JP5079799B2 - トキソフラビンとその誘導体分解遺伝子tflAとこれを発現する形質転換生物体 - Google Patents
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Description
(i)プロモーター配列、
(ii)トキソフラビン分解酵素コーディング配列、及び
(iii)3’非翻訳(untranslated)ターミネーター配列。
Paenibacillus polymyxa菌株は、28℃、液体LBまたは固体LB培地で培養した。全てのEscherichia coli菌株は、37℃、液体LBまたは固体LB培地で培養した。使用した抗生剤の濃度は、次のようである:リファンピシン(rifampicin)50μg/ml; テトラサイクリン(tetracycline)10μg/ml、カナマイシン(kanamycin)30μg/ml; アンピシリン(ampicillin)100μg/ml;クロラムフェニコール(chloramphenicol)25μg/ml。
1.染色体DNAの準備
Paenibacillus polymyxa染色体DNA抽出は、lysozyme-sodium dodecyl sulfate(SDS)溶解法を変形して行った(Leach et al. 1990)。バクテリアは、適切な抗生剤が含まれた500ml LB培地で230rpm、28℃で培養した。バクテリア細胞は遠心分離して得て、バクテリアペレットは、1ml 0.9% NaCl溶液で洗浄し、330μl GTE(50 mM glucose, 25 mM Tris-HCl [pH 8.0], 10 mM EDTA [pH 8.0])溶液で溶かした後、3μlリソザイム(50 mg/ml)を添加して、37℃で30分間反応する。細胞は、17μl 10% SDSを添加して壊し、37℃で10分間反応する。10μl RNaseA(10 mg/ml)を添加した後、37℃で1時間反応する。17μl 0.5M EDTAを添加して37℃で10分間反応する。2.5μl proteinase K(20 mg/ml)溶液を添加して、37℃で6時間反応する。25:24:1(v:v:v)フェノール:クロロホルム: イソアミルアルコール(phenol: chloroform: isoamyl alcohol)を添加して5分間激しく混ぜる。16,816×g、5分間遠心分離した後、上清液は新しいチューブに移し、フェノールを入れて抽出過程を2回行う。24:1 (v:v)クロロホルム:イソアミルアルコール(chloroform: isoamyl alcohol)を、新しいチューブに移した上清液と同じ容量入れて、0.1容量の3 Mナトリウムアセテート[pH 7.0]と2容量の95%エタノールを入れて16,816×g、15分間遠心分離する。遠心分離後、上清液は気をつけて捨て、ペレットは70% エタノールで洗浄する。エタノールが全て蒸発すると、ペレットは、0.2 ml TE [pH 8.0]を入れて溶かした後、−20℃に保管する。
E. coli プラスミドDNAは、アルカリ分解法(alkaline lysis method, Sambrook et al., 1989)により行った。E. coli 細胞は、適切な抗生剤を入れて、2 ml LB培地、200 rpm、37℃で培養した。バクテリア細胞は、16,816×g、1分間遠心分離して得た。上清液は除去し、バクテリアペレットは、100μl ice-cold solution I(50 mM glucose, 25 mM Tris-HCl [pH 8.0], 10 mM EDTA [pH 8.0])を入れてよく混ぜた後、5μl of RNaseA solution(20μl/ml)を添加した。200μl solution II(0.2 N NaOH, 1% SDS)を添加した後、やさしくよく混ぜて150μl ice-cold solution III (5 M potassium acetate 60 ml, glacial acetic acid 11.5 ml, sterile distilled water 28.5 ml)を入れてよく混ぜる。バクテリア溶解物は、16,816×g、4℃で10分間遠心分離した後、フェノール処理後、上清液のみを新しいチューブに移して、1ml 95%エタノールを入れてよく混ぜる。DNAペレットは、16,816×g、4℃で15分間遠心分離する。ペレットは、70%エタノールで洗浄して除去する。ペレットは、30μl TE [pH 8.0]に溶かして4℃に貯蔵する。
