KR20130045028A - 감자 유래의 괴경 조직 특이적 라케이즈 프로모터 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 감자 (Solanum tuberosum) 유래의 괴경 조직 특이적 라케이즈 (laccase) 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터, 상기 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환된 식물체 및 이의 종자, 상기 재조합 식물 발현 벡터에 외래 유전자를 재조합하는 단계; 및 상기 재조합된 식물 발현 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 포함하는 외래 유전자를 형질전환 식물체에서 괴경 조직 특이적으로 발현시키는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 외래 유전자가 괴경 조직 특이적으로 발현되는 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

Description

감자 유래의 괴경 조직 특이적 라케이즈 프로모터 및 이의 용도 {Tuber tissue-specific laccase promoter from Solanum tuberosum and uses thereof}

본 발명은 감자 유래의 괴경 조직 특이적 라케이즈 프로모터 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 감자 (Solanum tuberosum) 유래의 괴경 조직 특이적 라케이즈 (laccase) 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터, 상기 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환된 식물체 및 이의 종자, 상기 재조합 식물 발현 벡터에 외래 유전자를 재조합하는 단계; 및 상기 재조합된 식물 발현 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 포함하는 외래 유전자를 형질전환 식물체에서 괴경 조직 특이적으로 발현시키는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 외래 유전자가 괴경 조직 특이적으로 발현되는 형질전환 식물체 및 이의 종자에 관한 것이다.

작물분자육종은 모든 종의 유전자를 재료로 사용할 수 있으며 기존의 게놈 단위로만 가능하던 육종기술을 유전자 단위로 끌어내려 무한대의 육종 효과를 미세하게 조절할 수 있다는 측면에서 차세대 농업을 이끌어 갈 핵심적인 기술이다. 이러한 작물분자육종은 기술의 효과를 극대화시키려면 1) 여러 가지 식물의 유전자를 대표할 수 있는 많은 유전자 데이터의 축적이 선행되어야 하며, 2) 다양한 작물의 형질전환 시스템이 구축되어야 하며, 3) 외부에서 삽입된 유전자의 발현을 조절할 수 있는 다양한 프로모터의 개발이 선행 되어져야 한다. 외래 유전자의 발현을 식물체의 특별한 조직에만 국한시켜 형질전환 목적을 달성하는데 이용되는 공지된 프로모터들은 그 기능에 따라서 다음과 같이 분류할 수 있다.

첫째로, 뿌리 특이 발현 프로모터이다. 아직 상용화된 사례는 없으나 애기장대 퍼옥시다제 (peroxidase, prxEa)가 분리되어 뿌리 특이적 발현을 확인하였고, 최근 고구마 유래의 매즈 유전자 (ibMADS)와 당 유도성 에이디피 글루코즈 파이로포스파타제 (ADP-glucose pyrophosphatase, AGPase) 유전자가 분리되어 해당 프로모터가 뿌리에서 특이 발현을 유도하며 당근, 무에서 뿌리 특이적 일시적 발현을 유도함을 확인하여 특허 출원 (특허공보 2004-0067290, 특허공보 2004-0070820)된 바 있다. 이들 프로모터는 식량이나 식품, 또는 식품의 원료로 사용되는 주요 뿌리작물에서 농업적 형질 개량이나 유용 단백질 축적 및 유용 물질 생성 등을 목적으로 주로 사용이 기대될 수 있다.

