JP2001169790A - さつまいも由来の新規ぺルオキシダーゼ遺伝子及びそのプロモーター - Google Patents
さつまいも由来の新規ぺルオキシダーゼ遺伝子及びそのプロモーターInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 さつまいも植物体由来の培養細胞から環境ス
トレス条件下で強く発現が誘発されるさつまいもぺルオ
キシダーゼ（ＰＯＤ）をコードする新規な遺伝子及びそ
のプロモーターを提供する。 【解決手段】 さつまいも（Ipomoea batatas ）植物体
由来の培養細胞から環境ストレス条件で強く発現が誘発
されるさつまいもぺルオキシダーゼをコードするＤＮＡ
及びそのプロモーターを提供する。 【効果】 ぺルオキシダーゼ遺伝子のプロモーターの全
体又はその一部は、細胞、植物体、微生物及びバクテリ
アなどの形質転換体の開発に利用され、環境ストレスに
対して耐性を有する耐性生物体開発と有用成分を大量に
生産することができる形質転換生物体の開発に利用でき
る。
トレス条件下で強く発現が誘発されるさつまいもぺルオ
キシダーゼ（ＰＯＤ）をコードする新規な遺伝子及びそ
のプロモーターを提供する。 【解決手段】 さつまいも（Ipomoea batatas ）植物体
由来の培養細胞から環境ストレス条件で強く発現が誘発
されるさつまいもぺルオキシダーゼをコードするＤＮＡ
及びそのプロモーターを提供する。 【効果】 ぺルオキシダーゼ遺伝子のプロモーターの全
体又はその一部は、細胞、植物体、微生物及びバクテリ
アなどの形質転換体の開発に利用され、環境ストレスに
対して耐性を有する耐性生物体開発と有用成分を大量に
生産することができる形質転換生物体の開発に利用でき
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は新規なプロモーター
及びぺルオキシダーゼ遺伝子に関する。
及びぺルオキシダーゼ遺伝子に関する。
【０００２】植物を含めて大部分の生物は、病原菌、害
虫、ビールスなどの生物学的ストレスだけでなく、地球
環境悪化によって起こる各種の環境ストレスを受ける。
これらのストレスにより、生命の維持に必要な必修要素
であるが、反応性の高い酸素は、深刻な生理的障害など
を誘発するスーパーオキシドアニオンラジカル
（０2 -）、過酸化水素（Ｈ2 Ｏ2 ）、ヒドロキシラジカ
ルなどの活性酸素種（ＲＯＳ）に変わる。従って、生体
内では、このような活性酸素を除去するシステムとし
て、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ：ＥＣ１．
１５．１１）、ぺルオキシダーゼ（以下「ＰＯＤ」とす
る）、カタラーゼ（ＣＡＴ）などの高分子抗酸化酵素及
びビタミンＣ、ビタミンＥ、グルタチオンなどの抗酸化
物などが多く存在する。
虫、ビールスなどの生物学的ストレスだけでなく、地球
環境悪化によって起こる各種の環境ストレスを受ける。
これらのストレスにより、生命の維持に必要な必修要素
であるが、反応性の高い酸素は、深刻な生理的障害など
を誘発するスーパーオキシドアニオンラジカル
（０2 -）、過酸化水素（Ｈ2 Ｏ2 ）、ヒドロキシラジカ
ルなどの活性酸素種（ＲＯＳ）に変わる。従って、生体
内では、このような活性酸素を除去するシステムとし
て、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ：ＥＣ１．
１５．１１）、ぺルオキシダーゼ（以下「ＰＯＤ」とす
る）、カタラーゼ（ＣＡＴ）などの高分子抗酸化酵素及
びビタミンＣ、ビタミンＥ、グルタチオンなどの抗酸化
物などが多く存在する。
【０００３】ぺルオキシダーゼは、電子供与体の存在下
で、過酸化水素を還元する酵素として植物細胞に広く分
布するものとして知られている。ぺルオキシダーゼは酵
素反応に敏感なために各種臨床試験用試薬として用いら
れるなど、商業的に重要な酵素としてだけでなく、植物
体が各種の外部からのストレスに対応する場合の大切な
役割を果たすので、高い関心がもたれている。一般に植
物培養細胞は高い酸化的ストレス下で培養されるので、
ペルオキシダーゼ活性が極めて高い。そのなかでも、さ
つまいも培養細胞はいままで報告されたどの植物体の培
養細胞よりもぺルオキシダーゼを大量に生産することが
報告されている。（Phytochemistry, 39, 981-984(199
5) ）
で、過酸化水素を還元する酵素として植物細胞に広く分
布するものとして知られている。ぺルオキシダーゼは酵
素反応に敏感なために各種臨床試験用試薬として用いら
れるなど、商業的に重要な酵素としてだけでなく、植物
体が各種の外部からのストレスに対応する場合の大切な
役割を果たすので、高い関心がもたれている。一般に植
物培養細胞は高い酸化的ストレス下で培養されるので、
ペルオキシダーゼ活性が極めて高い。そのなかでも、さ
つまいも培養細胞はいままで報告されたどの植物体の培
養細胞よりもぺルオキシダーゼを大量に生産することが
報告されている。（Phytochemistry, 39, 981-984(199
5) ）
【０００４】
【従来技術】今までに西洋芥子大根、麦、小麦、油菜、
煙草、菠薐草、稲など約２０種の植物に由来する一部の
植物のぺルオキシダーゼ同位酵素をコードする遺伝子が
知られていた。さつまいものぺルオキシダーゼ遺伝子に
ついては、本発明者によってはじめて分離され、報告さ
れた。さつまいも培養細胞から分離された酸性ぺルオキ
シダーゼｓｗｐａｌ及び中性ぺルオキシダーゼｓｗｐｎ
ｌ遺伝子はさつまいもの培養細胞と植物体の幹で特異的
に発現し、ゲノム内に複数で存在する特徴があり、この
全体または一部を細胞植物体に形質転換させることによ
って、ぺルオキシダーゼを安定的に大量生産することが
できることを報告した。（Mol Gen Genet, 225, 382-39
1(1997) ）
煙草、菠薐草、稲など約２０種の植物に由来する一部の
植物のぺルオキシダーゼ同位酵素をコードする遺伝子が
知られていた。さつまいものぺルオキシダーゼ遺伝子に
ついては、本発明者によってはじめて分離され、報告さ
れた。さつまいも培養細胞から分離された酸性ぺルオキ
シダーゼｓｗｐａｌ及び中性ぺルオキシダーゼｓｗｐｎ
ｌ遺伝子はさつまいもの培養細胞と植物体の幹で特異的
に発現し、ゲノム内に複数で存在する特徴があり、この
全体または一部を細胞植物体に形質転換させることによ
って、ぺルオキシダーゼを安定的に大量生産することが
できることを報告した。（Mol Gen Genet, 225, 382-39
1(1997) ）
【０００５】また、本発明者はさつまいもから酸性ぺル
オキシダーゼ遺伝子ｓｗｐａ２（GeneBank Accession
No. AF109124 ）及びｓｗｐａ３ ｃＤＮＡ（GeneBan
k Accession No. AF109123 ）を分離し、その塩基配列
を明らかにした。これらの塩基配列によると、ｓｗｐａ
２は７１個のシグナルペプチドを含み、そしてｓｗｐａ
３は、６６個のシグナルペプチドを含み、ｓｗｐａ２及
びｓｗｐａ３は各々３５８個及び３４９個のアミノ酸を
コードする１２４６ｂｐ及び１３１０ｂｐの大きさの塩
基配列をもつ。ｓｗｐａ２及びｓｗｐａ３によって発現
される成熟蛋白質の等電点は各々４．１及び４．３であ
り、このことは上記の遺伝子の全てが酸性ぺルオキシダ
ーゼをコードすることを示す。この３’−末端非飜訳領
域には、典型的なポリアデニル化シグナルのＡＡＵＡＡ
Ａ及びポリ（Ａ）テールが存在し、特に、ｓｗｐａ２遺
伝子のＮ−末端配列は、さつまいも培養細胞の主成分同
位酵素（Ａ−２）と完全に一致した。また、本発明者は
ｓｗｐａ２遺伝子は、さつまいも植物体の葉に傷を負わ
せるかまたは低温処理またはオゾン処理を施した場合に
は強く発現が誘発されたこと、一方ではｓｗｐａ３遺伝
子は植物体の葉に傷を負わせた場合には弱く発現された
が、低温処理またはオゾン処理を施した場合には強く発
現が誘発されたことを明らかにした。(Mol. Gen. Gene
t., 261, 941-947, 1999)
オキシダーゼ遺伝子ｓｗｐａ２（GeneBank Accession
No. AF109124 ）及びｓｗｐａ３ ｃＤＮＡ（GeneBan
k Accession No. AF109123 ）を分離し、その塩基配列
を明らかにした。これらの塩基配列によると、ｓｗｐａ
２は７１個のシグナルペプチドを含み、そしてｓｗｐａ
３は、６６個のシグナルペプチドを含み、ｓｗｐａ２及
びｓｗｐａ３は各々３５８個及び３４９個のアミノ酸を
コードする１２４６ｂｐ及び１３１０ｂｐの大きさの塩
基配列をもつ。ｓｗｐａ２及びｓｗｐａ３によって発現
される成熟蛋白質の等電点は各々４．１及び４．３であ
り、このことは上記の遺伝子の全てが酸性ぺルオキシダ
ーゼをコードすることを示す。この３’−末端非飜訳領
域には、典型的なポリアデニル化シグナルのＡＡＵＡＡ
Ａ及びポリ（Ａ）テールが存在し、特に、ｓｗｐａ２遺
伝子のＮ−末端配列は、さつまいも培養細胞の主成分同
位酵素（Ａ−２）と完全に一致した。また、本発明者は
ｓｗｐａ２遺伝子は、さつまいも植物体の葉に傷を負わ
せるかまたは低温処理またはオゾン処理を施した場合に
は強く発現が誘発されたこと、一方ではｓｗｐａ３遺伝
子は植物体の葉に傷を負わせた場合には弱く発現された
が、低温処理またはオゾン処理を施した場合には強く発
現が誘発されたことを明らかにした。(Mol. Gen. Gene
t., 261, 941-947, 1999)
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的はさつま
いも由来のぺルオキシダーゼのゲノムＤＮＡ及びその塩
基配列を提供することである。
いも由来のぺルオキシダーゼのゲノムＤＮＡ及びその塩
基配列を提供することである。
【０００７】本発明のさらなる目的は多様な環境ストレ
スによって遺伝子の発現が強く誘発されるプロモータを
提供することである。
スによって遺伝子の発現が強く誘発されるプロモータを
提供することである。
【０００８】本発明のさらなる目的は多様な環境ストレ
スに対して耐性を有する形質転換体及びその製造方法を
提供することである。
スに対して耐性を有する形質転換体及びその製造方法を
提供することである。
【０００９】本発明のさらなる目的は有用成分を大量に
生産することができる形質転換体及びその製造方法を提
供することである。
生産することができる形質転換体及びその製造方法を提
供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本明細書に記載された用
語、技術などは、特別な限定がない限り、本発明が属す
る技術分野で一般的に使用されている意味で使用する。
また、本明細書に記載されている文献はすべて本発明を
説明するためのものとして記載する。
語、技術などは、特別な限定がない限り、本発明が属す
る技術分野で一般的に使用されている意味で使用する。
また、本明細書に記載されている文献はすべて本発明を
説明するためのものとして記載する。
【００１１】本発明で用いる用語「塩基配列の変異体」