制限酵素、calf intestinal alkaline phosphatase, T4 DNA ligaseと、他の関連試薬は、Takara (Japan), Boehringer Mannheim (Mannheim, Germany), Stratagene (La Jolla, CA), Gibco BLR (Gaithersburg, MD)及びSigma (St. Louis, MO)で購入した。分析条件は指針書に従った。バクテリアDNAは、多様なendonucleasesで切断した後、0.5×TBE (45 mM Tris-borate, 1 mM EDTA)バッファーを利用して0.7% (w/v)アガロースゲル(Sigma)で分離する(Ausubel et al., 1991)。DNAをよく混ぜて、ゲルローディングバッファー(0.25% ブロモフェノールブルー(bromophenol blue)、0.25%キシレンシアノールFF(xylene cyanol FF)、15% ficoll in water)でローディングする。ゲルは、0.5μl/ml ethydium bromide溶液に30分間染色した後、トランスイルミネーター(transilluminator)で観察する。
アガロースゲルでDNA切片分離は、QIAEX II gel extraction kit (150) (QIAGEN, Germany)を利用する。
Maniatis et al. (1982)が記述した通りに、カルシウムクロライド(calcium chloride)を利用したE. coli 形質転換を行った。E. coli competent cellsを準備するために、12時間培養後、exponential phase (A600=0.6)になるまで、230 rpm、37℃で培養した。培養液を集めて20分間氷に入れておいてから、4℃、2,700×gで遠心分離してペレットを得た後、氷中に保管しておいたCaCl2溶液(sterilized 10 mMカルシウムクロライドと10%グリセロール)でよく混ぜる。20分間氷中で反応した後、2,700×g、4℃、10分間遠心分離した。ペレットは、氷に保管しておいたCaCl2溶液を適当に入れて、よく混ぜる。混合物は、予め冷却させた遠心分離用チューブに0.1 mlずつ分株して、使用前まで−70℃に保管する。形質転換のために、15μlライゲーション混合物(ligation mixture)に85μl TEを入れる。氷で徐々に溶かしたcompetent cellに、予め冷却しておいたライゲーション混合物を入れ、注意して混ぜた後、20分間反応する。42℃、1ml LBで熱衝撃を加えた後、細胞を37℃で1時間振とう(shaking)なしに培養する。細胞は、適切な抗生剤が添加されたLB固体培地によく敷いて培養する。
1mgの畑の土に2ml最小培地を添加する。37℃で48時間培養した後、40μl/mlトキソフラビンの含まれたLB寒天培地によく敷いて培養する。1〜2日間培養した後、単一コロニーを分離する。滅菌した稲の種は、滅菌後、5ml最小培地で37℃、24時間培養後、40μl/mlトキソフラビンを添加して48時間培養した後、40μl/mlが含まれたLB寒天培地に培養液をよく敷いて2〜3日間培養した後、単一コロニーを分離して、純粋な単一コロニーを得るために、もう一回LB寒天培地によく敷いて培養する。
分離した菌株を同定するために、生理学的特性と培養特性をBiologプログラム分析、GC-FAME(gas chromatography of fatty acid methyl esters)、16S rDNAシーケンス分析を通じて調べた。
P. polymyxa JH2培養液500 mlで染色体DNAを準備し、Sau3Aで部分的に切断する(partially digested)。長さ20〜30kbの切片を24,000 rpm、24時間室温でsucrose gradient centrifugation (10 to 40% [wt/vol])で分離し、pLAFR3 (Tra-, Mob+, RK2 replicon, Tetr, Staskawicz et al., 1987)と連結する。
ライブラリーは、LB液体培地で230 rpm、37℃で培養してスクリーニングした。40μg/mlトキソフラビンが添加されたLB液体培地で3時間培養した後、12時間をさらに培養した。液体培地をトキソフラビン40μg/mlが添加されたLB固体培地によく敷いて培養した。この固体培地では、37℃、1日間培養して、コロニーを観察することができた。
