CN110157776B

CN110157776B - 盐胁迫下碱蓬稳定表达的内参基因筛选方法

Info

Publication number: CN110157776B
Application number: CN201910425496.XA
Authority: CN
Inventors: 徐宗昌; 任婷婷; 李义强; 张成省; 杜海娜; 孟晨; 马斯琦; 王萌
Original assignee: Tobacco Research Institute of CAAS
Current assignee: Tobacco Research Institute of CAAS
Priority date: 2019-05-21
Filing date: 2019-05-21
Publication date: 2022-10-25
Anticipated expiration: 2039-05-21
Also published as: CN110157776A

Abstract

本发明公开了盐胁迫下碱蓬稳定表达的内参基因筛选方法，根据实验室获得的转录组分析结果及其他植物已报道的内参基因序列信息，初步筛选表达相对较为稳定的14个候选内参基因，其基因名分别为：ACT7、ACT11、CCD1、TUA5、UPL1、UBC28、EF1α、PP2A、DREB1D、TIM、V‑H⁺‑ATPase、MPK6、PHT4:5、CESA1；针对上述候选基因，设计相应扩增引物，并进行内参基因的筛选，本发明筛选了10个在碱蓬基因表达谱中稳定表达的基因，以其作为碱蓬盐胁迫内参基因，有利于提高碱蓬盐胁迫条件下基因表达分析研究的稳定性和可靠性；本方法弥补了现有的单一内参基因可能导致实验结果有偏差甚至错误的不足，能够得到更为可靠的结论，对于推动分子生物学方法的改进和完善、揭示细胞分化、发育、形态发生具有重要意义。

Description

盐胁迫下碱蓬稳定表达的内参基因筛选方法

技术领域

本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及盐胁迫下碱蓬稳定表达的内参基因筛选方法及应用。

背景技术

碱蓬属(Suaeda)植物属于重要的盐生植物资源，全球约100余种，主要生长于海滨、湖边和荒漠等处的盐碱荒地，是一种典型的盐碱地指示植物。我国有碱蓬属植物20种及1个变种，分布广泛。目前，人们对碱蓬属植物的研究主要集中在其栽培与组织培养、耐盐基因开发与利用以及离子运输与信号传导等方面。也有学者研究了碱蓬属植物在水培条件下对重金属元素的吸收效应，以及碱蓬属植物对有盐度富营养化水体的生物修复效应。碱蓬可作为模式生物用于植物耐盐、抗逆机制的研究，还可作为修复植物用于受污染滨海湿地的生态恢复。因此碱蓬属植物所含有的丰富抗逆性基因资源亟待开发。

实时荧光定量RT-PCR(real-time fluorescent quantitative reversetranscription-polymerase chain reaction，FQ RT-PCR)由于其灵敏性高及特异性好被广泛应用于基因表达研究，它能检测极低含量的mRNA以及基因在不同样品间细微的表达差异变化，因此qRT-PCR常用来筛选有研究价值的关键基因。而其结果的准确性在很大程度上取决于内参基因的稳定性。为了去除不同样本在RNA的产量、质量以及逆转录效率上可能存在的差别而获得目标基因特异性表达的真正差异，通常选择一定的内参基因进行校正和标准化。理想的内参基因应该在不同的基因型、不同发育阶段、不同组织器官和不同胁迫条件下恒定表达，但事实上这样的理想内参基因根本不会存在。广泛的实验数据表明内参基因可能受不同组织、不同发育阶段或不同环境胁迫等条件的影响而稳定性发生变化，所以单一内参可能导致有偏差不准确甚至错误的实验结果。因此，需要根据不同物种及不同试验条件筛选合适的内参基因，这对获得准确的qRT-PCR实验结果是非常重要的。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