둘째로, 종자 특이적 프로모터를 들 수 있다. 대표적인 예로서 벼 주요 저장 단백질 유전자의 프로모터들로서 황금쌀 (golden rice) 개발에 사용된 벼 글루테린 (glutelin) 프로모터가 현재까지 외떡잎 식물의 종자 특이적 발현을 유도하는 경우에 많이 사용되고 있고, 쌍떡잎 식물의 종자 특이적 발현을 유도하는데 주로 사용되는 프로모터로는 콩 유래 렉틴 (lectin) 프로모터, 배추 유래 나핀 (napin) 프로모터 및 애기장대의 종자에서 감마 토코페롤 메틸기 전이효소 (γ-tocopherol methyl transferase:γ-TMT) 유전자 발현을 유도함으로써 비타민 E 생성을 증진시킨 연구에 사용된 당근 유래 DC-3 프로모터 등을 들 수 있으며 들깨 유래 올레오신 (oleosin) 프로모터의 종자 특이 발현 유도를 확인한 사례가 있다. 상기 종자 특이적 프로모터들은 주로 종자 자체가 식량이나 식품 또는 식품의 원료로 사용되는 주요 작물에서 유용 단백질 축적 및 유용 물질 생성 등을 목적으로 주로 사용되고 있다.

셋째로, 전신발현 유도 프로모터를 들 수 있다. 식물 전신발현 유도 프로모터로는 꽃양배추 모자이크 바이러스 (CaMV: cauliflower mosaic virus)의 35S RNA 유전자의 프로모터가 대표적인 쌍떡잎식물용 프로모터로 사용되고 있으며, 벼 등의 외떡잎식물용 전신발현 유도 프로모터로는 벼 액틴 (actin) 및 옥수수 유비퀴틴 (ubiquithin) 유전자 프로모터들이 주로 이용되어 왔으며, 최근 벼 시토크롬 C 유전자 (OsOc1)의 프로모터가 국내 연구진에 의해 개발되어 사용 중에 있다 (대한민국 특허 등록 2001-0429335). 이들은 식물형질전환 기본 운반체 내에 선발마커로 이용되는 항생제나 제초제 저항성 유전자 및 리포터 유전자의 발현을 유도하기 위해 이미 내재되어 있으며, 연구적인 측면에서 목적하는 유전자의 식물체내 기능을 밝히고자 시도할 때 우선적으로 고려되는 프로모터들이다.

넷째로, 잎 등의 기타 조직 특이 프로모터를 들 수 있다. 잎 등의 광합성 조직에서만 강력한 유전자의 발현을 유도하는 벼와 옥수수 유래의 알비씨에스 (rbcS: ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit) 프로모터, 아그로박테리움 유래의 식물 뿌리 발현을 유도하는 RolD 프로모터, 감자 유래 괴경 특이 발현 유도 파타틴 (patatin) 프로모터, 토마토 유래의 과실 성숙 특이 발현 유도 피디에스 (PDS: phytoene synthase) 프로모터, 그리고, 그 기능이 배추 꽃의 화분 특이적임이 확인된 배추 유래 올레오신 (oleosin) 프로모터 등이 포함되며 본 연구소의 연구팀에 의해 꽃의 웅성기관 약의 융단조직 특이 BcA9 프로모터 (참조: 특허 등록번호 10-0435143)를 세포에 독성을 갖는 Bt 단백질 유전자의 발현을 유도케 함으로써 웅성불임 작물을 개발하여 특허 등록한 사례가 있다.

그 외에도 다양한 목적에 따른 다양한 식물 유래의 식물체 각 조직에 대하여 많은 수의 프로모터들이 보고되었고 현재에도 계속 개발이 진행 중이지만, 상용화 되었거나 식물 연구자들 사이에 범용되는 프로모터의 종류는 이상에서 언급된 경우에 대부분 속하며, 개발자의 의도에 따라서 보다 정밀하게 유전자 발현의 부위를 조절할 수 있는 새로운 프로모터들이 앞으로도 계속 개발될 필요성이 있다.