1.シーケンシング反応
鋳型プラスミドDNAは、QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN, Germany)を指針書通りに使用した。1μg BigDye terminatまたはready reaction mixが含まれた試薬(reagents)、2 pmol T7プロモータープライマー、鋳型プラスミドDNA 5μl(100-200ng)を入れてよく混ぜた。反応物は、0.2 ml PCRチューブに入れてthermal cycler(MinicyclerTM PTC-150(MJ Research, Watertown, MA))を利用し、95℃で5分間熱を加えた後、次のような条件で25サイクル増幅過程を行った; 20 sec, 95℃/10 sec, 55℃/4 min, 60℃。
シーケンシング反応が完了した後、PCR産物(10μl)は、1.5ml遠心分離チューブに移す。17試薬(reagents)(26μl蒸留水、64μl 95%エタノール)を10μl反応産物に添加してよく混ぜた後、15分間室温に置く。16,816×g、室温で20分間遠心分離後、上清液は捨てて、ペレットは250μl 70%エタノールで洗浄した後、空気中で乾燥し、-20℃で保管する。
pJ9(コスミドライブラリーがクローニングされたプラスミド)挿入DNAは、適切な制限酵素で切断し、シーケンシングの前にpBluescript II SK(+)にサブクローニングする。Universalプライマー(配列番号5)とreverse primers(配列番号6)は、基礎反応に使用して、合成プライマー(配列番号7及び8)は、完全な二本鎖のシーケンシングのために使用した。DNAシーケンスデータは、BLASTプログラム(Gish and States, 1993)、MEGALIGNソフトウェア(DNASTAR)とGENETYX-WINソフトウェア(Software Development, Tokyo, Japan)で分析した。
P.polymyxa JH2のtflAは、配列番号9と10を有するプライマーを利用したPCRで増幅し、pET14bベクター(Novagen, Madison, WI, USA)のNdeI/BamHIでクローニングした。pET14bの入ったE. coli BL21 (DE3) (pLysS)菌株は、アンピシリンとクロラムフェニコールが添加されたLB液体培地で培養し、攪拌しながら37℃で培養した。OD600nmが0.8になった時、最後の濃度が1 ml IPTGとなるように培地に添加し、37℃で2時間攪拌して培養した後、遠心分離により細胞を獲得した。50mMリン酸ナトリウム(50mM sodium phosphate, pH 6.5)を入れて、ペレットをよく混ぜた後、ソニケーションする(sonicated)。遠心分離後、部分的に精製されたタンパク質は、スタンダード(standard)としてBSAを使用したBradford 方法により測定した(Bradford, 1976)。タンパク質は、SDS-PAGE後、クーマシーで染色して観察した。
より一層きれいな精製のために、N-末端His-tagged TflAを使用した。tflAがクローニングされたpET14bベクター(Novagen, Madison, WI, USA)を含むE. coli BL21 (DE3)(pLysS) LB液体培地で培養し、タンパク質は、IPTG誘導により過発現された。細胞を集めた後、50 mMリン酸ナトリウム(pH 6.5)を入れて、超音波法(sonication)で細胞を壊した後、10,000×g、20分間4℃で遠心分離する。上清液をNi-NTAスピンカラム(QIAGEN, Valencia, CA, USA)でローディングする。His-tagged proteinを1,000×g、2分間4℃で遠心分離し、Ni-NTAマトリックスに付着する。マトリックスに付いているタンパク質は、洗浄バッファー(20 mMイミダゾール、50 mMリン酸ナトリウム(pH 6.5))で2回洗浄し、付着していないタンパク質は除去する。His-tagged proteinは、順に0.1 ml elution buffer 1 (10 mMイミダゾール、50 mMリン酸ナトリウム(pH 6.5))を入れて、0.1 ml elution buffer 2 (10 mMイミダゾール、50 mMリン酸ナトリウム(pH 6.5))を入れて溶かし分離する。溶かして分離したタンパク質は、イミダゾールを除去するために、50 mMリン酸ナトリウム(pH 6.5)を利用して透析する。精製されたタンパク質濃度は、スタンダードとしてBradfordを利用して測定する(Bradford, 1976)。
