CN100354420C

CN100354420C - 来源于甘薯的过氧化物酶基因组基因及其启动子

Info

Publication number: CN100354420C
Application number: CNB008149631A
Authority: CN
Inventors: 郭尚洙; 李幸顺; 权锡胤; 金纪延
Original assignee: Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Current assignee: Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Priority date: 1999-10-29
Filing date: 2000-10-28
Publication date: 2007-12-12
Anticipated expiration: 2020-10-28
Also published as: US6649748B1; AU1419801A; EP1224289B1; DE60035426D1; JP2001169790A; WO2001031018A1; CA2389328A1; EP1224289A1; CA2389328C; EP1224289A4; CN1384879A; JP3571639B2

Abstract

本发明涉及一种压力可诱导的启动子。具体地说，本发明涉及新的来源于甘薯的编码过氧化物酶同工酶的基因组基因及其启动子，其表达在培养的细胞和完整植物中在环境压力下被强烈地诱导。本发明的全部或部分过氧化物酶启动子可以有效地用于开发对环境压力表现抗性的压力-耐受植物，和开发能够大规模生产有用物质的转化的生物体。

Description

来源于甘薯的过氧化物酶基因组基因及其启动子

发明领域

本发明涉及一种压力可诱导的启动子。具体地说，本发明涉及一种新的编码甘薯(Ipomoea batatas)的过氧化物酶同工酶的基因组基因及其启动子，其表达在环境压力下在培养的细胞和完整植物中的表达被强烈诱导。

本发明的全部或部分过氧化物酶基因启动子可以有效地用于开发环境压力抗性的压力-耐受植物，以及用于开发大规模生产有用物质的转化生物体。

发明背景

当大多数包括植物在内的生物体暴露于各种由于地球环境恶化产生的环境压力下，以及细菌、昆虫和病毒的生物压力下时，维持生命必需的氧气改变成导致严重生理疾病的超氧化物阴离子游离基、过氧化氢和羟基游离基这些反应性氧类(reactive oxygen species)。因此，体内存在一些消除这些反应性氧类的系统，例如作为大分子抗氧化酶的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和催化酶(CAT)，以及作为小分子抗氧化物质的维生素C、维生素E和谷胱甘肽。

众所周知，过氧化物酶广泛存在于植物细胞中，作为存在电子供体时还原过氧化氢的还原酶。由于过氧化物酶在植物对各种外界压力的反应中发挥重要作用，而且它是一种由于其灵敏的酶反应活性成为用作各种临床试验试剂而具有工业重要性的酶，因此它逐渐成为关注的焦点。一般来说，植物过氧化酶的活性随着各种环境压力而增加，尤其在高氧化压力下生长的培养细胞中非常高。据报道，培养的甘薯细胞比任何其它培养的植物细胞产生量大得多的过氧化物酶(植物化学(Phytochemistry)，39，981-984，1995)。

已报道来源于包括辣根、大麦、小麦、油菜、烟草、菠菜和大米在内的约20种植物的编码过氧化物酶同工酶的基因。本发明人首次分离出甘薯的过氧化物酶基因。我们已经报道阴离子过氧化物酶swpa1和从培养的甘薯细胞中分离出来的中性过氧化物酶swpn1在甘薯的培养细胞和茎中特异地表达，并在基因组中复数存在(Mol.Gen.genet.，255，382-391，1997)。还曾报道，通过将这些过氧化物酶基因的全部或部分转化到植物机体和细胞中，而大规模生产过氧化物酶(Phytochemistry，47，695-700，1998；Phytochemistry 48，1287-1290，1998)。

另外，本发明人已从甘薯中发现阴离子过氧化物酶基因swpa2(GeneBank入藏号NO.AF109124)和swpa3(GeneBank入藏号No.AF109123)的核酸序列。按照这些核酸序列，swpa2具有71个信号肽，swpa3具有66个信号肽，swpa2和swpa3分别具有编码358和349个氨基酸的1245和1310bp的核酸序列。swpa2和swpa3表达的成熟蛋白的等电点分别为4.1和4.3，这表明这些基因都编码阴离子过氧化物酶。swpa2和swpa3的3’-非翻译区中存在AAUAA这样的典型多腺苷酸化信号和Poly(A)-尾，尤其是，swpa2基因的N-末端序列与来自甘薯培养细胞的主要同工酶(A-2)的N-末端序列完全一致。另外，本发明人已经证明，在甘薯叶中，swpa2基因对受伤、低温或臭氧处理响应而强烈表达，另一方面，swpa3基因对受伤处理响应为弱表达，但对低温或臭氧处理响应为强烈表达(Mol.Gen.genet.，261，941-947，1999)。