本发明盐胁迫下碱蓬稳定表达的内参基因筛选方法，包括以下步骤：

1)初步筛选14个稳定的候选内参基因，其基因名分别为：ACT7、ACT11、CCD1、TUA5、UPL1、UBC28、EF1α、PP2A、DREB1D、TIM、V-H⁺-ATPase、MPK6、PHT4:5、CESA1；针对上述候选基因，设计相应扩增引物；

2)提取不同盐浓度处理的碱蓬总RNA，并测定其浓度，获得的不同盐浓度处理碱蓬总RNA反转成cDNA，并以上述获得的所有样品cDNA等核酸量混合后的总cDNA和碱蓬gDNA作为扩增模板，并利用PCR检测引物的特异性；

3)以不同盐浓度处理的碱蓬cDNA为模板，对11个候选内参基因在qRT-PCR仪器上进行反应，上述11个候选内参基因命分别为：ACT7、ACT11、CCD1、TUA5、UPL1、PP2A、DREB1D、V-H⁺-ATPase、MPK6、PHT4:5、CESA1；测量方法为荧光定量PCR反应法；

4)利用荧光定量PCR反应后得到的Ct值，对各候选内参基因进行稳定性分析；

5)通过geNorm确定准确定量的最优内参基因数目，以0.15为阈值，通过标准化因子配对差异分析(Vn/n+1)值来判定内参基因的最合适数目；

6)对碱蓬CESA基因表达量变化进行计算。

作为本发明的优选技术方案，所述步骤2)中反应体系为10μL 2反应体系为，所述步骤数目；，以；碱蓬总，0.6μL 10应体正向引物和0.6μL 10物和反向引物，所有待测样品的混合模板1μL，ddH₂O补齐至20μL；PCR反应循环设置为94循预变性2min；94i变性30sec，58s退火30sec，72s延伸1min；40个循环；72环延伸10min。利用2％的琼脂糖凝胶电泳检测14个候选内参基因片段的PCR扩增产物。

作为本发明的优选技术方案，所述步骤3)中qRT-PCR体系为20μL，包含10μL 2含-PCR，所述步骤混合模板以；碱蓬总官和不同胁迫条件，10含-的正向引物(F)和反向引物(R)各0.4μL，5044物CR，所述步骤混合模板以；碱蓬总10.4μL，cDNA模板1μL，加ddH₂O至20μL，设置3个技术重复，体系中的cDNA模板均为1μ板均为复，反转得到的cDNA。

作为本发明的优选技术方案，所述步骤3)中还包括荧光定量PCR扩增，荧光定量PCR扩增采用两步法，反应程序为95采预变性30sec，然后95后ec步法，、60后ec步法，进行40个循环，再运行融解曲线阶段的95环，再运行融解，60环，再运行融，95环，再运行融解，反应结束后进行融解曲线分析。

作为本发明的优选技术方案，所述步骤4)中采用GeNorm、Bestkeeper和Normfinder软件对各候选内参基因进行稳定性分析，并确定内参基因的Ct值，在15-25之间。

作为本发明的优选技术方案，所述步骤6)中以10个基因做为内参基因，对目的基因CESA在不同盐浓度处理条件下表达量的变化分别进行计算，上述10个内参基因为ACT7、ACT11、CCD1、TUA5、UPL1、PP2A、DREB1D、V-H⁺-ATPase、MPK6、PHT4:5。

本发明的有益效果是：

(1)本发明筛选了10个在碱蓬基因表达谱中稳定表达的基因，以其作为碱蓬盐胁迫内参基因，有利于提高碱蓬盐胁迫条件下基因表达分析研究的稳定性和可靠性。

(2)本专利使用多内参基因组合研究碱蓬基因的方法弥补了现有的单一内参基因可能导致实验结果有偏差甚至错误的不足，利用此方法可以极大地促进实时荧光定量PCR技术计算方法的改进，该方法能够快速准确的从碱蓬中鉴定出抗逆关键基因，用于逆境适应机制的研究，同时多内参基因进行数据分析对于任何一个需要实时荧光定量PCR实验的生物物种均可采用；与传统的单一内参基因方法相比，精确而可信度高，能够得到更为可靠的结论，对于推动分子生物学方法的改进和完善，揭示细胞分化、发育、形态发生具有重要意义。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是本发明碱蓬内参基因片段扩增；