1.酵素分析
TflA活性度は、thin layer chromatography (TLC) plateを利用したトキソフラビンと酵素反応混合物の反応生成物の変化を測定して分析した。分析バッファー(50 mMリン酸ナトリウム(pH 6.5))に5μM TflAタンパク質、10 μM MnCl2と5 mM DTT (Dothiothreitol)を入れて200μl混合物を製造し、25℃で反応した。トキソフラビンは、反応を始める直前に最終濃度が100 μMとなるように添加する。10分後に200μlクロロホルムを添加して反応を中止する。クロロホルム層を完全に乾燥した後、10μlの100%メタノールを添加する。メタノールがある反応物は、ピペットでTLCに加え、クロロホルム:メタノール(chloroform:methanol, 95:5, V:V)溶媒を含むTLCチャンバーに入れて室温に置く。TLCは、UV(254, 365 nm)下で検出する。
酵素活性において、金属イオンの効果を調べ、全てのイオンは、1mM濃度で調べた。
TflA活性は、50mMリン酸ナトリウム(pH4.0〜8.0)バッファーを利用して、25℃で多様なpH範囲で調べた。酵素活性は、50mMリン酸ナトリウム(pH6.5)バッファーを利用して10〜40℃範囲で調べた。
力学媒介変数(Km and Vmax)は、他のトキソフラビンの濃度(80-200 μM)を利用してLineweaver-Burk plotで決定される。それぞれの実験ポイントは、少なくとも3回試みた値の平均で決定される。
山野地土壌、田・畑土壌、稲の種子などから500余種の細菌を分離し、トキソフラビンを添加した栄養最小培地(minimal medium)に培養した後、毒素分解後、育つ細菌を分離した。稲の種子から分離された細菌の中、トキソフラビンを分解する細菌を純粋分離して、16s DNAヌクレオチド配列分析、脂肪酸分析、Biolog分析システムを利用して同定した。同定結果、Paenibacillus polymyxaに同定されて、JH2と命名した(図1)。P. polymyxa JH2から染色体DNAライブラリー(genomic DNA library)をE. coli HB101に製作して、ライブラリークローン(library clone)の中、毒素培地に育つコロニー(colony)を選抜した。分離されたDNAクローン(DNA clone)から制限酵素で切断して作ったクローンで、毒素分解に必要な最小DNA切片を確認した(図2)。毒素分解に必要な最小クローンである1.5kb EcoRI切片をヌクレオチド配列分析を通じて666 bpのORFを確認した(配列番号1)。NCBI BLAST分析を通じてExiguobacterium sp.のring-cleavage extradiol dioxygenaseと67.3%の類似性(similarity)があることを確認した(図3)。トキソフラビン分解に係わる遺伝子tflAは、今まで報告されたことのない新種有用遺伝子であるが明かされた。
トキソフラビン分解遺伝子(tflA)を発現されるために、pET14-b(T7プロモーター発現ベクター, Ampr, Novagen)を利用した。PCRを利用して増幅された遺伝子をpBluescript II SK(+) (ColEI, MCS-lacZα, Ampr cloning vector, Ampr, Stratagene)にクローニングしてヌクレオチド配列分析後、PCRによる問題のないクローンを再びpET14-bにクローニング(pH904)した。pH904をE. coli BL21 (DE3/pLysS)に形質転換してIPTG (1 mM)で誘導した後、Ni-columnでHis-TflA (26.7 kDa)タンパク質を精製した(図4A)。精製したTflAタンパク質でトキソフラビン分解検定を通じてDTTとMn2+が共に存在する時に毒素が分解されることを確認した(図4B)。
1)トキソフラビンと誘導体合成
