酸序列为：

正向引物序列：ACACGTTACGCTACAAACTCTA；

反向引物序列：GAGATGCTAGGTGACGTGATTA。

本发明还提供了上述热胁迫下水稻内参基因在水稻基因定性检测中的应用。

本发明还提供了上述热胁迫下水稻内参基因在水稻基因定量检测中的应用。

本发明还提供了上述热胁迫下水稻内参基因在筛选水稻耐热基因的应用。

技术效果：

本发明提供一种热胁迫下水稻内参基因及其应用，以LOC_Os06g23160基因作为内参基因，该LOC_Os06g23160基因的基因序列如SEQ ID No 1所示，LOC_Os06g23160基是高温敏感品种HT13中表达最稳定的基因，而LOC_Os06g23160是一个比常见的内参基因如18SRNA更稳定的新候选基因。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例qRT-PCR分析所得各候选基因的CT值；

图2为本发明实施例Genorm计算的M值以及各候选内参基因稳定性排名；

图3为本发明实施例Genorm计算的成对变异V值；

图4为本发明实施例normfinder分析结果及稳定性排序；

图5为本发明实施例ΔCT法分析所得各基因稳定性排序；

图6本发明实施例的LOC_Os06g23160与ACT11在各个时间点相对表达量的变化；

图7不同内参基因下LOC_Os12g44170在各个时间点相对表达量的变化；

图8b-TUB作为内参基因下LOC_Os12g44170的相对表达量变化。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

本发明实施例提供一种热胁迫下水稻内参基因，所述内参基因的基因序列如SEQID No 1所示。

本发明实施例还提供了上述热胁迫下水稻内参基因在荧光定量PCR检测中的应用。

进一步的，所述内参基因的荧光定量PCR引物的核苷酸序列为：

正向引物序列：ACACGTTACGCTACAAACTCTA；

反向引物序列：GAGATGCTAGGTGACGTGATTA。

本发明实施例还提供了上述热胁迫下水稻内参基因在水稻基因定性检测中的应用。

本发明实施例还提供了上述热胁迫下水稻内参基因在水稻基因定量检测中的应用。

本发明实施例还提供了上述热胁迫下水稻内参基因在筛选水稻耐热基因的应用。

本发明实施例使用的水稻材料为耐高温籼稻育种系HT54和高温敏感籼稻育种系HT13。两种类型的水稻在96孔无底培养皿中播种，并在室温下用吉田培养液在发芽后生长两周。然后将三叶期幼苗移入人工气候室(45℃，12小时昼夜循环)进行高温处理。在0小时、12小时、24小时和36小时采集新鲜水稻植株。样品立即在液氮中冷冻，然后在-80℃下储存用于RNA提取。

1、RNA提取与互补DNA合成

在液氮条件下，将样品快速研磨成粉末。按照RNAprep纯植物总RNA提取试剂盒(北京天根)的说明提取总RNA。通过纳米滴管分光光度计测量提取RNA的浓度和纯度，然后按照Takara oligo dT反转录程序的说明合成cDNA。

2、引物设计与实时PCR分析

以LOC_Os06g23160基因为主，选择了另外19个基因作为参照，具体的基因选择如下表1所示，检测了上述20个基因在热胁迫下的表达稳定性。对于每个qRT PCR反应混合物，构建了一个20μl的系统，其中包含1μl cDNA稀释剂、1μl正向引物、1μl反向引物、7μl ddH2O和10μl SYBR(HieffqPCR SYBR Green Master Mix，Yeasen，Shanghai)。PCR反应程序设置为95.0℃，反应2min；95.0℃5s，60.0℃30s，45次循环；95℃5s，65℃5s，95℃5s。使用的PCR仪器为bio-rad CFX connect TM。