は、生物学的活性を維持しながらｓｗｐａ２、ＳＷＰＡ
２、またはＳＷＰＡ２プロモーターの塩基配列で一つ以
上の塩基が置換、欠失または付加されて変更された塩基
配列を意味する。
は、生物学的活性を維持しながらｓｗｐａ２、ＳＷＰＡ
２、またはＳＷＰＡ２プロモーターの塩基配列で一つ以
上の塩基が置換、欠失または付加されて変更された塩基
配列を意味する。
【００１２】用語「塩基配列の変異体」はｓｗｐａ２に
よってコードされるぺルオキシダーゼ活性を有し、ｓｗ
ｐａ２によってコードされるアミノ酸配列の中で一つ以
上のアミノ酸が置換、欠失、付加されたアミノ酸配列を
意味する。
よってコードされるぺルオキシダーゼ活性を有し、ｓｗ
ｐａ２によってコードされるアミノ酸配列の中で一つ以
上のアミノ酸が置換、欠失、付加されたアミノ酸配列を
意味する。
【００１３】用語「ＳＷＰＡ２プロモーター」は配列番
号１の１〜１３１４の塩基配列を含み、作動可能に連結
された遺伝子に適切な条件下で転写活性を付与する塩基
配列を意味する。
号１の１〜１３１４の塩基配列を含み、作動可能に連結
された遺伝子に適切な条件下で転写活性を付与する塩基
配列を意味する。
【００１４】用語「ＳＷＰＡ２プロモーターの活性断
片」は、配列番号１の１〜１８２４の塩基配列の中の一
部を含み、作動可能に連結された遺伝子にＳＷＰＡ２プ
ロモータ活性を付与する塩基序列を意味する。
片」は、配列番号１の１〜１８２４の塩基配列の中の一
部を含み、作動可能に連結された遺伝子にＳＷＰＡ２プ
ロモータ活性を付与する塩基序列を意味する。
【００１５】用語「形質転換体」は、ＳＷＰＡ２プロモ
ーターと、これと作動可能に連結され、有用物質をコー
ドするＤＮＡ配列からなるＤＮＡ構造体によって形質転
換された細胞または植物体を意味する。本発明において
形質転換体としては、形質転換された微生物、動物細
胞、植物細胞、形質転換された動物または植物体及びこ
れらに由来した培養細胞などを含む。
ーターと、これと作動可能に連結され、有用物質をコー
ドするＤＮＡ配列からなるＤＮＡ構造体によって形質転
換された細胞または植物体を意味する。本発明において
形質転換体としては、形質転換された微生物、動物細
胞、植物細胞、形質転換された動物または植物体及びこ
れらに由来した培養細胞などを含む。
【００１６】用語「環境ストレス」は、対象生物にスト
レスとして作用する生物的または微生物的ストレスを意
味し、例えば損傷又は創傷（怪我）、活性酸素種、熱、
水分、温度、塩、大気汚染、紫外線、重金属などによる
ストレスを意味する。
レスとして作用する生物的または微生物的ストレスを意
味し、例えば損傷又は創傷（怪我）、活性酸素種、熱、
水分、温度、塩、大気汚染、紫外線、重金属などによる
ストレスを意味する。
【００１７】以下に本発明を詳細に説明する。本発明は
さつまいも由来のぺルオキシダーゼ遺伝子をコードする
ゲノム遺伝子ＳＷＰＡ２及びその塩基塩基配列を提供す
る。
さつまいも由来のぺルオキシダーゼ遺伝子をコードする
ゲノム遺伝子ＳＷＰＡ２及びその塩基塩基配列を提供す
る。
【００１８】本発明のＳＷＰＡ２は、配列番号１で示さ
れる塩基配列全体またはその一部からなる、さつまいも
ぺルオキシダーゼｓｗｐａ２をコードするエキソンを含
むＤＮＡ配列である。
れる塩基配列全体またはその一部からなる、さつまいも
ぺルオキシダーゼｓｗｐａ２をコードするエキソンを含
むＤＮＡ配列である。
【００１９】上記ＳＷＰＡ２は、さつまいもゲノムＤＮ
Ａライブラリから３次スクリーニングによってｓｗｐａ
２と読み取り枠（ＯＲＦ）が同一なゲノムクローンとし
て選別され、これを天然ＳＷＰＡ２と名付けた。 (図２
参照)
Ａライブラリから３次スクリーニングによってｓｗｐａ
２と読み取り枠（ＯＲＦ）が同一なゲノムクローンとし
て選別され、これを天然ＳＷＰＡ２と名付けた。 (図２
参照)
【００２０】天然ＳＷＰＡは３個のエキソンと２個のイ
ントロン及びプロモータ領域からなり、上記エキソンの
塩基配列はｓｗｐａ２ ｃＤＮＡ（GeneBank Accessio
n No. AF109124）の塩基配列と完全に一致した。さつま
いもぺルオキシダーゼゲノムクローンは２個のイントロ
ンの中で特に一番目のイントロンが７３７ｂｐであり、
ほかの植物種が１００〜３００であると比べて極めて長
いイントロンを含んでおり、各々のイントロンは５’側
がＧＴで始まり３’側がＡＧで終るＧＴ−ＡＧの法則に
したがっている。
ントロン及びプロモータ領域からなり、上記エキソンの
塩基配列はｓｗｐａ２ ｃＤＮＡ（GeneBank Accessio
n No. AF109124）の塩基配列と完全に一致した。さつま
いもぺルオキシダーゼゲノムクローンは２個のイントロ
ンの中で特に一番目のイントロンが７３７ｂｐであり、
ほかの植物種が１００〜３００であると比べて極めて長
いイントロンを含んでおり、各々のイントロンは５’側
がＧＴで始まり３’側がＡＧで終るＧＴ−ＡＧの法則に
したがっている。
【００２１】また、本発明は多様な環境ストレスによっ
て遺伝子の発現が誘発されるプロモーターを提供する。
て遺伝子の発現が誘発されるプロモーターを提供する。
【００２２】本発明において特に限定しない限りＳＷＰ
Ａ２プロモータはＳＷＰＡ２プロモーター及びその活性
断片を含む意味で用いられる。
Ａ２プロモータはＳＷＰＡ２プロモーター及びその活性
断片を含む意味で用いられる。
【００２３】本発明において、ＳＷＰＡ２プロモーター
は配列番号２で示される塩基配列全体またはその一部か
らなり、プロモーター活性を示すＤＮＡ配列からなる。
例えば、本発明では、ＳＷＰＡ２プロモーターは望まし
くは配列番号２の塩基配列の中で１〜１３１４の塩基配
列またはその一部からなり、プロモーター活性を示すＤ
ＮＡ配列からなる。
は配列番号２で示される塩基配列全体またはその一部か
らなり、プロモーター活性を示すＤＮＡ配列からなる。
例えば、本発明では、ＳＷＰＡ２プロモーターは望まし
くは配列番号２の塩基配列の中で１〜１３１４の塩基配
列またはその一部からなり、プロモーター活性を示すＤ
ＮＡ配列からなる。
【００２４】本発明によるプロモーターは、環境ストレ
スによって強く発現し、さつまいも由来のぺルオキシダ
ーゼゲノム遺伝子の天然ＳＷＰＡ２に由来する。
スによって強く発現し、さつまいも由来のぺルオキシダ
ーゼゲノム遺伝子の天然ＳＷＰＡ２に由来する。
【００２５】天然ＳＷＰＡ２は、翻訳開始点の上流にプ
ロモーター領域を有しているが、これをＳＷＰＡ２プロ
モーターと名付けた。ＳＷＰＡ２プロモーター領域はコ
ンピューターバイオロジカル エンド インホーマティ
ックス ラボラトリー（Computational Biology & Inf
ormatics Laboratory ）のトランスクリプション エレ
メント サーチ ソフトウエアー（Transcription Elem
ent Search Software）を用いて塩基配列上の特性を分
析した結果、上記の配列番号２で示された塩基配列から
なっており、転写開始のためのＴＡＴＡボックスと−８
９５部位にＣＡＡＴボックスを有する。（図３参照）
ロモーター領域を有しているが、これをＳＷＰＡ２プロ
モーターと名付けた。ＳＷＰＡ２プロモーター領域はコ
ンピューターバイオロジカル エンド インホーマティ
ックス ラボラトリー（Computational Biology & Inf
ormatics Laboratory ）のトランスクリプション エレ
メント サーチ ソフトウエアー（Transcription Elem
ent Search Software）を用いて塩基配列上の特性を分
析した結果、上記の配列番号２で示された塩基配列から
なっており、転写開始のためのＴＡＴＡボックスと−８
９５部位にＣＡＡＴボックスを有する。（図３参照）
【００２６】転写調節蛋白質の付着部位として、ＡＢ
Ａ、メチルジャスモネート(methyljasmonate)、紫外
線、損傷又は創傷、低酸素症などによって調節されるこ
とが知られている（Williams, M, et al. 1992）Ｇボッ
クスは、ＮＮＮＳＡＣＧＴＧＮＣＭと記載されたアミノ
酸配列を有するが、ＳＷＰＡ２プロモーター領域の−４
４５及び−４５５部位にこれと類似な領域（モティー
フ）が存在する。（図３参照) 天然ＳＷＰＡ２のプロモ
ーター領域内のＧボックスと転写開始点との間には、組
織特異的に発現されストレスによって発現が誘発される
転写因子であると明らかにされた(Gidoni, D. et al.,
1994) ＳＰ−１が存在していて、それ以外にもＡＡＡＡ
ＴＡＡの反復配列が６個存在する。
Ａ、メチルジャスモネート(methyljasmonate)、紫外
線、損傷又は創傷、低酸素症などによって調節されるこ
とが知られている（Williams, M, et al. 1992）Ｇボッ
クスは、ＮＮＮＳＡＣＧＴＧＮＣＭと記載されたアミノ
酸配列を有するが、ＳＷＰＡ２プロモーター領域の−４
４５及び−４５５部位にこれと類似な領域（モティー
フ）が存在する。（図３参照) 天然ＳＷＰＡ２のプロモ
ーター領域内のＧボックスと転写開始点との間には、組
織特異的に発現されストレスによって発現が誘発される
転写因子であると明らかにされた(Gidoni, D. et al.,
1994) ＳＰ−１が存在していて、それ以外にもＡＡＡＡ
ＴＡＡの反復配列が６個存在する。
【００２７】また、天然ＳＷＰＡ２のプロモーター領域
は、配列番号２の塩基配列内−１１７０と−１１８８と
の間にＡＧＡＡＮの共通配列を有する熱衝撃に反応する
転写因子のＨＳＥ（heat shock element）を有してい
る。（図３参照) ＧＣＮ−４及びＡＰ−１は活性酸素種
などに反応するものと知られ、特にＡＰ−１は麦Ｃ−ホ
ルデニンプロモーターで窒素に反応する重要要素として
知られている。（Muller, M . et al., 1993 ）さら
に、天然ＳＷＰＡ２のプロモーター領域にはＧＮ−４が
３部位にそしてＡＰ−１が２部位に存在する。特に、−
１１７５０と−１１６３との間にはＧＣＮ−４及びＡＰ
−１が逆方向反復塩基配列で存在する。（図３参照）
は、配列番号２の塩基配列内−１１７０と−１１８８と
の間にＡＧＡＡＮの共通配列を有する熱衝撃に反応する
転写因子のＨＳＥ（heat shock element）を有してい
る。（図３参照) ＧＣＮ−４及びＡＰ−１は活性酸素種
などに反応するものと知られ、特にＡＰ−１は麦Ｃ−ホ
ルデニンプロモーターで窒素に反応する重要要素として
知られている。（Muller, M . et al., 1993 ）さら
に、天然ＳＷＰＡ２のプロモーター領域にはＧＮ−４が
３部位にそしてＡＰ−１が２部位に存在する。特に、−
１１７５０と−１１６３との間にはＧＣＮ−４及びＡＰ
−１が逆方向反復塩基配列で存在する。（図３参照）
【００２８】本発明のＳＷＰＡ２プロモーターは酸化的
ストレスを含む多様な外部的要因によって発現が強く誘
発され、特に培養細胞において強く発現されるので、環
境ストレス抵抗性植物体の開発に及び形質転換植物細胞
を用いる有用物質の生産に有用に利用することができ
る。
ストレスを含む多様な外部的要因によって発現が強く誘