TflAによる毒素分解メカニズムを研究するために必要な毒素とその誘導体を、共同研究を進行している日本岡山大学のTomohisa Nagamatsu教授から化合物を提供してもらった(図7)。トキソフラビンを基本構造として3番炭素にmethyl基がある3−Methyltoxoflavin、 4,8番窒素に水素を有した4,8-Dihydrotoxoflavin、3番炭素にmethyl基と4,8番窒素に水素を有した3'-Methyl 4,8-Dihydrotoxoflavin、1番窒素の代わりに8番窒素にmethyl基を有したfervenulin、3番炭素にphenyl基を有した3-Phenyltoxoflavin、ring構造をさらに一つ有している5-Deazaflavin、1番窒素にmethyl基がないreumycin、reumycin構造の3番炭素にmetyl基を有した3-Methylreumycin、3番炭素にphenyl基を有した3-PhenylreumycinなどでTflAによる分解を検定した。
分離精製されたTflAタンパク質でtoxoflavinと誘導体分解を検定した結果、与えられた時間内にToxoflavin, 3-Methyltoxoflavin, 4,8-Dihydrotoxoflavin, 3-Methylreumycinは、完全に分解されて、3-Phenyltoxoflavin, 3-Phenylreumycin, 5-Deazaflavinは、分解されなかった。reumycin, 3-Methyl 4,8-Dihydrotoxoflavin, fervenulinは、一部分解が進行されたが、完全分解には及ばなかった。要するに、3番炭素にphenyl基があるものは分解が進行されなかったことから、TflAタンパク質は、toxoflavinの3番炭素周辺のring構造を認識すると考えられる(図8)。
トキソフラビン分解のためのHis-TflAのMichaelis constant (Km)、最大反応速度(maximum reaction rate, Vmax)、そして特異的活性を調べた。毒素分解活性は、TLC分析を通じて確認した。His-TflAのKmとVmax値は、それぞれ69.72μMと-0.45 U/mgとして確認され、特異的活性は、0.4 μmol/mgであった(図9)。
形質転換に使用されたベクターは、pCamLA(図10)であって、T-DNA内部にハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(hygromycin phophotransferase, HygR)を含んでおり、T-DNA外部に(kanamycin)抵抗性遺伝子を有している。形質転換に使用した菌株は、Agrobacterium tumefaciens LBA4404を使用した。AB最小培地(AB minimal medium)でアグロバクテリウムを培養して、細胞(cell)を回収し、acetosyringone(3,5-dimethoxy-4-hydroxy acetophenone, Aldrich)の含まれたAA液体培地に希釈した後、用意したドンジン、秋晴、日本晴カルスを3〜5分間浸漬した。接種されたカルスは、滅菌されたろ過紙で水分を除去した後、培養器にカルスを値床して3日間28℃の暗条件でアグロバクテリウムと共同培養した。3日間培養されたカルスからアグロバクテリウムを除去して、N6最小培地(N6 selection medium)に置床した。光条件(25℃)で30日間培養して、増殖されたカルスのみを選抜した。選抜培地で増殖されたカルスを再分化培地に値床して、再分化された植物体を、生長調節物質が添加されていない培地に移植して根を誘導した(図11)。ハイグロマイシンの含まれた培地で新梢(shoot)と根(root)が正常的に生育した個体のみを選抜して純化させた後、ポット(pot)に形質転換植物を移植して、温室で栽培管理した。反復実験から得られた形質転換植物体の中、外形的に正常的な生育過程を経た植物体から、表1に示したようにT1またはT2 plantを確保した。
1)サザンブロット分析
T2世代の形質転換植物体稲の葉肉組織1gから、標準的な過程を通じて染色体DNA(genomic DNA)を抽出した。染色体DNA 15-20μgを制限酵素EcoRIで処理し、0.7%アガロースゲルで展開後、膜(membrane)にブロッティング(blotting)した後、ハイブリゼーション(hybridization)した。2.5 KbのtflA 断片(3'nos terminator含み)がプローブDNAとして使用された。T2世代の形質転換植物体の葉肉組織のDNAを、tflAプローブを利用してサザンブロット分析を行った結果を図12Bと表2に示した。ドンジンと秋晴の二つの品種とも、多様な挿入パターン(integration pattern)とコピー数(copy number)を確認することができた。