表1用于实时PCR分析的20个基因及其引物序列列表

3、基因表达稳定性分析

使用四种广泛使用的算法软件NormFinder、Genorm、BESTKEEP和ΔCT方法评估了两个水稻品种中20个候选内参基因的表达稳定性。根据qRT-PCR结果获得各基因的CT值。数据通过公式2^-(Ct_sample CT_min)进行转换，并导入Genorm和NormaFinder以评估表达稳定性。GeNorm用于计算所有候选基因的平均表达稳定性m值以及一对基因和其他基因的平均成对变异Vn/Vn+1值。根据每个候选基因的m值得出每个基因的稳定性排序，并指出最合适的内参基因数。NormFinder计算一组候选基因的稳定值，并将其从低到高排序，以获得具有最佳表达稳定性的基因。NormaFinder不仅可以比较候选内参基因的表达差异，还可以计算样本组之间的差异，但该程序只能筛选出最合适的内参基因。对于BestKeeper和ΔCT方法，直接使用CT值进行分析。BestKeeper根据CT值计算每个基因的标准偏差(SD)和变异系数(CV)，从而确定内参基因的稳定性。ΔCT规则用于计算每个内参基因CT的平均值±标准偏差(SD)，以确定稳定表达的候选基因。最后，通过RefFinder以确定最佳内参基因。

结果：

候选内参基因的选择和表达谱

一个合适的内参基因应该同时具备两个条件：一是具有合适的表达强度；第二，具有稳定的表达强度。确定给定候选基因是否具有合适的表达强度主要取决于其阈值周期(CT值)。具有适当表达强度的内参基因的CT值通常在15-35之间。用qRT-PCR检测了这20个基因在两个水稻品种中的表达水平。由于无法检测到三个基因(LOC_Os05g46330、LOC_Os04g55510和LOC_Os01g16430)的表达，因此排除了它们，剩下的17个基因用于进一步分析。结果如图1所示，图1框中的横线代表中位数，方框代表第一、三四分位数，黑线代表最大值和最小值。这些内参基因的平均CT值范围为14.43至40.59。其中18SRNA和25SRNA是两个核糖体RNA基因，其平均CT值分别为14.43和14.88，表明这两个基因在这两个水稻品种中有很高的表达水平。三个基因(LOC_Os12g44170、LOC_Os04g34440和LOC_Os01g15850)的CT值超过35，LOC_Os04g34440高达40.59，表现出相当低的表达强度。我们的RNA-seq数据集中剩下的四个候选内参基因的平均CT值与七个管家基因的平均CT值相似，除了UBQ10的平均CT值为26.68，其他的CT值都在29到34之间，表明这些基因具有合适的表达强度，适合进一步分析。

Genorm分析

通过2^-ΔCT方法对每个基因的CT值进行标准化，并通过GeNorm分析这12个基因的表达稳定性。GeNorm计算给定基因的表达稳定性(m值)，并根据m值对它们进行排序，以获得最稳定的基因。m值越小，稳定性越高。通常，m值取1.5作为阈值。如果m值小于1.5，则表明该基因表达相对稳定，可作为候选参数基因。GeNorm用于评估基因表达的稳定性，结果根据m值从高到低排列，如图2所示，图2中的A示意耐高温品种HT54，B示意热敏感品种HT13；

根据图2中的A结果，UBQ5/UBC的m值最低，为0.31，GAPDH以0.45排名第二；b-TUB、GAPDH、UBQ5和UBC是耐热品种HT54的前四个基因。四个基因(LOC_Os04g34440、25S RNA、LOC_Os06g23160和LOC_Os12g44170)的m值均超过1.5，表明其稳定性较低。对于热敏品种HT13，LOC_Os06g23160/18S RNA的最低m值为0.37，b-TUB和eIF-4a的最低m值分别为0.49和0.51。令人惊讶的是，所有17个候选基因的m值均低于1.5，表明它们在HT13中的表达相当稳定。