発され、特に培養細胞において強く発現されるので、環
境ストレス抵抗性植物体の開発に及び形質転換植物細胞
を用いる有用物質の生産に有用に利用することができ
る。
【００２９】本発明のＳＷＰＳ２プロモーターはストレ
スによって遺伝子の発現を効果的に誘発することができ
る。このために、本発明のプロモーターはＡＢＡ、メチ
ルジャスモネート、損傷又は創傷、低酸素症、活性酸素
症、熱または窒素によるストレスを認識する因子を含
む。ＳＷＰＡ２プロモーターは、このような特性を用い
て配列番号２でしめされる塩基配列中の１〜１８２４又
はこの一部からなり、プロモーター活性を示すＤＮＡ配
列及びこれと作動可能に連結された構造遺伝子からなる
融合遺伝子構造体の製造に利用することができる。上記
融合遺伝子構造体は、ＳＷＰＡ２プロモーター遺伝子に
有用物質の生産に係わる構造遺伝子を連結し、多様な環
境ストレス下でＳＷＰＡ２プロモーターの調節によって
有用物質を発現するので有用物質を生産するための形質
転換体の製造に有用に利用することができる。また、上
記融合遺伝子構造体に多様な環境ストレスに対して耐性
を示す遺伝子を構造遺伝子として使用することにより、
外部的なストレスが加わった場合に、これに対して耐性
を有する形質転換体の製造にも利用することができる。
スによって遺伝子の発現を効果的に誘発することができ
る。このために、本発明のプロモーターはＡＢＡ、メチ
ルジャスモネート、損傷又は創傷、低酸素症、活性酸素
症、熱または窒素によるストレスを認識する因子を含
む。ＳＷＰＡ２プロモーターは、このような特性を用い
て配列番号２でしめされる塩基配列中の１〜１８２４又
はこの一部からなり、プロモーター活性を示すＤＮＡ配
列及びこれと作動可能に連結された構造遺伝子からなる
融合遺伝子構造体の製造に利用することができる。上記
融合遺伝子構造体は、ＳＷＰＡ２プロモーター遺伝子に
有用物質の生産に係わる構造遺伝子を連結し、多様な環
境ストレス下でＳＷＰＡ２プロモーターの調節によって
有用物質を発現するので有用物質を生産するための形質
転換体の製造に有用に利用することができる。また、上
記融合遺伝子構造体に多様な環境ストレスに対して耐性
を示す遺伝子を構造遺伝子として使用することにより、
外部的なストレスが加わった場合に、これに対して耐性
を有する形質転換体の製造にも利用することができる。
【００３０】本発明のプロモータは、植物体だけでな
く、微生物でも作用可能であり、従って形質転換植物細
胞、形質転換植物体及びこれらかに由来した形質転換カ
ルス、形質転換微生物、形質転換動物細胞を生産するこ
とに利用できる。
く、微生物でも作用可能であり、従って形質転換植物細
胞、形質転換植物体及びこれらかに由来した形質転換カ
ルス、形質転換微生物、形質転換動物細胞を生産するこ
とに利用できる。
【００３１】さらに、本発明は上記ＳＷＰＡ２プロモー
ターを用いて多様な環境ストレスによって有用物質の生
産を誘発することができる形質転換体の製造方法を提供
する。
ターを用いて多様な環境ストレスによって有用物質の生
産を誘発することができる形質転換体の製造方法を提供
する。
【００３２】上記形質転換体の製造方法は、 １）配列番号２で示される塩基配列の１〜１８２４又は
この一部からなり、プロモータ活性を示すＤＮＡ配列と
これと作動可能に連結される有用物質をコードするＤＮ
Ａ配列からなる発現ベクターを構築する工程； ２）宿主細胞に上記発現ベクターを挿入する工程; 及び ３）上記発現ベクターが挿入された形質転換体を選別す
る工程からなる。
この一部からなり、プロモータ活性を示すＤＮＡ配列と
これと作動可能に連結される有用物質をコードするＤＮ
Ａ配列からなる発現ベクターを構築する工程； ２）宿主細胞に上記発現ベクターを挿入する工程; 及び ３）上記発現ベクターが挿入された形質転換体を選別す
る工程からなる。
【００３３】本発明の方法において有用物質としては薬
理効果を奏する多様な蛋白質またはペプチド、形質転換
体にストレスに対する耐性を付与する物質などを含む。
従って、本発明の方法によって有用物質を生産すること
ができる形質転換体及び多様な環境ストレスに耐性を有
する形質転換体を作ることができる。
理効果を奏する多様な蛋白質またはペプチド、形質転換
体にストレスに対する耐性を付与する物質などを含む。
従って、本発明の方法によって有用物質を生産すること
ができる形質転換体及び多様な環境ストレスに耐性を有
する形質転換体を作ることができる。
【００３４】
【実施例】以下、本発明を下記の実施例によってより詳
細に説明する。ただし、下記の実施例は本発明を例示す
るものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
細に説明する。ただし、下記の実施例は本発明を例示す
るものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
【００３５】〈実施例１〉ぺルオキシダーゼゲノムＤＮ
Ａの分離 ぺルオキシダーゼ遺伝子ｓｗｐａ２のゲノム遺伝子を探
すために、まずｓｗｐａ２（GeneBank Accession No. A
F109124 ）がさつまいものゲノム内に存在する遺伝子で
あることを確認するために、サザンブロット分析を実施
した。
Ａの分離 ぺルオキシダーゼ遺伝子ｓｗｐａ２のゲノム遺伝子を探
すために、まずｓｗｐａ２（GeneBank Accession No. A
F109124 ）がさつまいものゲノム内に存在する遺伝子で
あることを確認するために、サザンブロット分析を実施
した。
【００３６】さつまいも培養細胞からゲノムＤＮＡをデ
ラポルタ（Dellaporta, Newsletter, 57, 26-29(1983)
）によって抽出したゲノムＤＮＡ１５μｇを制限酵素
ＥｃｏＲ Ｉ、Ｈｉｎｄ ＩＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで
切断し、アガロースゲル電気泳動を行った。上記ゲル上
のゲノムＤＮＡをナイロン膜に転写した後、ｓｗｐａ２
遺伝子各々の特異的な３’−末端非飜訳領域を32Ｐで標
識した遺伝子断片を探針として用いて混成化反応を行っ
た。その結果を図１に示す。
ラポルタ（Dellaporta, Newsletter, 57, 26-29(1983)
）によって抽出したゲノムＤＮＡ１５μｇを制限酵素
ＥｃｏＲ Ｉ、Ｈｉｎｄ ＩＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで
切断し、アガロースゲル電気泳動を行った。上記ゲル上
のゲノムＤＮＡをナイロン膜に転写した後、ｓｗｐａ２
遺伝子各々の特異的な３’−末端非飜訳領域を32Ｐで標
識した遺伝子断片を探針として用いて混成化反応を行っ
た。その結果を図１に示す。
【００３７】図１に示したように、ｓｗｐａ２遺伝子
は、２個以上のバンドを示し、お互いに違うゲノム内に
複数存在する遺伝子であることがわかる。
は、２個以上のバンドを示し、お互いに違うゲノム内に
複数存在する遺伝子であることがわかる。
【００３８】〈実施例２〉ぺルオキシダーゼゲノムＤＮ
Ａ ＳＷＰＡ２の分離及び塩基配列の分析 本発明のぺルオキシダーゼ遺伝子ｓｗｐａ２をゲノム内
に含むゲノムＤＮＡを分離するために下記の実験を行っ
た。
Ａ ＳＷＰＡ２の分離及び塩基配列の分析 本発明のぺルオキシダーゼ遺伝子ｓｗｐａ２をゲノム内
に含むゲノムＤＮＡを分離するために下記の実験を行っ
た。
【００３９】さつまいもゲノムＤＮＡライブラリーは、
λ Blue STARTM BamhI Arms ベクターキット（Novagen
社製）を用いて製造した。ｓｗｐａ２の塩基配列を特異
的に認識するプライマーを用いてＰＣＲを行った。これ
から合成された０．５ｋｂの大きさのＤＮＡ産物を32Ｐ
で標識してさつまいもＰＯＤゲノムＤＮＡライブラリー
のスクリーニングに用いた。ライブラリスクリーニング
は、サムブルーク（Sambrook）他の方法（Molecular cl
oning: a laboratory manual 2nd 1989 ）によって実
施し。３次スクリーニングによってｓｗｐａ２とＯＲＦ
とが同一なゲノムクローンを得て、これを天然ＳＷＰＡ
２と名付けた。
λ Blue STARTM BamhI Arms ベクターキット（Novagen
社製）を用いて製造した。ｓｗｐａ２の塩基配列を特異
的に認識するプライマーを用いてＰＣＲを行った。これ
から合成された０．５ｋｂの大きさのＤＮＡ産物を32Ｐ
で標識してさつまいもＰＯＤゲノムＤＮＡライブラリー
のスクリーニングに用いた。ライブラリスクリーニング
は、サムブルーク（Sambrook）他の方法（Molecular cl
oning: a laboratory manual 2nd 1989 ）によって実
施し。３次スクリーニングによってｓｗｐａ２とＯＲＦ
とが同一なゲノムクローンを得て、これを天然ＳＷＰＡ
２と名付けた。
【００４０】天然ＳＷＰＡ２は、全体長さが約４ｋｂの
配列番号１で示される塩基配列をもち、３個のエキソン
と２個のイントロンとプロモーター領域で構成されてい
た。（図２）上記エキソンの塩基配列は、ｓｗｐａ２ｃ
ＤＮＡの塩基配列と完全に一致するゲノムクローンであ
ることを確認した。さつまいもＰＯＤゲノムクローンは
２個のイントロン中、特に一番目のイントロンが７３７
ｂｐであり、ほかの植物種が１００〜３００ｂｐである
ことに比べると、極めて長いイントロンを含んでいる。
各々のイントロンは５’の側がＧＴで始まり、３’の側
がＡＧで終るＧＴ−ＡＧ法則にしたがっている。
配列番号１で示される塩基配列をもち、３個のエキソン
と２個のイントロンとプロモーター領域で構成されてい
た。（図２）上記エキソンの塩基配列は、ｓｗｐａ２ｃ
ＤＮＡの塩基配列と完全に一致するゲノムクローンであ
ることを確認した。さつまいもＰＯＤゲノムクローンは
２個のイントロン中、特に一番目のイントロンが７３７
ｂｐであり、ほかの植物種が１００〜３００ｂｐである
ことに比べると、極めて長いイントロンを含んでいる。
各々のイントロンは５’の側がＧＴで始まり、３’の側
がＡＧで終るＧＴ−ＡＧ法則にしたがっている。
【００４１】〈実施例３〉ぺルオキシダーゼゲノムＤＮ
ＡＳＷＰＡ２のプロモーターの分離 天然ＳＷＰＡ２のプロモーターは、翻訳開始点の上流か
ら−１８２４ｂｐまでの領域に該当する配列番号２と記
載される塩基配列として構成される。（図３）上記ＳＷ
ＰＡ２のプロモーターの塩基配列上の特性をコンピュー
ターバイオロジカル エンド インホーマティックス
ラボラトリーのトランスクリプションエレメント サー
チ ソフトウエアー（TESS）を用いて分析した。
ＡＳＷＰＡ２のプロモーターの分離 天然ＳＷＰＡ２のプロモーターは、翻訳開始点の上流か
ら−１８２４ｂｐまでの領域に該当する配列番号２と記
載される塩基配列として構成される。（図３）上記ＳＷ
ＰＡ２のプロモーターの塩基配列上の特性をコンピュー
ターバイオロジカル エンド インホーマティックス
ラボラトリーのトランスクリプションエレメント サー
チ ソフトウエアー（TESS）を用いて分析した。