T2世代の形質転換植物体稲の葉肉組織300mgを採取して、液体窒素で粉砕した後、破砕バッファー(50 mM Tris-HCl pH7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10%グリセロール、1mM PMSF, 0.05% Tween 20, protease inhibitor cocktail)を添加して攪拌した後、遠心分離(4℃, 15,000rpm, 15分)して上澄み液を得て、これを再び遠心分離して、トータル可溶性タンパク質(total soluble protein)を抽出した。2×サンプルバッファーにトータル可溶性タンパク質(total soluble protein)15μlを添加して100℃の沸く水で5分間加熱後、SDS-PAGEに展開させて、これをPVDF膜にブロッティングした。膜をブロッキング溶液(blocking solution, 5% skip milk in TBS-T)でブロッキングして、anti-TflA抗体とimmunoPure Antibodyを処理した後、NBT/BCIP Detection Kit (Amersham, England)で検出した。図13に示したように、T2世代の形質転換植物体でTflAが正常的に発現されることが分かった。
ハイグロマイシンが含まれた選抜培地で新梢と根が正常的に生育した固体のみを選抜して純化させた後、形質転換植物体をポットに移植して、温室で栽培管理した。反復実験で得られた形質転換植物体の中、外形的正常的な生育過程を経た植物体からそれぞれ採種した種子(T1,T2)を利用して、ハイグロマイシン抵抗性検証に使用した。完熟種子の種皮を除去して、100%エタノールに1分間浸漬した後、2%次亜塩素酸ナトリウム(sodium hypochloride)溶液に20分間攪拌しながら表面殺菌した。表面殺菌された種子を滅菌水で3回洗浄して、ハイグロマイシン(50 mg/L)を添加した1/2 MS培地に種子を値床した。培養は、26℃ 3000 luxの連続光条件で行われて、抵抗性検証は、値床10日後に幹と根の伸長を観察して調査した。それぞれの植物体から採種した種子を利用してハイグロマイシン抵抗性遺伝子の分離比を調査して、表2に示したように、二つの品種の形質転換稲T3 plantを確保して研究を行った。
T3世代の形質転換稲の4〜5葉期の葉を利用して、トキソフラビンに対する対抗性検証を行った。先行研究により、トキソフラビンが活性化されるに光が要求されることが分かり、光が維持される条件で実験を行った。直径が60×15mmであるペトリディッシュに殺菌水5mlを入れて、0, 25, 50, 100μM濃度のトキソフラビンを処理した。3×4 mmの大きさに切った4〜5 葉期の稲葉をトキソフラビンに処理して、28℃で16時間の光条件、25℃で8時間の暗条件が維持される生長箱に48時間置いた。図14から分かるように、トキソフラビンを処理した後、40時間後に野生稲の葉から毒素による変色反応が現れ始めたが、tflAが導入された形質転換稲葉では、トキソフラビン処理による変色反応が進行されなかった。
形質転換に利用されたベクターは、pCamLA及びpTflAである。pCamLA(図15)は、T-DNA内部にハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(Hygromicin phophotransferase, HygR)を含んでおり、T-DNA外部にカナマイシン(kanamycin)抵抗性遺伝子を有している。pTflAは、T-DNA内部にトキソフラビン分解酵素(tflA)を含んでおり、35Sプロモーター及びNOSターミネーターを有している(図16)。
1)カルス誘導
種子(稲種)は、前年度採種種子を使用した。カルスを誘導する過程は、下記のようである。
1.稲を剥いて良質のもののみを選別する(米の胚芽が落ちないように注意)
2.Falconチューブに入れて100%エタノールで30秒間振る。
3.1/2ラックスを入れて、振とうインキュベーターで20分間インキュベーションする。