发明概述

本发明的一个目的是提供一种来源于甘薯的基因组过氧化物酶DNA及其核酸序列。

本发明的再一个目的在于提供一种启动子，各种环境压力强烈诱导其表达。

本发明还有一个目的在于提供对各种环境压力具有抗性的转化的生物体及其制备方法。

本发明还有一个目的在于提供能够大规模生产有用物质的转化生物体及其制备方法。

附图简述

图1显示包括本发明甘薯过氧化物酶基因的分离的基因组DNA的Southern印迹分析结果。

图2a显示编码本发明的甘薯过氧化物酶的基因组基因SWPA2的核酸序列及由其编码的氨基酸序列。

图2b是图2a编码本发明的甘薯过氧化物酶的基因组基因SWPA2的核酸序列及由其编码的氨基酸序列的继续。

图3显示编码甘薯过氧化物酶的基因组DNA SWPA2的启动子的核酸序列。

图4显示编码甘薯过氧化物酶的基因组DNA SWPA2的启动子缺失突变体的示意图。

图5显示用本发明的启动子缺失突变体进行的transit检测(transitassay)的结果。

图6显示导入了本发明的启动子缺失突变体的转化酵母的GUS活性测量结果。

图7a显示导入本发明的启动子缺失突变体的转化的烟草植株在非受伤条件下，诱导的GUS活性的测量结果。

图7b显示导入本发明的启动子缺失突变体的转化的烟草植株在受伤条件下，诱导的GUS活性的测量结果。

图8a显示导入本发明的启动子缺失突变体的转化的烟草植株在无H₂O₂处理条件下，GUS活性的测量结果。

图8b显示导入本发明的启动子缺失突变体的转化的烟草植株在H₂O₂处理条件下，诱导的GUS活性的测量结果。

图9a显示导入本发明的启动子缺失突变体的转化的烟草植株在无UV照射条件下，GUS活性的测量结果。

图9b显示导入本发明的启动子缺失突变体的转化的烟草植株在UV照射条件下，诱导的GUS活性的测量结果。

图10a显示由导入本发明的启动子缺失突变体的转化的烟草植株诱导的、GUS染色后的愈伤组织。

A；pBS1314 B；pBS1824

C；对照 D；pBI121

图10b显示由导入本发明的启动子缺失突变体的转化的烟草植株诱导的愈伤组织的GUS活性的测量结果。

A；pBS1314 B；pBS1824

C；对照 D；pBI121

图11a显示由导入本发明的启动子缺失突变体的转化的烟草植株诱导的悬浮培养的细胞的细胞生长曲线。

图11b显示由导入本发明的启动子缺失突变体的转化的烟草植株诱导的悬浮培养细胞的GUS活性的测量结果。

优选实施方式的详述

本发明详细描述中使用的术语和技术为包括本发明在内的技术领域的一般含义。另外，本发明详细描述中提到的参考文献均包括在本发明的详细描述中，用于描述本发明。

本发明的“核酸序列衍生物”指通过在swpa2，SWPA2或SWPA2启动子中取代、删除或添加一个或多个碱基同时保持其生理活性的修饰的核酸序列。

本发明的“蛋白质衍生物”指在swpa2编码的氨基酸序列中取代、删除或添加一个或多个氨基酸同时具有过氧化物酶活性的修饰的氨基酸序列。

“SWPA2启动子”指包括SEQ.ID NO.2代表的核酸序列，并且在适当条件下使可操作地与其连接的基因具有转录活性的核酸序列。

“SWPA2启动子的活性片段”指包括部分SEQ.ID NO.2代表的核酸序列，并且赋予可操作地与其连接的基因SWPA2启动子活性的核酸序列。

“转化的生物体”指用这样一种DNA构建体转化的转化细胞或植物，这种DNA构建体包含可操作地与一个编码异源蛋白的DNA序列连接的SWPA2启动子。本发明的这种转化生物体包括转化的微生物、动物细胞、植物细胞、转基因动物或植物、以及来源于它们的培养细胞。

“环境压力”指生物压力或非生物压力，例如受伤、活性氧类、肿瘤、受热、潮湿、温度、盐、空气污染、UV、重金属等，它们对目的生物体的作用表现为一种压力(stress)。

下面，详细描述本发明。

本发明提供了编码源自甘薯的过氧化物酶的基因组基因SWPA2及其核酸序列。

本发明的SWPA2包括全部或部分的SEQ.ID NO.1代表的核酸序列，其中该DNA序列包括编码甘薯过氧化物酶swpa2的外显子。

SWPA2是一种具有与swpa2相同ORF(开放读码框)的基因组克隆，它是通过从甘薯的基因组DNA文库中通过三次筛选得到，被命名为天然SWPA2(参见图2)。

天然SWPA2含有3个外显子，2个内含子和启动子区，其外显子的核酸序列与swpa2 cDNA(GeneBank入藏号No.AF109124)的核酸序列完全相同。甘薯过氧化物酶的基因组克隆含有相当长的内含子，尤其是其中的第一内含子为737bp。它比任何其它植物中的内含子的100-300bp都要长。过氧化物酶基因组克隆的每个内含子都遵循GT-AG规则，即内含子的5’端由GT起始，内含子的3’端由AG结尾。