此外，与使用单个内参基因相比，选择两个或多个内参基因可以大大提高PCR结果的准确性和可靠性。GeNorm通过计算引入新内参基因后标准化因子的成对变异V值(Vn/Vn+1)来确定内参基因的最佳数量。默认阈值为V<0.15。如果Vn/Vn+1<0.15，则最佳参与基因数为n，否则为n+1。

图3为本发明实施例Genorm计算的成对变异V值，其中图3中A示意耐高温品种HT54，图3中B示意热敏感品种HT13；如图3中A所示，V5/6小于0.15，表明最佳参考数量为5。在图3中B所示，V3/4小于0.15，表明只有三个内参基因足以正常化。根据GeNorm分析，LOC_Os06g23160、b-TUB和eIF-4a是最好的。

Normfinder分析

NormFinder还通过计算每个基因的表达稳定性值对每个基因进行排序。稳定性值越低，表达式越稳定。结果如图4所示，其中图4中A示意为耐高温品种HT54。图4中B示意为热敏感品种HT13。图4中A所述，能够知晓b-TUB、UBQ5、UBC和GAPDH是稳定性最好的四个基因。图4中B所示，能够知晓LOC_Os06g23160、18SRNA、b-TUB和UBQ10是四个最稳定的候选基因。NormFinder的结果通常与GeNorm的结果相似。

Bestkeeper分析

通过qRT-PCR可以获得每个候选基因的表达CT值。BestKeeper可以直接分析得到的CT值，通过计算CT得到标准偏差(SD)和变异系数(CV)，从而判断参考品的稳定性。SD越小，表达式越稳定。CV值反映了热应激不同时间点内参基因表达水平的变化程度。CV越小，变化越小。通常，SD<1被用作阈值。如果SD>1，则认为该基因的稳定性较低(Yi等人，2021年)。两个水稻品种17个基因的Bestkeeper分析结果如表2所示。

表2.bestkeeper计算的各候选基因稳定性(SD)排序

根据表2，LOC_Os06g23160,18SRNA,25SRNA是HT54中最稳定的三个基因，其他候选基因的SD值大于1，表明这些基因的稳定性较低。BestKeeper对HT54的分析结果与GeNorm和NormaFinder的分析结果有很大差异，这可能是由于应用了不同的算法所致。在HT13中，LOC_Os06g23160和b-TUB是最稳定的三个候选基因。

LOC_Os12g44170、LOC_Os04g34440和LOC_Os01g15850的SD值均大于1，其稳定性最差。值得注意的是，Bestkeeper在HT13中的分析结果与GeNorm和NormaFinder的分析结果相似。

ΔCT法分析

ΔCT方法通过分析每个候选基因的平均标准偏差对每个基因的稳定性进行排序。平均标准差越小，稳定性越强。如图5所示为ΔCT法分析所得各基因稳定性排序，其中图5A示意为耐高温品种HT54，图5B示意为热敏感品种HT13；如图5中A所示，UBQ5的偏差值最低，表明表达稳定性最高，b-TUB和UBC分别排名第二和第三。在图5中B所示，LOC_OS06G23160、b-TUB和eIF-4a是具有高稳定性的前三个基因。b-TUB和eIF-4a的偏差值相同，LOC_Os06g23160的偏差值最小，为0.98。HT13中ΔCT法的分析结果与上述类似，而HT54中的分析结果与GeNorm和Normafinder的分析结果相差不大，但与BestKeeper的分析结果相差很大。