4.滅菌水で4〜5回洗浄する。
5.カルス誘導培地(2N6 free media)に移す時、胚芽が上方になるようにして載せる。
(1)同時接種(co-inoculation)(暗条件)
同時接種3日前に誘導されたカルスを新しい2N6培地に載せて、翌日アグロバクテリウム培養をした。
1.48時間アグロバクテリウムを培養する。
2.3000rpmで5分間遠心分離して細胞を沈殿させる。
3.AAM培地に希釈して、OD660 = 0.1となるようにする。
4.カルスをチューブに適量入れて、30秒間上記AAM培地に浸す。
5.30秒後に上清液は捨てて、ろ過紙に振り撒いて乾燥させる。
6.20〜30分間乾燥する間、ペトリディッシュにろ過紙を敷いてAAM 1〜2mlで流れない程度に湿す。
7.乾いたカルスをろ過紙上に載せて、ホイルで包んだ後、24℃で3日間インキュベーションする。
1.2N6 +ハイグロマイシン(植物選択マーカー)10 mg/L(200 ul-50 mg/ml) +セファトキシン250 mg/L(1 ml-250 mg/ml)培地を製作する。
2.3日間培養されたカルスを滅菌されたチューブに入れて、滅菌水で一回洗浄する。
3.滅菌水50 ml + セファトキシン50 ulにそれぞれ20分間ずつ3回洗浄する。
4.ろ過紙上に振り撒いて乾かす。
5.第1選択培地に値床する。
6.ホイルで包んで28℃でインキュベーションして、7日間観察する。
1.2N6 +ハイグロマイシン30 mg/L(600 ul-50 mg/ml) +セファトキシン250 mg/L(1 ml-250 mg/ml)培地を製作する。
2.暗く変わった部分は、抵抗性を有していない部分であるため除き、白い部分のみを第2選択培地に値床する。
3.3週間観察する。
(5)3週間第2分化培地(明条件)
(6) Bottle 1/2 MS
2N6培地 1L−オートクレーブ
ハイグロマイシン(50 mg/ml) 200 ul (最終濃度150 mg/L)
セファトキシン(250 mg/ml) 1 ml (最終濃度 1650 mg/L)
カルス第2選択培地
2N6培地 1L−オートクレーブ
ハイグロマイシン(50 mg/ml) 600 ul
セファトキシン(250 mg/ml) 1 ml
1)既存の形質転換ベクターとtflAを利用した新規形質転換ベクターの比較分析
既存の形質転換ベクターとtflAを利用した新規形質転換ベクターの比較分析を行った。トキソフラビンとハイグロマイシン抵抗性遺伝子を有しているpCamLA:tflAとpCamLA:tflAからハイグロマイシン抵抗性遺伝子が欠損されたpCamLA (△hpt):tflA及びtflAを二元(binary)ベクターのpMBP1に挿入したpMBP1:tflAをもって、既存の形質転換ベクターとしてよく使われるpMBP1と比較分析を行った。
それぞれの構築物が入っているアグロバクテリウムを利用して、シロイヌナズナCol-Oにそれぞれ形質転換させる。形質転換は、下記のように行った。
1.シロイヌナズナCol-Oを、花が咲くまでポットで育てる。花茎が出て、花が咲き始まると、鋏で花茎を切る。
2.形質転換される遺伝子が入っているアグロバクテリウムをLBブロスで一晩中培養する。
3.培養されたアグロバクテリウムを遠心分離して、5%スクロースにO.D.=0.8程度に懸濁した後、0.03% silwetを入れる。
4.花茎を切って1週間後に、5%スクロース懸濁液に新しく出た花茎を2〜3秒間浸す。
5.植物をビニール袋を利用して包む。二日後にビニールを完全に除去する。
(1)選抜された形質転換体のPCR
選抜された植物をポットに移して植えた後にtflA遺伝子が形質転換されたことを、組織PCRを通じて確認した。PCRプライマーは、tflA配列に基づいてデザインして、アニーリング温度55℃で行った。PCRプライマーは、tfla140-U (5'-TGCAGCTGCTGATGGAACAAA-3';配列番号15)とTFLA370-L (5'-TTATCCAGTACAGGTGCAGCT-3';配列番号16)を使用した。図23は、選抜された形質転換体の分離されたゲノムDNAからPCRを行って、PCR産物をアガロース電気泳動した結果である。pCamLA:tflA (1-1〜1-10)、pCamLA (△hpt):tflA (2-1〜2-12)、そしてpMBP1:tflA (3-1〜3-11)それぞれの構築物が入っている形質転換体をPCRで確認した結果、トキソフラビンが入っているプレートで正常的に発芽して根の発育も正常的になされた植物は、対照群(tflA遺伝子)と同一なバンドを確認することができ、根の発育が正常的ではない植物は、バンドを確認することができなかった。したがって、トキソフラビンを選択マーカーとして使用できることを確認することができた。