另外，本发明提供了其表达被各种环境压力诱导的启动子。

在本说明书及权利要求书中，SWPA2启动子的含义包括SWPA2启动子及其活性片段，除非另有特别限定。本发明的SWPA2启动子包括SEQ.ID NO.2代表的全部核酸序列或其部分的具有启动子活性的核酸序列。例如，SWPA2启动子优选包含SEQ.ID NO.2代表的核酸序列的503到1828位的核酸序列，或其具有启动子活性的部分DNA序列。

按照本发明的启动子在环境压力下强烈表达，且其来源于甘薯的基因组过氧化物酶基因的天然SWPA2。

天然SWPA2在翻译起始位点上游有启动子区，被命名为SWPA2启动子。利用计算机生物学及信息实验室(Computational Biology & Informatics Laboratory)的转录元件检索软件(Transcription Element Search Software，TESS)分析了SWPA2启动子核酸序列的特征。结果发现，SWPA2启动子含有 SEQ.ID NO.2代表的核酸序列，且在-895位具有CAAT盒，以及用于转录起始的TATA盒(参见图3)。

序列分析结果发现，SWPA2启动子含有真核生物启动子的调控元件，即用于转录起始的TATA盒和-895位的CAAT盒。另外，SWPA2启动子在-445到-455区具有一个与NNNSACGTGNCM代表的G盒类似的基元，所述-445到-455区是转录调控蛋白的结合区，其能被ABA(脱落酸)、茉莉酸甲酯、UV、受伤和低氧调控(Williams，M.等，1992)(参见图3)。组织特异性表达且能被压力诱导的转录因子SP-1位于SWPA2启动子的G盒和转录起始位点之间。在SWPA2启动子区还发现6个AAAATAA重复序列。

SWPA2启动子在-1170到-1188区还具有含共有序列AGAAN的热激元件(HSE)(参见图3)。已报道GCN-4和AP-1对活性氧有应答，尤其是已知AP-1是在大麦C-大麦醇溶蛋白启动子上对氮应答的必要元件(Muller，M.等，1993)。另外，在SWPA2启动子中有oct-1和C/EBP β这样的增强子元件。GCN-4有三处，AP-1有两处。特别地，在-1175到-1163区之间，有GCN-4和AP-1的反向重复序列(参见图3)。

本发明的SWPA2启动子的表达被包括氧化压力在内的各种外部因素强烈诱导。特别是，由于其在培养细胞中被强烈诱导，本发明的SWPA2启动子能够用于开发环境压力-耐受植物，和利用转化的植物细胞生产有用物质。

本发明的SWPA2启动子能够有效地在压力下诱导基因表达。对于这一点，本发明的启动子包含各种识别ABA、茉莉酸甲酯、受伤、低氧、热或氮这样的压力的转录因子。利用这些特征，其能够用于制备包含具有启动子活性的DNA序列和可操作地连接于该DNA序列的结构基因的融合基因构建体。因为该融合基因构建体包含与生产有用物质有关的结构基因和SWPA2启动子基因，并且在各种环境压力下，通过SWPA2启动子的调控表达有用物质，因此该融合基因构建体能够用于生产用于产生有用物质的转化的生物体。另外，如果在融合基因构建体中，结构基因与各种环境压力抗性有关，该融合基因构建体还可以用于生产外部压力抗性的压力-耐受生物体。

本发明的启动子在微生物以及植物中发挥作用，因此，该启动子能够用于开发转化的植物细胞、转化的植物和来源于其中的转化的愈伤组织，转化的微生物和转化的动物细胞。

另外，本发明提供了利用SWPA2启动子生产转化生物体的方法，该转化生物体可在各种环境压力下诱导有用物质的生产。

转化的生物体的制备方法包括以下步骤：

1)构建一种表达载体，其包含表现启动子活性的第一DNA序列，其中含有SEQ.ID NO.2代表的核酸序列或其部分，其可操作地与编码异源蛋白的第二DNA序列连接；

2)将上述表达载体导入宿主细胞；和

3)筛选导入该表达载体的宿主细胞。

在本发明的制备方法中，有用物质包含各种表现药理作用的蛋白质或肽，以及赋予转化体压力抗性的物质。因此，本发明的制备方法用于开发压力-耐受生物体和在转化生物体中生产有用物质。

实施例

本发明的实施的和目前优选实施方式如下列实施例所示举例说明。

然而，应当理解，本领域的技术人员在考虑这些公开的技术方案的基础上时，可以在本发明的实质和范围内作一些变更和改进。

实施例1：过氧化物酶基因组DNA分析

为了寻找过氧化物酶基因swpa2的基因组DNA，本发明人对swpa2基因进行Southern印迹分析，以确定其实际上存在于甘薯基因组中。通过

Dellaporta等的方法从培养的甘薯细胞提取15μg基因组DNA(Dellaporta，Newsletter，57，26-29，1983)，用限制性酶EcoRI，HincII和HindIII消化，然后进行琼脂糖凝胶电泳。将凝胶上的基因组DNA转移到尼龙膜上后，利用在swpa2基因的特定3’-端非翻译区上³²P标记的基因片段进行杂交(图1)。