图2是本发明内参基因溶解曲线；

图3是本发明内参基因Ct值分布范围；

图4是本发明内参稳定性；

图5是本发明最适定量内参个数；

图6是本发明CESA基因表达量。

注：图1中，A为cDNA模板；B为gDNA模板(条带多的三个基因UBC28，EF12和TIM在这个阶段排除，不能做为内参使用)。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例：本发明盐胁迫下碱蓬稳定表达的内参基因筛选方法，包括以下步骤：

1)初步筛选表达相对较为稳定的14个候选内参基因，其基因名分别为：ACT7、ACT11、CCD1、TUA5、UPL1、UBC28、EF1α、PP2A、DREB1D、TIM、V-H⁺-ATPase、MPK6、PHT4:5、CESA1；针对上述候选基因，设计相应扩增引物；

2)根据植物总RNA提取试剂盒EasyPure Plant RNA Kit的说明书，提取不同盐浓度处理的碱蓬总RNA，并测定其浓度；根据反转录试剂盒TransScript II First-StrandcDNA Synthesis SuperMix的说明书将获得的不同盐浓度处理碱蓬总RNA反转成cDNA；以上述获得的所有样品cDNA等核酸量混合后的总cDNA和碱蓬gDNA作为扩增模板，利用PCR检测引物的特异性；

6)对碱蓬CESA基因表达量变化进行计算。

步骤2)中反应体系为10μL 2反应体系为进行计算。数目；分析；st-，0.6μL 10应体正向引物和0.6μL 10物和反向引物，所有待测样品的混合模板1μL，ddH₂O补齐至20μL；PCR反应循环设置为94循预变性2min；94n变性30sec，58s退火30sec，72s延伸1min；40个循环；72环延伸10min。利用2％的琼脂糖凝胶电泳检测14个候选内参基因片段的PCR扩增产物，结果如图1所示。条带多的三个基因UBC28，EF12和TIM在这个阶段排除，不能做为内参使用。其他11个候选内参基因的引物均具有很好的特异性。纯化PCR产物，测序验证所扩增的片段是否为目标序列。

步骤3)中qRT-PCR体系为20μL，包含10μL 2含-PCR所扩增的片段是否为目标序列。化trand c，10含-的正向引物(F)和反向引物(R)各0.4μL，50.4物CR所扩增的片段是否为目标序列。化tranμL，cDNA模板1μL，加ddH₂O至20μL，设置3个技术重复，体系中的cDNA模板均为1板均为复，体反转得到的cDNA。

步骤3)中还包括荧光定量PCR扩增，荧光定量PCR扩增采用两步法，反应程序为95采预变性30sec，然后95后ec步法，、60后ec步法，进行40个循环，再运行融解曲线阶段的95环，再运行融解，60环，再运行融，95环，再运行融解，反应结束后进行融解曲线分析，通过对等核酸量混合后的cDNA模板进行连续的十倍梯度稀释，经qRT-PCR获得数据，建立标准曲线，分析确定每对引物的扩增效率。11个候选内参基因的熔解曲线如图2所示。

步骤4)中采用GeNorm、Bestkeeper和Normfinder软件对各候选内参基因进行稳定性分析。首先Ct值变异大小是一个因为能否作为内参基因的首要筛选条件，合适的内参基因的Ct值需适中，大约在15-25之间，表达过高(Ct很小)或过低(Ct值很大)的基因均不适合做内参基因。内参基因Ct值分布范围如从图3所示，在此阶段排除CESA1，因其在不同处理间Ct值变化太大。通过GeNorm软件计算每个候选基因表达稳定度M值，M值越高，表达越不稳定。结果如图4所示，候选内参基因的表达稳定性由强到弱依次为PP2A/TUA5>V-H⁺-ATPase>MPK6>ACT11>CCD1>UPL1>PHT4:5>ACT7>DREB1D。NormFinder软件结合组内方差与组间方差计算出各候选内参基因稳定值，该值越小，表明内参基因越稳定。结果如表1所示，候选内参基因的稳定性由强到弱依次为PP2A>TUA5>MPK6>CCD1>UPL1>V-H⁺-ATPase>ACT11>ACT7>PHT4:5>DREB1D。