イネもみ枯細菌病の病原性を決定する要素であるトキソフラビンは、植物に処理する場合、共通的に現れる現象は、光依存的な脱色効果である。シロイヌナズナCol-Oを利用して、多様な濃度のトキソフラビンを処理した結果、低い濃度でも脱色効果を確認することができた。このような現象を利用して形質転換体を試験した。図24は、形質転換体及び非−形質転換体の脱色効果を示した図である。選抜された形質転換体は、光脱色効果が現れなく、非−形質転換体は、光脱色効果が現れ、上記のPCR結果と一致することを確認することができた。したがって、トキソフラビンの選択マーカーとしての利用が、既存の抗生剤を利用して使用していたマーカーと比較し、抗生剤を使用しなくても、所望の遺伝子を植物に形質転換できるシステムの構築が可能であると考えられる。
Claims (14)
- 5’から3’方向に作動可能に連結された下記配列を含む植物形質転換選択マーカー発現カセット:
(i)植物において作動可能なプロモーター配列、
(ii)配列番号1のヌクレオチド配列と90%以上の配列相同性を有するトキソフラビンまたはトキソフラビン誘導体分解酵素コーディング配列、
(iii)3’非翻訳(untranslated)ターミネーター配列。 - (i)プロモーター配列、(ii)目的タンパク質コーディング配列、(iii)3’非翻訳(untranslated)ターミネーター配列を含む目的タンパク質発現カセットをさらに含むことを特徴とする、請求項1に記載の発現カセット。
- 前記トキソフラビンまたはトキソフラビン誘導体分解酵素コーディング配列は、配列番号1のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項1に記載の発現カセット。
- 請求項1乃至3のいずれか1項に記載の発現ベクターカセットを含む組み換えベクター。
- 請求項4に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
- 請求項4に記載のベクターで形質転換された植物。
- 稲またはシロイヌナズナであることを特徴とする、請求項6に記載の植物。
- 請求項7に記載の植物の形質転換(transgenic)種子。
- 請求項4に記載のベクターで植物または植物の一部または植物細胞を形質転換するステップと、
前記形質転換体をトキソフラビンまたはトキソフラビン誘導体含有培地で増殖させるステップと、
を含む形質転換植物の選択方法。 - 請求項4に記載のベクターで植物細胞を形質転換するステップと、
前記形質転換植物細胞をトキソフラビンまたはトキソフラビン誘導体含有培地で増殖させるステップと、
前記形質転換された植物細胞から形質転換植物を再分化するステップと、
を含む形質転換植物の製造方法。 - 前記トキソフラビン誘導体は、3番炭素にフェニル基(Phenyl group)を有しないことを特徴とする、請求項1に記載の発現カセット。
- 前記トキソフラビン誘導体は、3−メチルトキソフラビン(3-methyltoxoflavin)、4,8−ジヒドロトキソフラビン(4,8-dihydrotoxoflavin)、3−メチルレウマイシン(3-methylreumycin)、レウマイシン(reumycin)、3−メチル4,8−ジヒドロトキソフラビン(3-methyl 4,8-dihydrotoxoflavin)及びフェルベヌリン(fervenulin)からなる群から選択されることを特徴とする、請求項11に記載の発現カセット。
- 前記トキソフラビン誘導体は、3番炭素にフェニル基を有しないことを特徴とする、請求項9または10に記載の方法。
- 前記トキソフラビン誘導体は、3−メチルトキソフラビン、4,8−ジヒドロトキソフラビン、3−メチルレウマイシン(3-methylreumycin)、レウマイシン(reumycin)、3−メチル4,8−ジヒドロトキソフラビン(3-methyl 4,8-dihydrotoxoflavin)及びフェルベヌリン(fervenulin)からなる群から選択されることを特徴とする、請求項13に記載の方法。
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