如图1所示，检测到swpa2基因超过2条带。这意味着swpa2基因在单独的基因组中复数地存在。

实施例2：过氧化物酶基因组DNA的分离和测序分析

为了分离含有本发明的过氧化物酶基因swpa2的基因组DNA，本发明人进行了下列实验。

用λBlue STAR^TM BamHI Arms载体试剂盒(Novagen)制备甘薯的基因组DNA文库。之后，用swpa2-特异性引物对，以基因组DNA文库为模板进行PCR。扩增出0.5 kb的PCR产物，用³²P标记，然后用于甘薯中的过氧化物酶的基因组DNA文库的筛选。用Sambrook等的方法进行基因组DNA文库的筛选(分子克隆：实验室指南第2版1989)。三次文库筛选后，得到与swpa2具有相同开放读码框(ORF)的基因组DNA克隆，命名为天然SWPA2。

天然SWPA2具有SEQ.ID NO.1代表的约4 kb的核酸序列，由3个外显子，两个内含子和它的启动子区构成(图2)。已经证明其外显子的核酸序列与swpa2 cDNA序列的核酸序列完全相同。甘薯中过氧化物酶基因组克隆的第一内含子为737 bp，其大小比其它植物种的100到300 bp长很多，这两个内含子均遵循GT-AG规则，5’-端以GT开始，3’-端以AG结尾。

实施例3：过氧化物酶基因组DNA SWPA2的启动子分析

天然SWPA2的启动子由SEQ.ID NO.2代表的核酸序列从SWPA2基因的翻译起始位点到-1824 bp区组成(图3)。用计算机生物学和信息实验室(Computational Biology & Informatics Laboratory)的转录元件检索软件(TESS)分析SWPA2启动子的序列特征。

序列分析结果发现，SWPA2启动子含有真核生物启动子的调控元件，即用于转录起始的TATA盒和-895位的CAAT盒。还发现，SWPA2启动子在-445到-455区具有一个与NNNSACGTGNCM代表的G盒类似的基元，其是转录调控蛋白的结合位点区，能够被ABA、茉莉酸甲酯、UV、受伤和低氧所调控(Williams，M.等，1992)(参见图3)。组织特异性表达且能被压力诱导的转录因子SP-1位于SWPA2启动子G盒和转录起始位点之间。另外，还发现6个AAAATAA重复序列。

SWPA2启动子在-1170到-1188区还具有含有AGAAN共有序列的热激元件(heat shock element，HSE)(参见图3)。已知GCN-4和AP-1对反应性氧应答，并且尤其已知AP-1是在大麦的C-大麦醇溶蛋白启动子上对氮气应答的必要元件(Muller，M.等，1993)。另外，在SWPA2启动子中有oct-1和C/EBPβ这样的增强子元件。GCN-4有三处，AP-1有两处。特别地，在-1175和-1163区之间，有GCN-4和AP-1的反向重复序列(参见图3)。

结果是，本发明的SWPA2启动子含有包括反应性氧类在内的各种压力-识别元件，并且能够用于开发压力-耐受植物，和用于开发工业细胞系，以便在压力培养条件下生产有用物质。

实施例4：SWPA2启动子的缺失突变体的制备

为了制备SWPA2启动子的缺失突变体，本发明人用Ex Taq聚合酶(Takara)和序列-特异性引物进行PCR以扩增SWPA2启动子区。序列-特异性引物由SEQ.ID NO.4到8代表的上游引物和SEQ.ID NO.9代表的下游引物组成。构建的所有上游引物均含有SalI限制性酶切位点，下游引物含有BamHI限制性酶切位点。用引物对通过PCR扩增的缺失突变体分别为1824，1314，968，602和354bp(图4)。

用SalI/BamHI限制性酶消化得到的PCR产物后，将DNA片段亚克隆到含有GUS编码区和NOS转录终止子作为二元载体的pBI101质粒载体(Clontech)中。之后，制备质粒载体pBS 1824，pBS 1314，pBS968，pBS602和pBS354，使它们分别含有-1824，-1314，-968，-602和-354缺失构建体，然后将它们用于transit检测(transit assay)。

实施例5：用烟草原生质体进行SWPA2启动子的transit检测

用SWPA2启动子的缺失突变体如下述进行transit检测。

首先，将烟草BY-2(Nicotiana tabacum L.cv.Bright yellow 2)的悬浮培养细胞传代培养3天。之后，用含2％纤维素酶R-10和0.5％解析酶的酶溶液处理细胞3小时，以分离它们的原生质体。用聚乙二醇法将实施例4制备的缺失突变质粒载体转染进原生质体后，将原生质体在25℃黑暗中培养16小时。用Jefferson等的方法测定含有缺失突变质粒载体的原生质体的荧光(Plant Mol.Biol.Ref.，5，387-405，1987)。通过产生的GUS蛋白的量计算启动子活性。

transit检测结果发现，尤其当使用含-1314缺失构建体的SWPA2启动子时，与用CaMV 35S启动子的情况相比，GUS活性增加超过30倍(图5)。

实施例6：SWPA2启动子在酵母中的表达

为了研究SWPA2启动子是否在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达，本发明人使用酵母/大肠杆菌穿梭载体Yep352(Hill等，1986)和酿酒酵母L3262作为宿主。将每种含有实施例4制备的、与GUS基因和NOS终止子融合的SWPA2启动子的缺失突变体的质粒载体导入Yep352载体，然后将其用PEG和乙酸锂通过酵母转化法转化到酿酒酵母中。在SD/URA-培养基(minimal SD base-UraDO(略去)补充，Clontech)中培养转化酵母后，通过测定经实施例5同样方法制备的转化酵母产生的荧光，研究启动子活性。