【００４２】塩基配列分析結果：ＳＷＰＡ２プロモータ
ーは真核生物プロモーターの調節要素部位を有している
ことが確認されたが、転写開始のためのＴＡＴＡボック
スが存在し、−８９５部位にＣＡＡＴボックスが存在し
た。転写調節蛋白質の付着部位はＡＢＡ、メチル ジャ
スモネート、紫外線、損傷又は創傷、低酸素症などによ
って調節されることが知られている（Williams, M, et
al. 1992）。ＧボックスはＮＮＮＳＡＣＧＴＧＮＣＭと
記載されたアミノ酸配列を有するが、ＳＷＰＡ２プロモ
ーター領域の−４４５と−４５５部位にこれと類似な領
域（モティーフ）が存在する。（図３）ＳＷＰＡ２プロ
モーター内のＧボックスと転写開始点との間には組織特
異的に発現し、ストレスによって発現が誘導される転写
因子であることが明らかにされた（Gidoni, D. et al.,
1984 ）ＳＰ−１が存在していて、ほかにもＡＡＡＡＴ
Ａの反復配列が６個存在した。
ーは真核生物プロモーターの調節要素部位を有している
ことが確認されたが、転写開始のためのＴＡＴＡボック
スが存在し、−８９５部位にＣＡＡＴボックスが存在し
た。転写調節蛋白質の付着部位はＡＢＡ、メチル ジャ
スモネート、紫外線、損傷又は創傷、低酸素症などによ
って調節されることが知られている（Williams, M, et
al. 1992）。ＧボックスはＮＮＮＳＡＣＧＴＧＮＣＭと
記載されたアミノ酸配列を有するが、ＳＷＰＡ２プロモ
ーター領域の−４４５と−４５５部位にこれと類似な領
域（モティーフ）が存在する。（図３）ＳＷＰＡ２プロ
モーター内のＧボックスと転写開始点との間には組織特
異的に発現し、ストレスによって発現が誘導される転写
因子であることが明らかにされた（Gidoni, D. et al.,
1984 ）ＳＰ−１が存在していて、ほかにもＡＡＡＡＴ
Ａの反復配列が６個存在した。
【００４３】また、ＳＷＰＡ２プロモーターは−１１７
０と−１１８８との間にＡＧＡＡＮの共通配列を有する
熱衝撃に反応する転写因子のＨＳＥ（熱ショックエレメ
ント）を有している。（図３）ＧＣＮ−４及びＡＰ−１
は活性酸素種などに反応するものとして知られており、
特にＡＰ−１は麦Ｃ−ホルデニンプロモータで窒素に反
応する重要要素として知られている。（Muller, M. et
al., 1993 ）同時に、天然ＳＷＰＡ２のプロモーター領
域には、ＧＣＮ−４が３部位に、ＡＰ−１が２部位に存
在する。特に、−１１７５と−１１６３との間にはＧＣ
Ｎ−４及びＡＰ−１が逆方向反復塩基配列で存在する。
（図３）
０と−１１８８との間にＡＧＡＡＮの共通配列を有する
熱衝撃に反応する転写因子のＨＳＥ（熱ショックエレメ
ント）を有している。（図３）ＧＣＮ−４及びＡＰ−１
は活性酸素種などに反応するものとして知られており、
特にＡＰ−１は麦Ｃ−ホルデニンプロモータで窒素に反
応する重要要素として知られている。（Muller, M. et
al., 1993 ）同時に、天然ＳＷＰＡ２のプロモーター領
域には、ＧＣＮ−４が３部位に、ＡＰ−１が２部位に存
在する。特に、−１１７５と−１１６３との間にはＧＣ
Ｎ−４及びＡＰ−１が逆方向反復塩基配列で存在する。
（図３）
【００４４】上記のように、本発明のSAP2プロモーター
は、ＲＯＳをはじめ多様なストレスを認識する因子を多
く含んでいて環境ストレスに対して耐性を有する耐性植
物体開発にとても有用に使用できる。
は、ＲＯＳをはじめ多様なストレスを認識する因子を多
く含んでいて環境ストレスに対して耐性を有する耐性植
物体開発にとても有用に使用できる。
【００４５】〈実施例４〉ＳＷＡＰ２プロモーターの欠
失突然変異体の製造 本発明のＳＷＰＡ２プロモーターの欠失突然変異体を製
造するために、ＳＷＰＡのプロモーター領域をＥｘ Ｔ
ａｑ ポリメラーゼ（タカラ社製）と配列特異的プライ
マーを用いてＰＣＲで増幅した。この時、プライマーは
配列番号３〜７として示される上流側のプライマーと配
列番号８として示される下流側のプライマーを用いて、
上記上流側プライマーはすべてＳａｌＩ制限酵素部位を
含み、下流側プライマーはＢａｍＨＩ制限酵素部位を含
むように製造した。上記のプライマーのＰＣＲ反応によ
る欠失大きさは、各々１８２４、１３１４、９６８、６
０２，３５４ｂｐで増幅された。（図４）
失突然変異体の製造 本発明のＳＷＰＡ２プロモーターの欠失突然変異体を製
造するために、ＳＷＰＡのプロモーター領域をＥｘ Ｔ
ａｑ ポリメラーゼ（タカラ社製）と配列特異的プライ
マーを用いてＰＣＲで増幅した。この時、プライマーは
配列番号３〜７として示される上流側のプライマーと配
列番号８として示される下流側のプライマーを用いて、
上記上流側プライマーはすべてＳａｌＩ制限酵素部位を
含み、下流側プライマーはＢａｍＨＩ制限酵素部位を含
むように製造した。上記のプライマーのＰＣＲ反応によ
る欠失大きさは、各々１８２４、１３１４、９６８、６
０２，３５４ｂｐで増幅された。（図４）
【００４６】これから得たＰＣＲ産物を制限酵素Ｓａｌ
Ｉ／ＢａｍＨＩで切断した後、バイナリベクターとして
ＧＵＳコード部分とＮＯＳターミネーターを含むｐＢＩ
１０１プラスミドベクター（Clontech社製) に上記ＤＮ
Ａ断片をサブクローニングした。これから−１８２４、
−１３１４、−９６８、−６０２、−３５４欠失構造を
含むＳＷＰＡ２プロモーターの欠失突然変異プラスミド
ベクターｐＢＳ１８１４、ｐＢＳ１３１４、ｐＢＳ９６
８、ｐＢＳ６０２、ｐＢＳ３５４を製造し、これを用い
てトランシット アッセイ（Transit assay ）を実施し
た。
Ｉ／ＢａｍＨＩで切断した後、バイナリベクターとして
ＧＵＳコード部分とＮＯＳターミネーターを含むｐＢＩ
１０１プラスミドベクター（Clontech社製) に上記ＤＮ
Ａ断片をサブクローニングした。これから−１８２４、
−１３１４、−９６８、−６０２、−３５４欠失構造を
含むＳＷＰＡ２プロモーターの欠失突然変異プラスミド
ベクターｐＢＳ１８１４、ｐＢＳ１３１４、ｐＢＳ９６
８、ｐＢＳ６０２、ｐＢＳ３５４を製造し、これを用い
てトランシット アッセイ（Transit assay ）を実施し
た。
【００４７】〈実施例５〉煙草原形質体を用いたＳＷＰ
Ａ２プロモーターのトランシットアッセイ ＳＷＰＡ２プロモーターの欠失突然変異体を用いたトラ
ンシット アッセイを下記のように行った。まず、煙草
懸濁培養細胞ＢＹ−２（Nicotiana tabacum L. cv. Br
ight yellow 2 ）を用いて継代培養し、３日経過後に細
胞を２％セルラーゼＲ−１０と０．５％マセロザイム
（mycerozyme）を含有する酵素液で３時間処理し、原形
質体を分離した。これに上記の実施例４で製造した欠失
突然変異体プラスミドベクターを加えて、ポリエチレン
グリコール方法を用いてプラスミドベクターを細胞内に
導入させた後、２５℃で暗状態下で１６時間培養した。
欠失突然変異体プラスミドベクターを含む原形質体の蛍
光をジェファソン他の方法（Plant Mol. Biol. Ref.,
5, 387-405, 1987 ）で測定することによって、プロモ
ーターの活性をＧＵＳ蛋白質が生産された量として計算
した。
Ａ２プロモーターのトランシットアッセイ ＳＷＰＡ２プロモーターの欠失突然変異体を用いたトラ
ンシット アッセイを下記のように行った。まず、煙草
懸濁培養細胞ＢＹ−２（Nicotiana tabacum L. cv. Br
ight yellow 2 ）を用いて継代培養し、３日経過後に細
胞を２％セルラーゼＲ−１０と０．５％マセロザイム
（mycerozyme）を含有する酵素液で３時間処理し、原形
質体を分離した。これに上記の実施例４で製造した欠失
突然変異体プラスミドベクターを加えて、ポリエチレン
グリコール方法を用いてプラスミドベクターを細胞内に
導入させた後、２５℃で暗状態下で１６時間培養した。
欠失突然変異体プラスミドベクターを含む原形質体の蛍
光をジェファソン他の方法（Plant Mol. Biol. Ref.,
5, 387-405, 1987 ）で測定することによって、プロモ
ーターの活性をＧＵＳ蛋白質が生産された量として計算
した。
【００４８】トランシット アッセイの結果、ＳＷＰＡ
２プロモータ中に、特に−１３１４の欠失構造が導入さ
れた場合ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターを用いた場合よ
り、約３０倍以上の高いＧＵＳ活性を示した。（図５）
２プロモータ中に、特に−１３１４の欠失構造が導入さ
れた場合ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターを用いた場合よ
り、約３０倍以上の高いＧＵＳ活性を示した。（図５）
【００４９】〈実施例６〉ＳＷＰＡ２プロモーターの酵
母での発現 ＳＷＰＡ２プロモーターが酵母（Saccharomyces cerevi
siae）でも発現されるかどうかを試験するために、酵母
／大腸菌シャトルベクターのＹＥｐ３５２（Hil l 他 1
986 ）及びＳ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅ Ｌ３２６２を宿主
として用いた。実施例４で製造されたＧＵＳ遺伝子及び
ターミネーター（NOS terminator）に結合された形態で
ＳＷＰＡ２プロモーターの欠失突然変異を含んでいるプ
ラスミドベクターの各々をＹＥｐ３５２ベクターに導入
した後、ＰＥＧ及酢酸リチュームを用いた酵母形質転換
方法を用いて酵母を形質転換させた。形質転換された酵
母をＳＤ base-Ura DO (drop out) supplement（Clonte
ch社製）で培養し、実施例５と同一方法で形質転換され
た酵母から発生される蛍光を測定してプロモーターの活
性を検定した。
母での発現 ＳＷＰＡ２プロモーターが酵母（Saccharomyces cerevi
siae）でも発現されるかどうかを試験するために、酵母
／大腸菌シャトルベクターのＹＥｐ３５２（Hil l 他 1
986 ）及びＳ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅ Ｌ３２６２を宿主
として用いた。実施例４で製造されたＧＵＳ遺伝子及び
ターミネーター（NOS terminator）に結合された形態で
ＳＷＰＡ２プロモーターの欠失突然変異を含んでいるプ
ラスミドベクターの各々をＹＥｐ３５２ベクターに導入
した後、ＰＥＧ及酢酸リチュームを用いた酵母形質転換
方法を用いて酵母を形質転換させた。形質転換された酵
母をＳＤ base-Ura DO (drop out) supplement（Clonte
ch社製）で培養し、実施例５と同一方法で形質転換され
た酵母から発生される蛍光を測定してプロモーターの活
性を検定した。
【００５０】その結果、−１３１４の欠失構造、−１６
２０の欠失構造及び−１８２４の欠失構造が導入された
形質転換酵母ではＣａＭＶ ３５Ｖプロモーターよりも
各々１．６倍、１．４倍及び８．４倍高いＧＵＳ活性を
示した。（図６）
２０の欠失構造及び−１８２４の欠失構造が導入された