表1内参稳定性(NormFinder)

Bestkeeper通过计算标准偏差和变异系数值的大小比较各内参基因的稳定性，标准差和变异系数越小，稳定性越好。结果如表2所示。

通过geNorm确定准确定量的最优内参基因数目，以0.15为阈值，通过标准化因子配对差异分析(Vn/n+1)值来判定内参基因的最合适数目。结果如图5所示，最适定量内参个数为6个以上。Bestkeeper还可通过两变量之间的相关系数来看内参基因的相关性。r值越大，相关性越好。结果如表2所示，V-H⁺-ATPase、PP2A、TUA5、CCD1、MPK6、ACT11这6个内参基因高度相关。

表2内参相关性(BestKeeper)

步骤5)中以10个基因做为内参基因，对目的基因CESA在不同盐浓度处理条件下表达量的变化分别进行计算，上述10个内参基因为ACT7、ACT11、CCD1、TUA5、UPL1、PP2A、DREB1D、V-H⁺-ATPase、MPK6、PHT4:5，结果如图6所示，目的基因CESA的表达趋势基本一致，表明ACT7、ACT11、CCD1、TUA5、UPL1、PP2A、DREB1D、V-H⁺-ATPase、MPK6、PHT4:5这10个基因在碱蓬内表达稳定，可作为定量碱蓬荧光定量内参基因。

最后应说明的是：在本发明的描述中，需要说明的是，术语“竖直”、“上”、“下”、“水平”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

在本发明的描述中，还需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“设置”、“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.盐胁迫下碱蓬稳定表达的内参基因筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)初步筛选14个稳定的候选内参基因，其基因名分别为：ACT7、ACT11、CCD1、TUA5、UPL1、UBC28、EF1α、PP2A、DREB1D、TIM、V-H⁺-ATPase、MPK6、PHT4；5、CESA1；针对候选基因，设计相应扩增引物；

2)提取不同盐浓度处理的碱蓬总RNA，并测定其浓度，获得的不同盐浓度处理碱蓬总RNA反转录成cDNA，并以上述获得的所有样品cDNA等核酸量混合后的总cDNA和碱蓬gDNA做为扩增模板，并利用PCR检测引物的特异性；

3)以不同盐浓度处理的碱蓬cDNA为模板，对11个候选内参基因在qRT-PCR仪器上进行反应，上述11个候选内参基因名分别为：ACT7、ACT11、CCD1、TUA5、UPL1、PP2A、DREB1D、V-H⁺-ATPase、MPK6、PHT4；5、CESA1；测量方法为荧光定量PCR反应法；

5)通过geNorm确定准确定量的最优内参基因数目，以0.15为阈值，通过标准化因子配对差异分析Vn/n+1值来判定内参基因的最合适数目；

6)对碱蓬CESA基因表达量变化进行计算，以10个基因做为内参基因，对目的基因CESA在不同盐浓度处理条件下表达量的变化进行计算，上述10个内参基因为ACT7、ACT11、CCD1、TUA5、UPL1、PP2A、DREB1D、V-H⁺-ATPase、MPK6、PHT4；5。

2.根据权利要求1所述的盐胁迫下碱蓬稳定表达的内参基因筛选方法，其特征在于，所述步骤4)中采用GeNorm、Bestkeeper和Normfinder软件对各候选内参基因进行稳定性分析，并确定内参基因的Ct值，在15-25之间。