结果是，对于导入-1314，-1620和-1824缺失构建体的转化的酵母，GUS活性比导入CaMV 35S启动子的转化的酵母的GUS活性分别增加1.6、1.4和8.4倍(图6)。

实施例7：用SWPA2启动子在转基因植物和其培养的细胞中的GUS表达

<7-1>实验植物和转基因植物的制备

应用烟草植物(Nicotiana tabacum cv.Xanthi)进行植物转化。将烟草用Agrobacterium fumefaciens LBA4404转化，该bacterium fumefaciensLBA4404分别导入含有SWPA2启动子的缺失突变体的质粒载体pBS1824(-1824缺失构建体)、pBS1314(-1314缺失构建体)和含有与CaMV 35S启动子融合的GUS基因的pBI121。通过在含有200mg/l卡那霉素和300mg/l头孢噻肟(claforan)的MS培养基中培养转化烟草来筛选转基因植物(Murashige T.等，Physiol Plant，15，473～497，1962)。生根发芽后，将转基因植物转移到小花盆中进行生长和用于实验。

为了考察SWPA2启动子的缺失突变体是否正确导入转基因植物，用SEQ.ID NO.9和10代表的NPTII引物对和SEQ.ID NO.11和12代表的启动子引物对进行PCR。在应用NPTII引物对的情况下，PCR进行如下30次循环：95℃1分钟，65℃1分钟，和72℃1分钟，在用启动子引物对的情况下，进行如下30次循环：95℃1分钟，62℃1分钟，和72℃1分钟。

结果如下，在转基因植物中，应用NPTII引物对检测到长度为0.7 kb的DNA片段，应用启动子引物对检测到长度为1.0 kb的DNA片段。因此，可以证明外源基因被正确地引入到转基因植物中。

<7-2>转化的细胞的制备

为了制备转化的细胞，将通过实施例<7-1>证实有基因引入的转基因植物的叶片培养在含有0.1mg/l BAP，2mg/l NAA和30g/l蔗糖的MS培养基中，诱导愈伤组织形成。其结果是，建立了从愈伤组织诱导的转化的烟草细胞系的悬浮培养。

用质粒载体pBS1314(-1314缺失构建体)转化的本发明的转基因烟草细胞于2000年10月16日保藏在韩国典型培养物收藏中心，韩国生命工学研究院，保藏号为：KCTC 0875BP。

<7-3>压力诱导的转基因植物中GUS表达的测定

为了考察转基因植物中，对外部环境压力响应而诱导的SWPA2启动子的表达模式，通过受伤、H₂O₂、或UV处理转基因植物后，测定压力诱导的GUS的活性。

首先，研究受伤条件下SWPA2启动子的表达模式，伤害转基因植物后，测定GUS活性。结果是，在导入含CaMV 35S启动子-GUS基因的pBI121载体的转基因植物中，GUS表达没有改变。然而，在导入pBS1824和pBS1314的转基因植物中，受伤处理3天后，GUS的表达增加(图7)。在pBS1314-转基因植物中，与未处理的对照植物相比，响应于受伤诱导的GUS表达增加约3.6倍。虽然pBS1824-转基因植物的GUS表达低于pBS1314转基因植物的表达，但是pBS1824-转基因植物的响应于受伤诱导的表达模式类似于pBS1314转基因植物的响应于受伤诱导的表达模式。

另外，为了考察H₂O₂处理的SWPA2启动子的表达模式，将从生长良好的叶片制备的7mm直径叶盘漂浮到1mM H₂O₂溶液中，然后在连续光照下培养。收获后，通过测定GUS活性，研究SWPA2启动子响应于H₂O₂处理响应而诱导的表达模式。

结果是，48小时培养后，pBS1314-转基因植物的GUS表达与未处理的对照相比增加5.8-倍，与CaMV 35S-转基因植物相比增加1.7-倍(图7)。对于引入了pBS1824载体的转基因植物，H₂O₂处理使GUS表达增加3.2-倍，与 CaMV 35S启动子转基因植物相比增加1.2倍。

而且，UV照射引入了基因组过氧化物酶基因SWPA2启动子的缺失突变体的转基因烟草，测定响应于UV而诱导的GUS活性。结果是，培养24小时后，pBS1314-转基因植物的GUS活性与未处理对照相比增加约5.6倍，与CaMV 35S启动子-转基因植物相比增加约1.2倍(图8)。在导入pBS1824载体的转基因植物中，UV照射使GUS表达增加2.5倍。