Reffinder分析综合排名

RefFinder是一种综合稳定性评估方法，它根据上述四种算法的结果为每个候选基因分配适当的权重，并通过计算四种算法稳定值权重的几何平均值进行总体排序，有效避免了单一评估算法的片面性和偶然性(Xie et al.，2012)。稳定性值越小，稳定性越好。根据RefFinder，HT54从高到低的稳定性为UBQ5>b-TUB>GAPDH>LOC_Os08g04390>ACT11>LOC_Os06g23160>18SRNA>eEF-1a>25SRNA>UBQ10>LOC_Os03g61760>LOC_Os04g34440>LOC_Os 01g71000>eIF-4a>LOC_Os01g15850>LOC_Os012g44170.在HT13中，从高到低的稳定性为LOC_Os06g23160>18SRNA>eIF-4a>b-TUB>UBC>UBQ10>UBQ5>eEF-1a>25SRNA>GAPDH>LOC_Os08g04390>ACT11>LOC_Os01g71000>LOC_Os03g61760>LOC_Os12g44170>LOC_Os04g34440>LOC_Os01g15850。RefFinder的分析结果表明，在HT13中表达最稳定的候选基因是LOC_Os06g23160，而在HT54中表达最稳定的候选基因是UBQ5。

可以看出，没有可应用于任何实验条件的内参基因，本发明实施例在高温条件下，从两个水稻品种HT54和HT13中筛选出10个普通内参基因和10个新基因。用四种软件或算法研究了这20个基因在热胁迫下的表达谱。我们的结果表明LOC_Os06g23160是一个新的候选内参基因，在水稻热敏品种HT13中比18SRNA更稳定。

LOC_Os06g23160是一种细菌转移酶六肽结构域蛋白，位于水稻6号染色体上。该基因在本实验中的平均CT值与ACT11等持家基因的CT值非常接近，表明其具有合适的表达强度，因此LOC_Os06g23160是研究水稻耐热性机制的一个新的优良内参基因。

水稻在孕穗期和开花期对高达38℃或更高温度敏感。HT54幼苗可以在48℃下存活79小时，使用HT54和HT13之间的杂交只检测到并克隆了一个主要显性数量性状位点(QTL)。HT54和HT13的背景非常相似，因此它们是探索耐热分子机制的优秀材料。选择45℃作为应力温度。首先，它足够高，可以检测到那些在低温下可能无法检测到的基因表达变化。以ACT11为例，它在许多研究中被用作参考，但与0小时相比，24小时热应激后它增加了20倍以上。其次，45℃下的热应力足以模拟现场条件。

RefFinder在HT54中的排名结果与HT13中的排名结果大不相同。本实施例采用四种算法和程序对17个候选基因的表达稳定性进行了排序。qRT PCR结果表明，在两个水稻品种中，由于其表达水平，这五个基因(18S RNA、25S RNA、LOC_Os12g44170、LOC_Os04g34440和LOC_Os01g15850)均不适合作为标准化的内参基因。对于其他基因，HT13中的分析结果基本一致，其中LOC_OS06G23160基因的稳定性最高。然而，在HT54中，我们发现BestKeeper的分析结果与其他三种方法的分析结果非常不同。由GeNorm计算的高稳定性基因，如b-TUB和UBQ5，在BestKeeper的结果中排名较低。而由GeNorm计算的稳定性较低的基因，如LOC_Os06g23160和18S RNA，在BestKeeper的结果中表现出较高的稳定性。因此，分析比较了HT54的原始数据，将每个基因的原始CT值标准化为相对表达，并进行了初步研究。结果表明，在24小时热应激条件下，除BestKeeper外，其他方法计算的具有高稳定性的UBQ5和b-TUB的表达量比0小时增加了40倍以上。这种现象普遍出现在大多数候选内参基因中。相比之下，LOC_OS06G23160、18S RNA和25S RNA在24小时或36小时的表达与其他时间点相比变化不大，并且LOC_OS06G2360基因的表达最稳定。因此，本发明实施例在热敏感系HT13品种的热胁迫下正常化基因表达提供了最佳的内参基因。