形質転換酵母ではＣａＭＶ ３５Ｖプロモーターよりも
各々１．６倍、１．４倍及び８．４倍高いＧＵＳ活性を
示した。（図６）
【００５１】〈実施例７〉形質転換植物体及び培養細胞
でＳＷＰＡ２プロモーターを用いるＧＵＳ発現
でＳＷＰＡ２プロモーターを用いるＧＵＳ発現
【００５２】〈７−１〉植物材料及び形質転換植物体の
製造 形質転換植物体の材料は、煙草（Nicotiana tabacum c
v. Xanthi）を用い、上記実施例４で製造されたＳＷＰ
Ａ２プロモーターの欠失突然変異を含むプラスミドベク
ターのｐＢＳ１８２４（−１８２４欠失構造）及びｐＢ
Ｓ１３１４（−１３１４欠失構造）及びＣａＭＶプロモ
ーターにＧＵＳ遺伝子が結合されたｐＢ１１２１を導入
した癌腫菌（Agrobacterium tumefaciens ）ＬＢＡ４４
０４を各々上記煙草に感染させた。感染された煙草を２
００ｍｇ／Ｌカナマイシン及び３００ｍｌ／Ｌクラホラ
ン（claforan）を含有したＭＳ培地(Murashige T. 他、
Physiol Plant, 15, 473-497, 1962 ）で培養して形質
転換植物体を選別し、ルーティグ(rooting）及びシュー
ティング(shooting)過程を経た後、純化させ、小さい花
盆へ移して栽培しながら実験材料として用いた。
製造 形質転換植物体の材料は、煙草（Nicotiana tabacum c
v. Xanthi）を用い、上記実施例４で製造されたＳＷＰ
Ａ２プロモーターの欠失突然変異を含むプラスミドベク
ターのｐＢＳ１８２４（−１８２４欠失構造）及びｐＢ
Ｓ１３１４（−１３１４欠失構造）及びＣａＭＶプロモ
ーターにＧＵＳ遺伝子が結合されたｐＢ１１２１を導入
した癌腫菌（Agrobacterium tumefaciens ）ＬＢＡ４４
０４を各々上記煙草に感染させた。感染された煙草を２
００ｍｇ／Ｌカナマイシン及び３００ｍｌ／Ｌクラホラ
ン（claforan）を含有したＭＳ培地(Murashige T. 他、
Physiol Plant, 15, 473-497, 1962 ）で培養して形質
転換植物体を選別し、ルーティグ(rooting）及びシュー
ティング(shooting)過程を経た後、純化させ、小さい花
盆へ移して栽培しながら実験材料として用いた。
【００５３】上記形質転換植物体内にＳＷＰＡ２プロモ
ーターの欠失突然変異が導入されたかどうかを確認する
ために、配列番号９及び１０で示されるＮＰＴＩＩプラ
イマーと配列番号１１及び１２で示されるプロモーター
プライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、Ｎ
ＰＴＩＩプライマーを用いた場合には、９５℃で１分、
６５℃で１分、７２℃で１分によって３０回、プロモー
タープライマーを用いる場合には、９５℃で１分、６２
℃で１分、７２℃で１分によって３０回行った。この結
果、形質転換植物体ではＮＰＴＩＩプライマーによる
０．７ｋｂのＤＮＡ切片とプロモータープライマーによ
る１．０ｋｂのＤＮＡ切片が検出され、これによって上
記形質転換植物体内に外来遺伝子が挿入されたことを確
認した。
ーターの欠失突然変異が導入されたかどうかを確認する
ために、配列番号９及び１０で示されるＮＰＴＩＩプラ
イマーと配列番号１１及び１２で示されるプロモーター
プライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、Ｎ
ＰＴＩＩプライマーを用いた場合には、９５℃で１分、
６５℃で１分、７２℃で１分によって３０回、プロモー
タープライマーを用いる場合には、９５℃で１分、６２
℃で１分、７２℃で１分によって３０回行った。この結
果、形質転換植物体ではＮＰＴＩＩプライマーによる
０．７ｋｂのＤＮＡ切片とプロモータープライマーによ
る１．０ｋｂのＤＮＡ切片が検出され、これによって上
記形質転換植物体内に外来遺伝子が挿入されたことを確
認した。
【００５４】本発明で選別された、ｐＢＳ１３１４（−
１３１４欠失構造）で形質転換カルスを生命工学研究所
附設遺伝子銀行（Korean Collection for Type Culture
s ）に２０００年１０月１６日付けで寄託した。 (受託
番号: ＫＣＴＣ ０８７５ＢＰ）
１３１４欠失構造）で形質転換カルスを生命工学研究所
附設遺伝子銀行（Korean Collection for Type Culture
s ）に２０００年１０月１６日付けで寄託した。 (受託
番号: ＫＣＴＣ ０８７５ＢＰ）
【００５５】〈７−２〉形質転換培養細胞の製造 形質転換培養細胞を製造するために、実施例〈７−１〉
で遺伝子導入が確認された形質転換煙草植物体の葉をＭ
Ｓ基本培地に０．１ｍｇ／Ｌ ＢＡＰ、２ｍｇ／Ｌ Ｎ
ＡＡ、３０ｇ／Ｌスクロースを含むカルス誘導培地で培
養してカルスを誘導し、これから誘導された形質転換煙
草細胞主から懸濁培養を確立した。
で遺伝子導入が確認された形質転換煙草植物体の葉をＭ
Ｓ基本培地に０．１ｍｇ／Ｌ ＢＡＰ、２ｍｇ／Ｌ Ｎ
ＡＡ、３０ｇ／Ｌスクロースを含むカルス誘導培地で培
養してカルスを誘導し、これから誘導された形質転換煙
草細胞主から懸濁培養を確立した。
【００５６】〈７−３〉ストレスによる形質転換植物体
でのＧＵＳ発現の測定 外部的環境ストレスによる形質転換植物体内でＳＷＰＡ
２プロモータの発現様相を検査するために、上記形質転
換植物体に損傷を負わせ、又はＨ2 Ｏ2 で処理してこれ
らから誘導されるＧＵＳ活性を測定した。
でのＧＵＳ発現の測定 外部的環境ストレスによる形質転換植物体内でＳＷＰＡ
２プロモータの発現様相を検査するために、上記形質転
換植物体に損傷を負わせ、又はＨ2 Ｏ2 で処理してこれ
らから誘導されるＧＵＳ活性を測定した。
【００５７】まず、損傷によるＳＷＰＡ２プロモーター
の発現様相を探るために形質転換植物体に損傷を負わせ
てＧＵＳ活性を測定した。その結果、ＣａＭＶ ３５Ｓ
プロモーター遺伝子を含むｐＢＩ１２１ベクターが導入
された形質転換植物体では、損傷によるＧＵＳ発現量の
変化は現れなかったが、一方ｐＢＳ１８２４ベクター及
びｐＢＳ１３１４ベクターが各々導入された形質転換植
物体では、損傷処理３日経過後にＧＵＳの発現量が増加
した。（図７）ｐＢＳ１３１４が導入された形質転換植
物体の場合には、損傷処理によりＤＵＳの発現量が無処
理群よりも約３．６倍増加した。ｐＢＳ１８２４が導入
された形質転換植物の場合には、損傷処理によるＧＵＳ
発現量の増加はｐＢＳ１３１４よりも低かったが、損傷
によりＧＵＳの発現が誘発されたものはｐＢＳ１３１４
と類似な傾向を示した。
の発現様相を探るために形質転換植物体に損傷を負わせ
てＧＵＳ活性を測定した。その結果、ＣａＭＶ ３５Ｓ
プロモーター遺伝子を含むｐＢＩ１２１ベクターが導入
された形質転換植物体では、損傷によるＧＵＳ発現量の
変化は現れなかったが、一方ｐＢＳ１８２４ベクター及
びｐＢＳ１３１４ベクターが各々導入された形質転換植
物体では、損傷処理３日経過後にＧＵＳの発現量が増加
した。（図７）ｐＢＳ１３１４が導入された形質転換植
物体の場合には、損傷処理によりＤＵＳの発現量が無処
理群よりも約３．６倍増加した。ｐＢＳ１８２４が導入
された形質転換植物の場合には、損傷処理によるＧＵＳ
発現量の増加はｐＢＳ１３１４よりも低かったが、損傷
によりＧＵＳの発現が誘発されたものはｐＢＳ１３１４
と類似な傾向を示した。
【００５８】また、本発明者はＨ2 Ｏ2 によるＳＷＰＡ
２プロモーターの発現様相を確認するために、成熟した
葉から直径７ｍｍの葉切れ（leaf disk ）を取って１ｍ
ＭＨ2 Ｏ2 溶液に浮かべて連続光の状態下で培養した。
培養後ＧＵＳ活性を測定してＨ2 Ｏ2 によるＳＷＰＡ２
プロモーターの発現様相を検査した。その結果、培養４
８時間経過後ｐＢＳ１３１４が導入された形質転換植物
体の場合には、非処理群に比べて約５８倍ＧＵＳの発現
量が増加し、ＣａＭＶ ３５Ｓ プロモーターより約
１．７倍高いＧＵＳ活性が測定された。（図７）ｐＢＳ
１８２４が導入された形質転換植物体の場合には、Ｈ2
Ｏ2 によってＧＵＳの発現量が３．２倍増加し、ＣａＭ
Ｖ ３５Ｓ プロモーターより１．２倍高くＧＵＳの活
性が測定された。
２プロモーターの発現様相を確認するために、成熟した
葉から直径７ｍｍの葉切れ（leaf disk ）を取って１ｍ
ＭＨ2 Ｏ2 溶液に浮かべて連続光の状態下で培養した。
培養後ＧＵＳ活性を測定してＨ2 Ｏ2 によるＳＷＰＡ２
プロモーターの発現様相を検査した。その結果、培養４
８時間経過後ｐＢＳ１３１４が導入された形質転換植物
体の場合には、非処理群に比べて約５８倍ＧＵＳの発現
量が増加し、ＣａＭＶ ３５Ｓ プロモーターより約
１．７倍高いＧＵＳ活性が測定された。（図７）ｐＢＳ
１８２４が導入された形質転換植物体の場合には、Ｈ2
Ｏ2 によってＧＵＳの発現量が３．２倍増加し、ＣａＭ
Ｖ ３５Ｓ プロモーターより１．２倍高くＧＵＳの活
性が測定された。
【００５９】さらに、ぺルオキシダーゼゲノム遺伝子Ｓ
ＷＰＡ２のプロモータ欠失突然変異体が導入された煙草
の形質転換植物体に紫外線を照射した後、誘発されたＧ
ＵＳ活性を測定した結果、培養２４時間経過後ｐＢＳ１
３１４が導入された形質転換植物体の場合には、非処理
群に比べて約５．６倍ＧＵＳの発現量が増加し、ＣａＭ
Ｖ ３５Ｓ プロモーターより約１．２倍高いＧＵＳ活
性が測定された。
ＷＰＡ２のプロモータ欠失突然変異体が導入された煙草
の形質転換植物体に紫外線を照射した後、誘発されたＧ
ＵＳ活性を測定した結果、培養２４時間経過後ｐＢＳ１
３１４が導入された形質転換植物体の場合には、非処理
群に比べて約５．６倍ＧＵＳの発現量が増加し、ＣａＭ
Ｖ ３５Ｓ プロモーターより約１．２倍高いＧＵＳ活
性が測定された。
【００６０】〈７−４〉ケルロース及び懸濁培養におけ
るＧＵＳの発現 本発明のペルオキシダーゼ遺伝子ＳＷＰＡ２プロモータ
ーが培養細胞の生長と関連して、その発現が調節される
かどうか検査するために、ｐＢＳ１３１４、ｐＢＳ１８
２４、及びｐＢＳＩ１２１を各々導入した形質転換植物
体から誘導された形質転換カルスからＧＵＳ活性を測定
した。その結果、ｐＢＳ１３１４が導入された形質転換
カルスは、ｐｂＩ１２１が導入された形質転換カルスよ
り約４倍高いＧＵＳ活性を示した（図１０ａ及び図１０
ｂ）。
るＧＵＳの発現 本発明のペルオキシダーゼ遺伝子ＳＷＰＡ２プロモータ
ーが培養細胞の生長と関連して、その発現が調節される
かどうか検査するために、ｐＢＳ１３１４、ｐＢＳ１８
２４、及びｐＢＳＩ１２１を各々導入した形質転換植物
体から誘導された形質転換カルスからＧＵＳ活性を測定
した。その結果、ｐＢＳ１３１４が導入された形質転換
カルスは、ｐｂＩ１２１が導入された形質転換カルスよ
り約４倍高いＧＵＳ活性を示した（図１０ａ及び図１０
ｂ）。
【００６１】また、形質転換カルスから誘導された懸濁
細胞でＧＵＳの活性変化を検査した結果、ｐＢＳ１３１
４、ｐＢＳ１８２４、及びｐＢＩ１２１を導入した形質
転換細胞は、同一の生長を見せ、培養１５日経過後に停
滞期に到達した（図１１ａ及び図１１ｂ）
細胞でＧＵＳの活性変化を検査した結果、ｐＢＳ１３１