<7-4>愈伤组织和悬浮培养的GUS表达

为了考察本发明的SWPA2启动子的表达是否能够随着细胞生长而被调节，测定转化的愈伤组织的GUS活性，所述转化的愈伤组织来源于分别导入pBS1314、pBS1824和PBI121载体的转基因植物。

结果发现，pBS1314-转化的愈伤组织比pBI121-转化的愈伤组织GUS活性高4倍(图10a和10b)。

另外，作为来源于转化愈伤组织的悬浮培养细胞中GUS活性改变的研究结果，导入pBS1314，pBS1824和pBI121的转化愈伤组织彼此表现相同的生长模式，培养15天后达到平台期(图11a和11b)。pBI121-转化细胞维持与细胞生长无关的相对较低的GUS表达水平。pBS1824-转化细胞也维持与细胞生长无关的恒定的GUS表达水平，但其GUS表达水平比pBI121-转化细胞的高。另一方面，对于pBS1314-转化的细胞，在培养的5和7天，GUS表达水平较低，但培养7天后，GUS表达迅速增加。培养15天后，观察到GUS的表达水平最高，一直维持到培养期末。

工业实用性

本发明提供了一种新的来源于甘薯的过氧化物酶基因组基因SWPA2及其启动子，该启动子在环境压力条件下强烈表达。本发明的全部或部分启动子用于开发抗环境压力的压力-耐受植物和能够大规模生产有用物质的包括细胞、植物、微生物等在内的转化生物体。

本领域技术人员将能够理解，前面说明书公开的构思和具体实施方式可以方便地用来作为基础，以便修改或设计其它实施方式，而同样实现本发明的目的。本领域的技术人员将还能理解上述这些等价的实施方式并没有偏离所附的权利要求书中所要求保护的本发明的精神和范围。