为了证明所鉴定的内参基因的使用效果，选择了在HT13中表达最稳定的基因LOC_Os06g23160以及最常用但在HT13中稳定性较低的管家基因ACT11分别作为内参基因，对LOC_Os12g44170进行标准化，采用常用且稳定表达的管家基因b-TUB同时进行标准化作为结果标准与选定的两个内参基因进行比较。LOC_Os06g23160与ACT11在各个时间点的相对表达量CT值变化如图6所示，LOC_Os06g23160在所有时间点的表达量基本稳定，而ACT11在12h出现了CT值上升的情况，表明表达强度下降，之后的时间点表达强度又上升的现象，表明其较低的稳定性。通过利用2^-ΔΔCT法，分别以ACT11或LOC_Os06g23160作为内参基因对LOC_Os12g44170进行标准化研究该基因相对表达量的变化，具体步骤为：1.计算每个样品目的基因相对内参基因的表达量ΔCT(CT目的基因-CT内参基因)；2.以0h为对照，计算ΔCT均值，用之后的各个组的每个ΔCT减去该均值得到ΔΔCT；3.用公式2^-ΔΔCt计算出实验组每个样品相对对照组的表达量，然后再求实验组的平均值得到LOC_Os12g44170基因表达量的变化，结果如图7所示，b-TUB的标准化结果如图8所示。由图7可知，以LOC_Os06g23160作为内参基因时，LOC_Os12g44170的表达量呈现先上升后下降的趋势，在24h时达到高峰；反观以不稳定的ACT11作为内参基因时，由于在12hACT11的表达下降，使得所得LOC_Os12g44170结果的表达量高峰出现在了12h，得出了与LOC_Os06g23160有所差异的结论。LOC_Os06g23160所得结果与b-TUB一致，在24h时出现表达高峰，与ACT11的结果有差异。因此用于标准化的内参基因需要稳定的表达水平才能得出可靠的结论，同时也证明了LOC_Os06g23160作为HT13在高温胁迫下的候选内参基因的可行性和效果。