４、ｐＢＳ１８２４、及びｐＢＩ１２１を導入した形質
転換細胞は、同一の生長を見せ、培養１５日経過後に停
滞期に到達した（図１１ａ及び図１１ｂ）
【００６２】ｐＢＩ１２１が導入された形質転換細胞の
ＧＵＳ活性は、細胞の生長時期に関係なく比較的低い水
準に維持された。ｐＢＳ１８２４が導入された形質転換
細胞においても、細胞生長に関係なく一定水準のＧＵＳ
を発現しているが、ｐＢＩ１２１より高い発現量を維持
した。一方、ｐＢＳ１３１４が導入された形質転換細胞
においては、細胞培養５日〜７日の間には低い水準でＧ
ＵＳを発現したが７日経過後からＧＵＳ発現量が急激に
増加した。培養１５日経過後には、最高の発現量を示
し、培養後期まで維持した。
ＧＵＳ活性は、細胞の生長時期に関係なく比較的低い水
準に維持された。ｐＢＳ１８２４が導入された形質転換
細胞においても、細胞生長に関係なく一定水準のＧＵＳ
を発現しているが、ｐＢＩ１２１より高い発現量を維持
した。一方、ｐＢＳ１３１４が導入された形質転換細胞
においては、細胞培養５日〜７日の間には低い水準でＧ
ＵＳを発現したが７日経過後からＧＵＳ発現量が急激に
増加した。培養１５日経過後には、最高の発現量を示
し、培養後期まで維持した。
【００６３】
【発明の効果】本発明は、さつまいもの培養細胞から環
境ストレス条件で強く発現する新規なペルオキシダーゼ
遺伝子ＳＷＰＡ２及び上記遺伝子のプロモーターを提供
する。本発明のペルオキシダーゼゲノム遺伝子ＳＷＰＡ
２プロモーターは、各種環境ストレスを認識する領域を
複数部位に含んでおり、形質転換植物体から目的とする
遺伝子を発現させるために一般的に多く使われているＣ
ａＭＶ ３５Ｓ プロモーターに比べて、トランシット
アッセイで約３０高い活性を示すことが明らかにされ
た。従って、上記のプロモーターの全体又はその一部を
使って、細胞、植物体、微生物及びバクテリアなどの形
質転換体の開発に利用すれば、環境ストレスに対して耐
性を持った耐性植物体の開発と有用な成分を大量生産で
きる形質転換生物体の開発とに有用に利用できる。
境ストレス条件で強く発現する新規なペルオキシダーゼ
遺伝子ＳＷＰＡ２及び上記遺伝子のプロモーターを提供
する。本発明のペルオキシダーゼゲノム遺伝子ＳＷＰＡ
２プロモーターは、各種環境ストレスを認識する領域を
複数部位に含んでおり、形質転換植物体から目的とする
遺伝子を発現させるために一般的に多く使われているＣ
ａＭＶ ３５Ｓ プロモーターに比べて、トランシット
アッセイで約３０高い活性を示すことが明らかにされ
た。従って、上記のプロモーターの全体又はその一部を
使って、細胞、植物体、微生物及びバクテリアなどの形
質転換体の開発に利用すれば、環境ストレスに対して耐
性を持った耐性植物体の開発と有用な成分を大量生産で
きる形質転換生物体の開発とに有用に利用できる。
【００６４】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> A peroxidase genomic gene derived from Ipomoea batatas and a promoter thereof <130> 0p-09-48 <160> 4 <170> KopatentIn 1.55 <210> 1 <211> 3741 <212> DNA <213> Imopoea batatas <220> <221> CDS <222> (1829)・・(2155) <223> exon I <220> <221> CDS <222> (2898)・・(3092) <223> exon II <220> <221> CDS <222> (3190)・・(3741) <223> exon III <400> 1 ttaatttcaa tattttgtct gtattttttt tttagtacta ctcatgtcaa atcctgttac 60 atataaaata tgttcaaatt cactgaaact caaatctata acctcttatt tgatagagtc 120 actctataca actagaccac ggaattgtca actagaccac ggaattgtta gcttgtttat 180 tgtattcacg tataattttg atgaatatca tcaactttga cgggcaaaat agatagcatg 240 tggcggccac agtttcaaaa ttcatacaag atgtcaaggg gaccggcccg gtggctgcgt 300 gcatatcacg tgcaagattt gtgaaattct ttctagattc cttttatcct tttcttcttt 360 cttgaaaaaa tagaaacaga aattatatgt aaataaaata ataataatat ggtttccata 420 ctctatagca tatcatatgg tgcattgcac atatttcatc gacaaagaaa gccacggtgc 480 agacgctcga ttttgacatt ttacaactta caaggccatg atcagatcga taataccaaa 540 tggtaccacc taactaggtg atatatatta tgtatgtcat tattttaaac tgtattacaa 600 agactatttt ttcattaatt ggtacaaaga aaaattaaac agaaaagaaa ggaaaaaatg 660 actcaccacc tagcacctag acacctagac accaagtacc caaaccctct attttcaaca 720 tctattttca gatgtaaata tgagttggac gaagaaggtg ttagcaatta tttgattaat 780 cttgctacga taattatgat ccactcactt agtcattttt ttcagaccaa gacaactagc 840 ttgagttttt tattgtatgt ggtcggaacg ttttttgtaa ttaaaaaaat aaaagttgca 900 tcattatata tggtagatta agtaattgat caatcaacgt ttaattttgc atttatcggc 960 aaggtggagg ttcnaacttc cagtcgaact tagagagtca ttggagacct tgaccagtta 1020 actagcggtg tcgaaaacct gcacaacttg agatttaatt gcataccttt tatatatgac 1080 gcgttttatt tttttttcct agaaaataat ttggaagaaa ataagaatat gtattctgtg 1140 aaagctaggc caaaacgaat gtcttttcgt cgttttcgtt aaaggtttag atcatatttc 1200 atctggtcca acactcaaac ttgtataatg gacgaattat tagtcatttt agacctaccg 1260 gctagcgcga cttttttgtt ttccataaag attcgataat tgcatggcca gatgcaaagt 1320 ttgaaattta atgtttgcca aatcctatca tacaccacaa cacatgtctc agggccaagt 1380 ggcaccagca aacattcctg tcataattaa tttttttaat gagaaggagg aaactcacag 1440 ctattactcg aaggtatata atattgagta aatcttactt tgtgattcta gttgacaaaa 1500 caccgcaaga taaactatac taagttcaaa tcacctcacc gggttggctc agattggttt 1560 tttcaataca agagggggtg tgaactcccg tgccgacctc ttttgaggga caataatgta 1620 cggtcacgcc aaccaagctt gattttttnt gacaaatata ttactacata tattacacgg 1680 tcaaataatt aatcaaaaaa taaaaaaaga ccccaattaa agtccccaac cactctcaaa 1740 tattctattt aagggaaacc ttagaggcaa ttcatgcatc ctcaacccct tcttcttcat 1800 tttcttaatc ttacattttc ctttgacc atg gct tcc att gtg agt cgg ctc 1852 Met Ala Ser Ile Val Ser Arg Leu 1 5 agt ctt gcg cta agc ctc ata gct cta gct cta gct ggc tac tcc att 1900 Ser Leu Ala Leu Ser Leu Ile Ala Leu Ala Leu Ala Gly Tyr Ser Ile 10 15 20 tac cag cac aca cag tca gcc atg gag agc cag ccc atc aag gct ctc 1948 Tyr Gln His Thr Gln Ser Ala Met Glu Ser Gln Pro Ile Lys Ala Leu 25 30 35 40 ccg gcg tgg cta cag ctc ccc acg ttc caa tct gcc aac gtg tta tcg 1996 Pro Ala Trp Leu Gln Leu Pro Thr Phe Gln Ser Ala Asn Val Leu Ser 45 50 55 tat tat ccg agt ggc cgc aaa tcc tcc ccc gcc ggc atg ctt tcc gac 2044 Tyr Tyr Pro Ser Gly Arg Lys Ser Ser Pro Ala Gly Met Leu Ser Asp 60 65 70 gaa gct tgc gtg ttc tcc gcc gtt aaa gaa gtt gtc gac gcc gcc atc 2092 Glu Ala Cys Val Phe Ser Ala Val Lys Glu Val Val Asp Ala Ala Ile 75 80 85 gat aac gaa act cgc atg ggg gct tcc ctc att cgt ctc ttc ttc cac 2140 Asp Asn Glu Thr Arg Met Gly Ala Ser Leu Ile Arg Leu Phe Phe His 90 95 100 gat tgc ttt gtc gat gtacg tatagtatac atataattat gtaaaaccta 2190 Asp Cys Phe Val Asp 105 tatatatata tatatatata tatatacatg cacaaaaagt ttataatact aatatatacc 2250 catacttttt gcatatcatt atatatatta acacgattat