序列表

<110>韩国生命工学研究院

<120>来源于甘薯的过氧化物酶基因组基因及其启动子

<130>2fpo-02-16

<160>13

<170>KOPATIN 1.0

<210>1

<211>3742

<212>DNA

<213>甘薯

<400>1

ttaatttcaa tattttgtct gtattttttt tttagtacta ctcatgtcaa atcctgttac 60

atataaaata tgttcaaatt cactgaaact caaatctata acctcttatt tgatagagtc 120

actctataca actagaccac ggaattgtca actagaccac ggaattgtta gcttgtttat 180

tgtattcacg tataattttg atgaatatca tcaactttga cgggcaaaat agatagcatg 240

tggcggccac agtttcaaaa ttcatacaag atgtcaaggg gaccggcccg gtggctgcgt 300

gcatatcacg tgcaagattt gtgaaattct ttctagattc cttttatcct tttcttcttt 360

cttgaaaaaa tagaaacaga aattatatgt aaataaaata ataataatat ggtttccata 420

ctctatagca tatcatatgg tgcattgcac atatttcatc gacaaagaaa gccacggtgc 480

agacgctcga ttttgacatt ttacaactta caaggccatg atcagatcga taataccaaa 540

tggtaccacc taactaggtg atatatatta tgtatgtcat tattttaaac tgtattacaa 600

agactatttt ttcattaatt ggtacaaaga aaaattaaac agaaaagaaa ggaaaaaatg 660

actcaccacc tagcacctag acacctagac accaagtacc caaaccctct attttcaaca 720

tctattttca gatgtaaata tgagttggac gaagaaggtg ttagcaatta tttgattaat 780

cttgctacga taattatgat ccactcactt agtcattttt ttcagaccaa gacaactagc 840

ttgagttttt tattgtatgt ggtcggaacg ttttttgtaa ttaaaaaaat aaaagttgca 900

tcattatata tggtagatta agtaattgat caatcaacgt ttaattttgc atttatcggc 960

aaggtggagg ttcnaacttc cagtcgaact tagagagtca ttggagacct tgaccagtta 1020

actagcggtg tcgaaaacct gcacaacttg agatttaatt gcataccttt tatatatgac 1080

gcgttttatt tttttttcct agaaaataat ttggaagaaa ataagaatat gtattctgtg 1140

aaagctaggc caaaacgaat gtcttttcgt cgttttcgtt aaaggtttag atcatatttc 1200

atctggtcca acactcaaac ttgtataatg gacgaattat tagtcatttt agacctaccg 1260

gctagcgcga cttttttgtt ttccataaag attcgataat tgcatggcca gatgcaaagt 1320

ttgaaattta atgtttgcca aatcctatca tacaccacaa cacatgtctc agggccaagt 1380

ggcaccagca aacattcctg tcataattaa tttttttaat gagaaggagg aaactcacag 1440

ctattactcg aaggtatata atattgagta aatcttactt tgtgattcta gttgacaaaa 1500

caccgcaaga taaactatac taagttcaaa tcacctcacc gggttggctc agattggttt 1560

tttcaataca agagggggtg tgaactcccg tgccgacctc ttttgaggga caataatgta 1620

cggtcacgcc aaccaagctt gattttttnt gacaaatata ttactacata tattacacgg 1680

tcaaataatt aatcaaaaaa taaaaaaaga ccccaattaa agtccccaac cactctcaaa 1740

tattctattt aagggaaacc ttagaggcaa ttcatgcatc ctcaacccct tcttcttcat 1800

tttcttaatc ttacattttc ctttgaccat ggcttccatt gtgagtcggc tcagtcttgc 1860

gctaagcctc atagctctag ctctagctgg ctactccatt taccagcaca cacagtcagc 1920

catggagagc cagcccatca aggctctccc ggcgtggcta cagctcccca cgttccaatc 1980

tgccaacgtg ttatcgtatt atccgagtgg ccgcaaatcc tcccccgccg gcatgctttc 2040

cgacgaagct tgcgtgttct ccgccgttaa agaagttgtc gacgccgcca tcgataacga 2100

aactcgcatg ggggcttccc tcattcgtct cttcttccac gattgctttg tcgatgtacg 2160

tatagtatac atataattat gtaaaaccta tatatatata tatatatata tatatacatg 2220

cacaaaaagt ttataatact aatatatacc catacttttt gcatatcatt atatatatta 2280

acacgattat attaaaaacc aataatatat tatatatata tatatagtta actatctttt 2340

ctttcacttt cttatcactt tttaaattgt taaatctaaa aattaattgt tattttattg 2400

aattttttct attttctatt ttgtttaaag acttaattat actattattt aactgggctg 2460

gtaactttcc gtcaatattg tttatttaac aattgtaaca attaaaacca attgtaacaa 2520

tagtacgtaa aagatcaaag tgacataaac cagcttaagt tttttaaatg gacgaactca 2580

aaacaaaaaa gtcaatatgt aatttcggta gagaagtcaa atttaaaatt tcatagttat 2640

caaatcaatt gttttatcaa cccagctagg ttgnctattt caaaaactaa ttagacattg 2700

gtgtgcatga aacattacgt taaaacaaaa gtcatcaccc acctcgtctt ataattggtg 2760

tacctaagtt atcacacgtt cctgtcgaac ttacacgcca aacatgtcaa tatgtcaaat 2820

gctttaatga aaaatattat tagattatta tttatctaat actaaatttt cttcttcgta 2880

aaaatttgtg tgtattaggt tgtgatgcag ggcttctttt gaatgatacg gcgacgttca 2940

caggggaaca aactgcattt ggcaatctta attccgtgag agggtttgag gttatagaac 3000

aagctaaaca gaatgcagta gctaaatgtg ccgatacacc cgtatcttgt gctgacattt 3060

tatctattgc tgctcgtgat tctttcgaac gggtaagtct tcaatatcgt gtataagtgt 3120

tactaataat gtcaatatgt tacatgtaga catgtattta tttattttct ttgtatttac 3180

attcaacagt ttagtggagc aacatacact gtgactttag ggcgactcga tgcgagaacc 3240

gcgaacttaa ccggagctaa tacccagctt gtcggaccat cggaaaactt gactgaacaa 3300

gtcaggaaat ttggcatcaa aggatttaac gagagggaat tggtcgcctt gttgggttca 3360

cacacgctag ggtttgccag atgtccggtt ttatgtgaca acagaaacat taacccggtt 3420

cgggtccccg gtctgcaatg caactgtcct gtaactaata ctgacccggg tttggtcggg 3480

ctggacccca cacccgatac attcgaccaa cgttattact ctgacctagt cagcggccaa 3540