以上描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

序列表

<110> 浙江农林大学

<120> 一种热胁迫下水稻内参基因及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7020

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 1

ggtgagcagc aaacgatctc tcctccttcc ctagtccaga ctcccgacgc gaccaagcgc 60

cgccgtcgcc gacgcttccc cgccgtcgga gatggacttc caggtcgtcg tcctcgccgg 120

gggcacctcc gagaagctct cgcccctcgt ctccaaggtc ctctcctccc caccgccgtc 180

ttttaactcc ggcgccctaa ctgtgaccct cttcctcttc tcccgcagga tgtccccaag 240

gcgctcctcc ccgtcgccaa ccgccccgtg ctctcctacg tgctcgacct cctcgaggcc 300

agcgacctca aggacatcat cgtggtgagc gcgcgagctc gcgtgtttct gcttggacgc 360

ggcttgaaaa atggtggggg gattgtggct gatgcgggtg tttcgcacgg tgcaggtggt 420

ggaggggcag gaggccgcgc gactcgtcgg agcttgggcc tcgagcgcct acctagaccg 480

ccttctcgtg gaggtgagct cgaagcctaa tttggctttc gattgattga agtatgatag 540

accctaggtg tttccctttg ctgtcagaat cagctgaatt tatattcatg tttctttctt 600

tgttagatgt catgggtatc tatgggctaa cttttgcata gtttgcaaaa gaatttctct 660

tgtggagata tcattgaatc attttgttca ggttgctgta ttgtatggat gaactccttt 720

taattttcgt gtatgatgga gtttttttca cggagatagt ctcgtggtgc cgtgcatatt 780

atacagttgt gtgcttgctt atctgggttc tcaaggtaat gatattaaga aggtttgaat 840

gctaaaggag ttatggtata tgaagcagca tgatatggtc agcttcagaa agcatgatat 900

aatcaagttt cctagttcta aggctgttat gattattttt tagtgaaaat tggttggcta 960

ggtgtattta ttgtgaaatc agtcaaaggg cctgtttggg ggagctttag attctgagaa 1020

gcagctgttt ggtagccagc ttctaaaaat atggaaaagc tttgaaaccc agcttctcca 1080

gcttctggct tcttagttca tttttcagaa tctgtaacta cagattctca gaagctgtgg 1140

actgtttggg gcagcttcta ccagaagcag cttttgggaa aagctgcagc tgggacaagc 1200

tcccccaaac agggccaaaa aggctgtgta cctattcgtc taaattaatt gaaatgctgc 1260

ccctctatgt tcagtgtctg tccaatctat tacgagctgg ccttttgttt tggaaccaaa 1320

ggaaaacccc agtggcagat ttgtattgcg aaagaatgaa gccagtgtct actgactaca 1380

gttggcgttt tacatcccag ataaagctta tttattaggg catgcgcaat gtatcttacc 1440

caactagtaa ataagatggg ccccatgacc aggaggtagt aagctgcaac tcttctcaca 1500

atgcttatat gagtgtagtg gtaaacaagg tggggtccac ctgaaaaaat ccatccatcc 1560

caaccctcca ttacctggat cctgtcagaa tcttcatatt ttatttggtt gttgccggca 1620

atagcacaaa taccaggtag taactactac ctcttcccac aatgcttact attgggtagt 1680

aggcttgaaa taaatgcttg ttacctggtt ttttgccaca ttgtggttgc tcttaggaat 1740

ttccactatt ctgcatttcc ctttgaacat aagatctaca ttgtagttat tgcaatctcc 1800

aatcccgccc tgtcctttta agtttggggc atttgtaaat ttgccaccgg ttttttcaat 1860

attgcaagga tgccactcga atgacagttc tagtggcatt tttgcaattt tctagtggca 1920

attttgcaat aacgattcaa agtagtggta aatttgcaat tgccccttta aggttcaaac 1980

ataggcgagc agtctaaatg gttagaactt acaatatttc acatagcaat agaggaacat 2040

agaacattgt tcatctcttt ttgtttaata tcgtagtttg tttttcttag cagagcgtgg 2100

ttgattgatt ggacaaatta gatgggcaca ttctgctgat atcttgcatg ttaagttgtt 2160

attcgttgct tttgtttgaa tatttgacat ccatcacaat acgtagttta acattggctt 2220

gtggctaact ggctacttga atacatatat gtgtatgagc atattttgat gcactcttct 2280

gcactttttt cactttgata caccttccaa cagaatgaag ctaattcaat atcataagtc 2340