attaaaaacc aataatatat 2310 tatatatata tatatagtta actatctttt ctttcacttt cttatcactt tttaaattgt 2370 taaatctaaa aattaattgt tattttattg aattttttct attttctatt ttgtttaaag 2430 acttaattat actattattt aactgggctg gtaactttcc gtcaatattg tttatttaac 2490 aattgtaaca attaaaacca attgtaacaa tagtacgtaa aagatcaaag tgacataaac 2550 cagcttaagt tttttaaatg gacgaactca aaacaaaaaa gtcaatatgt aatttcggta 2610 gagaagtcaa atttaaaatt tcatagttat caaatcaatt gttttatcaa cccagctagg 2670 ttgnctattt caaaaactaa ttagacattg gtgtgcatga aacattacgt taaaacaaaa 2730 gtcatcaccc acctcgtctt ataattggtg tacctaagtt atcacacgtt cctgtcgaac 2790 ttacacgcca aacatgtcaa tatgtcaaat gctttaatga aaaatattat tagattatta 2850 tttatctaat actaaatttt cttcttcgta aaaatttgtg tgtatta ggt tgt gat 2906 Gly Cys Asp 1 gca ggg ctt ctt ttg aat gat acg gcg acg ttc aca ggg gaa caa act 2954 Ala Gly Leu Leu Leu Asn Asp Thr Ala Thr Phe Thr Gly Glu Gln Thr 5 10 15 gca ttt ggc aat ctt aat tcc gtg aga ggg ttt gag gtt ata gaa caa 3002 Ala Phe Gly Asn Leu Asn Ser Val Arg Gly Phe Glu Val Ile Glu Gln 20 25 30 35 gct aaa cag aat gca gta gct aaa tgt gcc gat aca ccc gta tct tgt 3050 Ala Lys Gln Asn Ala Val Ala Lys Cys Ala Asp Thr Pro Val Ser Cys 40 45 50 gct gac att tta tct att gct gct cgt gat tct ttc gaa cgg gtaagtct 3100 Ala Asp Ile Leu Ser Ile Ala Ala Arg Asp Ser Phe Glu Arg 55 60 65 tcaatatcgt gtataagtgt tactaataat gtcaatatgt tacatgtaga catgtattta 3160 tttattttct ttgtatttac attcaacag ttt agt gga gca aca tac act gtg 3213 Phe Ser Gly Ala Thr Tyr Thr Val 1 5 act tta ggg cga ctc gat gcg aga acc gcg aac tta acc gga gct aat 3261 Thr Leu Gly Arg Leu Asp Ala Arg Thr Ala Asn Leu Thr Gly Ala Asn 10 15 20 acc cag ctt gtc gga cca tcg gaa aac ttg act gaa caa gtc agg aaa 3309 Thr Gln Leu Val Gly Pro Ser Glu Asn Leu Thr Glu Gln Val Arg Lys 25 30 35 40 ttt ggc atc aaa gga ttt aac gag agg gaa ttg gtc gcc ttg ttg ggt 3357 Phe Gly Ile Lys Gly Phe Asn Glu Arg Glu Leu Val Ala Leu Leu Gly 45 50 55 tca cac acg cta ggg ttt gcc aga tgt ccg gtt tta tgt gac aac aga 3405 Ser His Thr Leu Gly Phe Ala Arg Cys Pro Val Leu Cys Asp Asn Arg 60 65 70 aac att aac ccg gtt cgg gtc ccc ggt ctg caa tgc aac tgt cct gta 3453 Asn Ile Asn Pro Val Arg Val Pro Gly Leu Gln Cys Asn Cys Pro Val 75 80 85 act aat act gac ccg ggt ttg gtc ggg ctg gac ccc aca ccc gat aca 3501 Thr Asn Thr Asp Pro Gly Leu Val Gly Leu Asp Pro Thr Pro Asp Thr 90 95 100 ttc gac caa cgt tat tac tct gac cta gtc agc ggc caa ggc ctc ctg 3549 Phe Asp Gln Arg Tyr Tyr Ser Asp Leu Val Ser Gly Gln Gly Leu Leu 105 110 115 120 ttt tcc gac caa cag ctg atg aac agc acc acc acc agc gac gcc gtg 3597 Phe Ser Asp Gln Gln Leu Met Asn Ser Thr Thr Thr Ser Asp Ala Val 125 130 135 acg acg tac cgt gac tcc ata gac acc ttc ctt gcc gac ttc gcc gcc 3645 Thr Thr Tyr Arg Asp Ser Ile Asp Thr Phe Leu Ala Asp Phe Ala Ala 140 145 150 gcc atg gtc aag atg agc aac ctg cct ccg tcc gcc gga gtt gag ctc 3693 Ala Met Val Lys Met Ser Asn Leu Pro Pro Ser Ala Gly Val Glu Leu 155 160 165 gaa atc cgt gac gtc tgc agc cgg gtg aat gac gtc tct gtt gca tcc 3741 Glu Ile Arg Asp Val Cys Ser Arg Val Asn Asp Val Ser Val Ala Ser 170 175 180 <210> 2 <211> 1828 <212> DNA <213> Imopoea batatas <400> 2 ttaatttcaa tattttgtct gtattttttt tttagtacta ctcatgtcaa atcctgttac 60 atataaaata tgttcaaatt cactgaaact caaatctata acctcttatt tgatagagtc 120 actctataca actagaccac ggaattgtca actagaccac ggaattgtta gcttgtttat 180 tgtattcacg tataattttg atgaatatca tcaactttga cgggcaaaat agatagcatg 240 tggcggccac agtttcaaaa ttcatacaag atgtcaaggg gaccggcccg gtggctgcgt 300 gcatatcacg tgcaagattt gtgaaattct ttctagattc cttttatcct tttcttcttt 360 cttgaaaaaa tagaaacaga aattatatgt aaataaaata ataataatat ggtttccata 420 ctctatagca tatcatatgg tgcattgcac atatttcatc gacaaagaaa gccacggtgc 480 agacgctcga ttttgacatt ttacaactta caaggccatg atcagatcga taataccaaa 540 tggtaccacc taactaggtg atatatatta tgtatgtcat tattttaaac tgtattacaa 600 agactatttt ttcattaatt ggtacaaaga aaaattaaac agaaaagaaa ggaaaaaatg 660 actcaccacc tagcacctag acacctagac accaagtacc caaaccctct attttcaaca 720 tctattttca gatgtaaata tgagttggac gaagaaggtg ttagcaatta tttgattaat 780 cttgctacga taattatgat ccactcactt agtcattttt ttcagaccaa gacaactagc 840 ttgagttttt tattgtatgt ggtcggaacg ttttttgtaa ttaaaaaaat aaaagttgca 900 tcattatata tggtagatta agtaattgat caatcaacgt ttaattttgc atttatcggc 960 aaggtggagg ttcnaacttc cagtcgaact tagagagtca ttggagacct tgaccagtta 1020 actagcggtg tcgaaaacct gcacaacttg agatttaatt gcataccttt tatatatgac 1080 gcgttttatt tttttttcct agaaaataat ttggaagaaa ataagaatat gtattctgtg 1140 aaagctaggc caaaacgaat gtcttttcgt cgttttcgtt aaaggtttag atcatatttc 1200 atctggtcca acactcaaac ttgtataatg gacgaattat tagtcatttt agacctaccg 1260 gctagcgcga cttttttgtt ttccataaag attcgataat tgcatggcca gatgcaaagt 1320 ttgaaattta atgtttgcca aatcctatca tacaccacaa cacatgtctc agggccaagt 1380 ggcaccagca aacattcctg tcataattaa tttttttaat gagaaggagg aaactcacag 1440 ctattactcg aaggtatata atattgagta aatcttactt tgtgattcta gttgacaaaa 1500 caccgcaaga