ggcctcctgt tttccgacca acagctgatg aacagcacca ccaccagcga cgccgtgacg 3600

acgtaccgtg actccataga caccttcctt gccgacttcg ccgccgccat ggtcaagatg 3660

agcaacctgc ctccgtccgc cggagttgag ctcgaaatcc gtgacgtctg cagccgggtg 3720

aatgacgtct ctgttgcatc cg 3742

<210>2

<211>1828

<212>DNA

<213>甘薯

<400>2

ttaatttcaa tattttgtct gtattttttt tttagtacta ctcatgtcaa atcctgttac 60

atataaaata tgttcaaatt cactgaaact caaatctata acctcttatt tgatagagtc 120

actctataca actagaccac ggaattgtca actagaccac ggaattgtta gcttgtttat 180

tgtattcacg tataattttg atgaatatca tcaactttga cgggcaaaat agatagcatg 240

tggcggccac agtttcaaaa ttcatacaag atgtcaaggg gaccggcccg gtggctgcgt 300

gcatatcacg tgcaagattt gtgaaattct ttctagattc cttttatcct tttcttcttt 360

cttgaaaaaa tagaaacaga aattatatgt aaataaaata ataataatat ggtttccata 420

ctctatagca tatcatatgg tgcattgcac atatttcatc gacaaagaaa gccacggtgc 480

agacgctcga ttttgacatt ttacaactta caaggccatg atcagatcga taataccaaa 540

tggtaccacc taactaggtg atatatatta tgtatgtcat tattttaaac tgtattacaa 600

agactatttt ttcattaatt ggtacaaaga aaaattaaac agaaaagaaa ggaaaaaatg 660

actcaccacc tagcacctag acacctagac accaagtacc caaaccctct attttcaaca 720

tctattttca gatgtaaata tgagttggac gaagaaggtg ttagcaatta tttgattaat 780

cttgctacga taattatgat ccactcactt agtcattttt ttcagaccaa gacaactagc 840

ttgagttttt tattgtatgt ggtcggaacg ttttttgtaa ttaaaaaaat aaaagttgca 900

tcattatata tggtagatta agtaattgat caatcaacgt ttaattttgc atttatcggc 960

aaggtggagg ttcnaacttc cagtcgaact tagagagtca ttggagacct tgaccagtta 1020

actagcggtg tcgaaaacct gcacaacttg agatttaatt gcataccttt tatatatgac 1080

gcgttttatt tttttttcct agaaaataat ttggaagaaa ataagaatat gtattctgtg 1140

aaagctaggc caaaacgaat gtcttttcgt cgttttcgtt aaaggtttag atcatatttc 1200

atctggtcca acactcaaac ttgtataatg gacgaattat tagtcatttt agacctaccg 1260

gctagcgcga cttttttgtt ttccataaag attcgataat tgcatggcca gatgcaaagt 1320

ttgaaattta atgtttgcca aatcctatca tacaccacaa cacatgtctc agggccaagt 1380

ggcaccagca aacattcctg tcataattaa tttttttaat gagaaggagg aaactcacag 1440

ctattactcg aaggtatata atattgagta aatcttactt tgtgattcta gttgacaaaa 1500

caccgcaaga taaactatac taagttcaaa tcacctcacc gggttggctc agattggttt 1560

tttcaataca agagggggtg tgaactcccg tgccgacctc ttttgaggga caataatgta 1620

cggtcacgcc aaccaagctt gattttttnt gacaaatata ttactacata tattacacgg 1680

tcaaataatt aatcaaaaaa taaaaaaaga ccccaattaa agtccccaac cactctcaaa 1740

tattctattt aagggaaacc ttagaggcaa ttcatgcatc ctcaacccct tcttcttcat 1800

tttcttaatc ttacattttc ctttgacc 1828

<210>3

<211>12

<212>PRT

<213>甘薯

<400>3

Asn Asn Asn Ser Ala Cys Gly Thr Gly Asn Cys Met

1 5 10

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物1

<400>4

acgcgtcgac cttactttgt gattcta 27

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物2

<400>5

acgcgtcgac aatggacgaa ttattagt 28

<210>6

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物3

<400>6

acgcgtcgac ggtcggaacg tttttt 26

<210>7

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物4

<400>7

acgcgtcgac ccatgatcag atcgata 27

<210>8

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物5

<400>8

acgcgtcgac aatattttgt ctgtatt 27

<210>9

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物1

<400>9

cgggatccgg tcaaaggaaa at 22

<210>10

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>NPTII引物1

<400>10

gaggctat tc ggctagatg 19

<210>11

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>NPTII引物2

<400>11

atcgggagcg gcgataccgt 21

<210>12

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>启动子引物1

<400>12

ccattgatca gatcgata 18

<210>13

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>启动子引物2

<400>13

ggtcaaagga aaatgtaag 19

Claims

1.一种基因组DNA序列，其由SEQ.ID NO.1所代表的核酸序列组成，其编码由swpa2基因编码的过氧化物酶。

2.一种表现启动子活性的DNA序列，其由SEQ.ID NO.2代表的核酸序列或使用由SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9代表的引物通过PCR扩增SEQ ID NO：2的缺失突变体1314组成。

3.按照权利要求2的表现启动子活性的DNA序列，其中DNA序列含有转录因子，所述转录因子选自由G-盒，SP-1，热休克元件HSE，GCN-4和激活蛋白-1组成的组。

4一种诱导权利要求2的DNA序列的启动子活性的方法，其中通过

环境压力诱导启动子活性。

5.按照权利要求4的方法，其中环境压力是选自由受伤、反应性氧类、H₂O₂、受热、潮湿、温度、盐、空气污染、UV光和重金属组成的组。

6.DNA构建体，包含权利要求2的第一DNA序列，其可操作地连接到一个编码异源蛋白质的第二DNA序列。

7.一种制备生产异源蛋白的转化的生物体的方法，包括以下步骤：

1)构建一种表达载体，其包含一个权利要求2的第一DNA序列，该第一DNA序列可操作地连接到一个编码异源蛋白的第二DNA序列；

2)将上述表达载体导入宿主细胞；和

3)筛选转移了表达载体的宿主细胞。

8.按照权利要求7的制备方法，其中异源蛋白质为GUS蛋白。

9.按照权利要求7的制备方法，其中宿主细胞是植物细胞或微生物。

10.按照权利要求7的制备方法，其中转化的生物体是微生物、植物细胞、植物或来源于其的愈伤组织。

11.通过权利要求7的制备方法制备的转化的烟草细胞，其保藏号为KCTC 0875BP。