ttctgtgaaa cttaaaataa tgtgtgattg aagtctttgc cctgtctaat cattgctttt 2400

cattaatatg ttataatatg aaaatttcag cttctgatag agagttagag acacagtcag 2460

catgatgtat tgctaaaatc ctccattttt tagcggcttc aactccttgg gtttatgttt 2520

ggatttcatt tatatttttg tctgtgttat cttctaatca ttagttttag ttgtccatta 2580

gattttttct ttggttcctc aaattaaaat aggccaattt gcctggtacc atcgcaaaaa 2640

tcatggaact ggaaaatact aatgtatctg tcattgatgt gggtccagga cccacatgcc 2700

attctcagat acgctcgtat tttgcaactc acatatctca actatagtat tttccgattt 2760

tttttattga aataggtctc gtgtctatgt ggagtgtatc agtctttggg agtaacttat 2820

ctttctcttg tataggttgt ggcagttcca gaggacattg gaacagctgg tgcactacga 2880

gctatttcaa agcgactgac tgcaaatgat gttttggtaa tgttaatgct tttatagaac 2940

cttaagaatg ctaaaatatg catgctaagt gtaatgtaga tattaatgta ttagaacctt 3000

gttacaatag gtgattagcg gcgacctagt aactgatgta cttcctgggg ctgttgctgc 3060

tactcataga agaaatggtg ccgctgttac tgctttacta tgttctgttc ctatcagtgg 3120

tccttcagat gctgcttctt ctggagggaa agataaagct aaaaaaccaa ctcgactgaa 3180

tatagttggg ctagacataa caaggcaatt cttgttgcat attgtatcag gtttgtatgt 3240

cttgttaaaa aggttttaaa gttgattagt agctgttatt catgaatcat gattcatatg 3300

cttgtcgatt ccgactggca ggaaccgatg ttgaaaaaga tgtacgtgtt tacaagcgaa 3360

aaatccgagc tgtaggcgag gtacggaacg tgtaaccctg tatatgaaat gattttgttt 3420

gctaacagaa atatatattg gctgtgctgc acttgttatg tgccataaca catgacatgt 3480

cacaaaaata tctggtaaaa aaatatgttg agtgtgatag agatttcaaa acttaatttt 3540

agtttttgag aagagctcaa gacatatctc tattcttttg gttcttggta ggcacaataa 3600

agtttctttg taatgggttc aaggcaatca aactttactg agacaggcag tcaggcactg 3660

tataacaggc ttcaccatat aatatatcct gcattattag tattagcaaa ttcttttata 3720

tggcagcagg gaaggaatag tcagaaagcg cgctttctgg tcgagcaggc ttgatctgca 3780

tggcgagagg cttctgttat tactgcttgg tgacaataaa gaaacataga gcactgaggg 3840

catattattt taaatagaag cgccatgaga ggggtcccat ttaaagttta aaactcctgt 3900

ttgaataaca tccagaaaaa gcaggactca agaacaaggc taaagcttca tatgctcctt 3960

ttccctatag gatttaaagt tctccatttc tcctttggtt caaaaagggc ttcatgattt 4020

ttattgtgga tacgtgtgca ttctaaggat tcttgctttg ggatttcata taaatcttaa 4080

cttgtcgcta tttcccccaa aagattacct catccaaaca cattgttaag ggtagtgcac 4140

tgactgactg gagcagtaca tctaataagt gggacctgac aaaggaggga aaacttttta 4200

gagatattag ctgagtactt cagagttcct tttaaggata gtcatttttg tctatgtatt 4260

cttgcattaa tttagttgga aattcagaat tgtctgagca tgacttgtga tgaccatgaa 4320

tgattgacag ggcaagtgac tgtgtggaca atagttttat tttcactgga atgtagtgtc 4380

acgtttcgaa tttgactcta tcatcctatt ctataacttg aatgcgggag actcgaatgt 4440

attcagttag agttttctat tgtattgtaa tcttaactaa ccatcttcct cttgctagat 4500

ggaaattcga agtgatctga tggatgcaca tctgtatgct tttaagaggt agttgagttg 4560

ttctatttcc ctttagtttt gtgtgggcaa atgtcccaat gcccaatcca gtaatatctt 4620

gctgtctgtt ggtcacagga caacattaca gaatatactg gaagagaaag aatcataccg 4680

tagcattaga cttgaagtcc taccatactt agtgaggagt cagttggtat gttcgtactc 4740

aatttcttgt tgtttgatgg tctcttaact ctatttctaa gcacttcata attttggtca 4800

aatttgtgta gaaatcatct tcatcaggag gtgagggaac aaccgttgat gaaactggcg 4860