taaactatac taagttcaaa tcacctcacc gggttggctc agattggttt 1560 tttcaataca agagggggtg tgaactcccg tgccgacctc ttttgaggga caataatgta 1620 cggtcacgcc aaccaagctt gattttttnt gacaaatata ttactacata tattacacgg 1680 tcaaataatt aatcaaaaaa taaaaaaaga ccccaattaa agtccccaac cactctcaaa 1740 tattctattt aagggaaacc ttagaggcaa ttcatgcatc ctcaacccct tcttcttcat 1800 tttcttaatc ttacattttc ctttgacc 1828 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer 1 <400> 3 acgcgtcgac cttactttgt gattcta 27 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer 2 <400> 4 acgcgtcgac aatggacgaa ttattagt 28 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer 3 <400> 5 acgcgtcgac ggtcggaacg tttttt 26 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer 4 <400> 6 acgcgtcgac ccatgatcag atcgata 27 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer 5 <400> 7 acgcgtcgac aatattttgt ctgtatt 27 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer 1 <400> 8 cgggatccgg tcaaaggaaa at 22 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NPTII primer 1 <400> 9 gaggctattc ggctagatg 19 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NPTII primer 2 <400> 10 atcgggagcg gcgataccgt a 21 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter primer 1 <400> 11 ccattgatca gatcgata 18 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter primer 2 <400> 12 ggtcaaagga aaatgtaag 19
【図１】本発明のさつまいもぺルオキシダーゼ遺伝子ｓ
ｗｐａ２を含むゲノムＤＮＡを分離するために、サザン
ブロット法で分析した結果を示す図である。
ｗｐａ２を含むゲノムＤＮＡを分離するために、サザン
ブロット法で分析した結果を示す図である。
【図２ａ】本発明のさつまいものペルオキシダーゼをコ
ードするゲノム遺伝子ＳＷＰＡ２の塩基配列及びこれを
翻訳したアミノ酸配列を示す図である。
ードするゲノム遺伝子ＳＷＰＡ２の塩基配列及びこれを
翻訳したアミノ酸配列を示す図である。
【図２ｂ】図２ａに示したぺルオキシダーゼをコードす
るゲノム遺伝子ＳＷＰＡ２の塩基配列及びこれを翻訳し
たアミノ酸配列に連続する塩基配列及びアミノ酸配列を
示す図である。
るゲノム遺伝子ＳＷＰＡ２の塩基配列及びこれを翻訳し
たアミノ酸配列に連続する塩基配列及びアミノ酸配列を
示す図である。
【図３】さつまいもぺルオキシダーゼをコードするゲノ
ム遺伝子ＳＷＰＡ２のプロモーター領域の塩基配列を示
す図である。
ム遺伝子ＳＷＰＡ２のプロモーター領域の塩基配列を示
す図である。
【図４】本発明のぺルオキシダーゼをコードするゲノム
遺伝ＳＷＰＡ２のプロモーター領域の欠失突然変異体を
作成する過程を示す図である。
遺伝ＳＷＰＡ２のプロモーター領域の欠失突然変異体を
作成する過程を示す図である。
【図５】本発明のプロモータ領域の欠失突然変異体を用
いるトランシット アッセイの結果を示す図である。
いるトランシット アッセイの結果を示す図である。
【図６】本発明のプロモーター欠失突然変異体を挿入し
た形質転換酵母でのＧＵＳ活性を測定した結果を示す図
である。
た形質転換酵母でのＧＵＳ活性を測定した結果を示す図
である。
【図７ａ】本発明のプロモーター欠失突然変異体を挿入
した煙草の形質転換植物体での損傷処理なしに誘発され
たＧＵＳ活性を測定した結果を示す図である。
した煙草の形質転換植物体での損傷処理なしに誘発され
たＧＵＳ活性を測定した結果を示す図である。
【図７ｂ】本発明のプロモーター欠失突然変異体を挿入
した煙草の形質転換植物体での損傷処理後に誘発された
ＧＵＳ活性を測定した結果を示す図である。
した煙草の形質転換植物体での損傷処理後に誘発された
ＧＵＳ活性を測定した結果を示す図である。
【図８ａ】本発明のプロモーター欠失突然変異体を挿入
した煙草の形質転換植物体でのＨ 2 Ｏ2 処理なしに誘発
されたＧＵＳ活性を測定した結果を示す図である。
した煙草の形質転換植物体でのＨ 2 Ｏ2 処理なしに誘発
されたＧＵＳ活性を測定した結果を示す図である。
【図８ｂ】本発明のプロモーター欠失突然変異体を挿入
した煙草の形質転換植物体でのＨ 2 Ｏ2 処理後に誘発さ
れたＧＵＳ活性を測定した結果を示す図である。
した煙草の形質転換植物体でのＨ 2 Ｏ2 処理後に誘発さ
れたＧＵＳ活性を測定した結果を示す図である。
【図９ａ】本発明のプロモーター欠失突然変異体を挿入
した煙草の形質転換植物体での紫外線照射なしに誘発さ
れたＧＵＳ活性を測定した結果を示す図である。
した煙草の形質転換植物体での紫外線照射なしに誘発さ
れたＧＵＳ活性を測定した結果を示す図である。
【図９ｂ】本発明のプロモーター欠失突然変異体を挿入
した煙草の形質転換植物体での紫外線照射後に誘発され
たＧＵＳ活性を測定した結果を示す図である。
した煙草の形質転換植物体での紫外線照射後に誘発され
たＧＵＳ活性を測定した結果を示す図である。
【図１０ａ】本発明のプロモーター欠失突然変異体を挿
入した煙草の形質転換植物体の葉から誘導したカルスを
ＧＵＳで染色した結果を示す図である。 Ａ：ｐＢＳ１３１４ Ｂ：ｐＢＳ１８２４ Ｃ：対照群 Ｄ：ｐＢＩ１２１
入した煙草の形質転換植物体の葉から誘導したカルスを
ＧＵＳで染色した結果を示す図である。 Ａ：ｐＢＳ１３１４ Ｂ：ｐＢＳ１８２４ Ｃ：対照群 Ｄ：ｐＢＩ１２１
【図１０ｂ】本発明のプロモーター欠失突然変異体を挿
入した煙草の形質転換植物体の葉から誘導したカルスの
ＧＵＳ活性を測定した結果を示す図である。 Ａ：ｐＢＳ１３１４ Ｂ：ｐＢＳ１８２４ Ｃ：対照群 Ｄ：ｐＢＩ１２１
入した煙草の形質転換植物体の葉から誘導したカルスの
ＧＵＳ活性を測定した結果を示す図である。 Ａ：ｐＢＳ１３１４ Ｂ：ｐＢＳ１８２４ Ｃ：対照群 Ｄ：ｐＢＩ１２１
【図１１ａ】本発明のプロモーター欠失突然変異体を挿
入した煙草の形質転換植物体の葉から誘発したカルスを
懸濁培養して、その細胞の細胞成長曲線を示す図であ
る。
入した煙草の形質転換植物体の葉から誘発したカルスを
懸濁培養して、その細胞の細胞成長曲線を示す図であ
る。
【図１１ｂ】本発明のプロモーター欠失突然変異体を挿
入した煙草の形質転換植物体の葉から誘発したカルスを
懸濁培養して、その細胞のＧＵＳ活性を測定した結果を
示す図である。
入した煙草の形質転換植物体の葉から誘発したカルスを
懸濁培養して、その細胞のＧＵＳ活性を測定した結果を
示す図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 リ ヘン−スーン 大韓民国 テジョン−シ 305−755 ユソ ング−ク アン−ドン ハンビット アパ ートメント ＃126−502 (72)発明者 クワン スク−ヨン 大韓民国 テジョン−シ 305−755 ユソ ング−ク アン−ドン ハンビット アパ ートメント ＃102−1802 (72)発明者 キム ケー−エン 大韓民国 テジョン−シ 301−080 チャ ング−ク ジャンチョン−ドン ヒュンダ イ アパートメント ＃106−504
Claims (11)
- 【請求項１】 配列番号１で示される塩基配列の全体又
はその一部からなり、ｓｗｐａ２塩基配列又はその変異
体で構成されるＤＮＡ配列によってコードされるペルオ
キシダーゼをコードするゲノム遺伝子。 - 【請求項２】 配列番号２で示される塩基配列の１〜１
８２４の塩基又はその一部からなり、プロモーター活性
を示すＤＮＡ配列。 - 【請求項３】 該プロモーター活性が環境ストレスによ
って誘発される請求項２記載のＤＮＡ配列。 - 【請求項４】 該環境ストレスが損傷又は創傷、活性酸
素種、熱、水分、温度、塩、大気汚染、紫外線、又は重
金属によるストレスである請求項３記載のＤＮＡ配列。 - 【請求項５】 配列番号２で示される塩基配列の１〜１
８２４の塩基又はその一部からなる、プロモーター活性
を示すＤＮＡ配列及びこれと作動可能に連結され得る有
用物質をコードするＤＮＡ配列からなるＤＮＡ構造体。 - 【請求項６】 該プロモーター活性を示すＤＮＡ配列
が、ＡＢＡ、メチルチャスモネート、損傷又は創傷、低
酸素症、活性酸素症、熱、又は窒素に対するストレスを
認識する因子を含む請求項５記載のＤＮＡ構造体。 - 【請求項７】 １）配列番号２で示す塩基配列の１〜１
８２４の塩基又はその一部からなる、プロモーター活性
を示すＤＮＡ配列及びこれと作動可能に連結され得る有
用物質をコードするＤＮＡ配列を挿入した発現ベクター
を構築する工程； ２）宿主細胞を該発現ベクターで形質転換する工程；及
び ３）発現ベクターを挿入した該形質転換体を選別する工
程で起きるストレスによって有用物質の生産が誘発され
る形質転換体を製造する方法。 - 【請求項８】 該有用物質が薬理効果を奏する蛋白質又
はペプチド、又はストレスに対する耐性を形質転換体に
付与する物質である請求項７記載の方法。 - 【請求項９】 該工程２）の宿主細胞が、植物細胞、動
物細胞及び微生物からなる群から選ばれる請求項７記載
の方法。 - 【請求項１０】 該形質転換体が、微生物、植物細胞、
植物体及びこれらに由来したカルスからなる群から選ば
れる請求項７記載の方法。 - 【請求項１１】 請求項７記載の方法によって生産され
た形質転換煙草カルス（受託番号：ＫＣＴＣ ０８７５
ＢＰ）。
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| KR1999-47361 | 2000-10-18 |
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