atactacagt tccatccaat agtcatttgc agtgtctatc acagcatcgc atacttgcac 4920

catctgcttt taagaaagat ttgttatcat ctggaggaac atataggtgc tgtgtctata 4980

ttgctactaa aagcaagtac tgtcatcgtt tgaactccat tcaggcatac tgtgatatca 5040

accgagatgt aaatttctca tcctgtagta aatgccaatt ttttttgttg caatattgct 5100

gttcttactt gaatgctaac cataatttaa caggttgtag gggatgctag tcacttgtcc 5160

ggttattcct tctctgcaca gaacaacatc atccatccaa cttctgtgct tggatcgaag 5220

actacagtaa gtctgatttc atagctattt tagttttaga accatgaaat ggttgctgaa 5280

atacataaaa aataaaagtt aaatatagaa tgcgaacatt ctttattcaa tcaagtcttg 5340

tatgtgcaaa tttacatgtg ttggattgaa gatgataatg ttctctctgc tgacaaaaag 5400

tgactagtgt tccattttaa catggcctct aaaatgattg gatctttgta catagatact 5460

aggactagca ataatattgt atgactttag ataagtacta gagagggaag cgtaaatcta 5520

tcagtgctgg cacttttcac tgttacaact caagtagaat actaccttca tgcttcataa 5580

atactgcatg ggatctttgt tattttttat ttcatttgaa ctcattcttc caaagtattt 5640

tccttacaaa accagattct ttaattcaat ttttctttga tgagaagttc agtatgtttg 5700

tctgatcctg gttgctggaa tgatgaatct tcttttgtag tgttggcatt gaggacccta 5760

tgttttaatt ttttttgtta gattaatgaa aaatagcaat tctctctatt ctgttgtgtc 5820

aaaacttctt aaatgacgag cttctatttt ggcctatttt ccttgtaata tttgattatt 5880

tatagatcgg accacaatgc atgcttgctg agggttcaca attaggtgac aaatgtagtg 5940

tgaagcgatc tgttattggc cgtcattgtc gaattggttc aaatgtaaag gtaataatac 6000

tattactttg ttgtttcatg ccaatttatt acaaattcct ttgttctact tgatagtatc 6060

atttgatagc tagtaatcag tatatgctac cttgccactg tttttatatc atagtttcaa 6120

tgcagtaggt catttggtgg aatactacaa ctaattactt ctgattggag ataaaagttt 6180

ctttgttgat ctgaacattt aattattata ttcctttgtt ttagattgtc aattctgtcg 6240

tgatgaacca tgtggttatt gaagatggtt gtcacataca aggttctgtg atatgcaata 6300

atgtgcaact tcaagaacgt gctgttttga aagattgtca ggtacctatt tttttccctc 6360

tttgtgcacc aattttactt aaacttagaa gtgattaaaa ctttagaggg gaaatgtttt 6420

attcatgtca agcggtgaag gtacagttga tgatattgct tttcaccctt gtatatataa 6480

aataaaaatg aataatttta tatttagccc tgttatagag acgccacatt gaaattgtct 6540

ttataacctt ttatatgttg aaatgatttc aggttggtgc tggttatatt gtaactgcta 6600

gcagtgaaca caaagcagaa tctctcagca agaaagtaga gcgattttga tagtgtggtt 6660

gaccttgaac aattttgttt gctaagtcag atacagccgt acaaggagtt aagaagggag 6720

ggggtaacat gtatttcgaa aaaatgattt caccgtgata ccccaaaaaa tagtgtgctc 6780

ttgtctattc taacagattg agcttggact tgacagttga agcgcttcta gcgagattga 6840

tccatgatat tatgagtaaa ctatgtgtat ccgtttgttg gccctgttcc tgttattgat 6900

ttgtaatttt cttgtcaatt tgggtggtac agtaattcat ttggtacacc aaggtggttc 6960

ttgtcgctat tttgtaatac attatgttag ctttgggcgg cttactccct ccattccaca 7020

Claims (6)

1.一种热胁迫下水稻内参基因，其特征在于，所述内参基因的基因序列如SEQ ID No1所示。

2.根据权利要求1所述的热胁迫下水稻内参基因在荧光定量PCR检测中的应用。

3.根据权利要求1所述的热胁迫下水稻内参基因，其特征在于：所述内参基因的荧光定量PCR引物的核苷酸序列为：

正向引物序列：ACACGTTACGCTACAAACTCTA；

反向引物序列：GAGATGCTAGGTGACGTGATTA。

4.根据权利要求1所述的热胁迫下水稻内参基因在水稻基因定性检测中的应用。

5.根据权利要求1所述的热胁迫下水稻内参基因在水稻基因定量检测中的应用。

6.根据权利要求1所述的热胁迫下水稻内参基因在筛选水稻耐热基因的应用。

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