한편, 한국공개특허 제2010-0028839호에는 들깨의 종자저장단백질을 이용한 메티오닌 고 함유 형질전환체 및 그 제조방법이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2009-0021655호에는 참깨의 모상근 유래 디하이드로아스코르베이트 리덕타제 유전자로 형질전환된 감자가 개시되어 있고, 한국공개특허 제1998-702105호에는 식물에서의 슈크로스 포스포릴라제의 발현이 개시되어 있고, 한국등록특허 제10-0210352호에는 아밀로펙틴형 전분을 생성하기 위한 감자의 유전공학적 변성이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 감자 유래의 괴경 조직 특이적 라케이즈 프로모터에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명에서는 감자 괴경의 상처에 의해 유도되는 라케이즈 유전자의 프로모터가 감자 괴경에서만 특이적으로 발현되는 것을 확인하였고, 라케이즈 프로모터의 염기서열을 밝힘으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 감자 (Solanum tuberosum) 유래의 괴경 조직 특이적 라케이즈 (laccase) 프로모터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환된 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 식물 발현 벡터에 외래 유전자를 재조합하는 단계; 및 상기 재조합된 식물 발현 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 포함하는 외래 유전자를 형질전환 식물체에서 괴경 조직 특이적으로 발현시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 외래 유전자가 괴경 조직 특이적으로 발현되는 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

본 발명은 감자 유래의 괴경 조직 특이적 라케이즈 프로모터 및 이의 용도를 제공함으로써, 식물체의 괴경 조직 특이적으로 유용물질을 생산하거나, 기존의 괴경 조직 내 생산 물질을 기능적으로 변형시키고자 하는 형질전환 식물체 개발하기 위한 매우 유용한 방법으로 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 감자 유래 라케이즈 유전자의 프로모터의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 2는 β-글루쿠로니다아제 ('GUS'라 약칭함) 리포터 유전자에 라케이즈 유전자의 프로모터가 삽입된 식물발현벡터 pCAM3-LacP를 나타내는 모식도이다.
도 3은 pCAM3-LacP (Lac-P), pCAMBIA3301 (35S-P)에 의해 형질전환된 감자 식물체의 GUS 염색 (A) 및 형질전환 감자 식물체의 괴경에서 GUS 효소의 활성 (B)을 나타낸 것이다.
도 4는 형질전환 감자 식물체에서 조직별 GUS 효소의 활성을 조사한 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 감자 (Solanum tuberosum) 유래의 괴경 조직 특이적 라케이즈 (laccase) 프로모터를 제공한다.

기존에 널리 사용되고 있는 꽃양배추 모자이크 바이러스 유래의 CaMV35S 프로모터가 전 조직에서 도입된 유전자를 발현시키는데 비해, 본 발명의 감자 괴경 조직 특이적 발현 라케이즈 프로모터는 형질전환 식물체에서 도입된 유전자를 감자 괴경 조직에서 특이적으로 발현시킬 수 있다.

또한, 상기 프로모터 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 변이체는 염기 서열은 변화되지만, 서열번호 1의 염기 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기 서열이다. 구체적으로, 상기 프로모터 서열은 서열번호 1의 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.

폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열 (추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제 (즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다. 바람직하게는, 상기 재조합 식물 발현 벡터는 라케이즈 프로모터의 하류 (downstream)에 목적 단백질을 암호화하는 목적 유전자를 작동 가능하게 연결시켜 제조될 수 있다. 본 발명에서, "작동 가능하게 연결된"은 이종 단백질을 발현하기 위한 단위로서 기능하는 발현 카세트의 성분을 말한다. 예를 들면, 단백질을 코딩하는 이종 DNA에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 이종 DNA에 해당하는 기능적 mRNA의 생산을 촉진한다.

본 발명의 감자 괴경 조직 특이적 발현 벡터는 외래 유전자를 도입한 식물체 내에서 일시적으로 발현시킬 수 있는 일시적 (transient) 발현 벡터 및 외래 유전자를 도입된 식물체에서 영구적으로 발현시킬 수 있는 식물 발현 벡터로 사용할 수 있다.

본 발명에 이용될 수 있는 바이너리 벡터는 A. tumefaciens의 Ti 플라스미드와 함께 존재시 식물체를 형질전환시킬 수 있는 T-DNA의 RB (right border)과 LB (left border)을 함유하는 어떤 바이너리 벡터도 될 수 있으나, 바람직하게는 당업계에서 자주 사용되는 pBI101 (Cat#: 6018-1, Clontech, 미국), pBIN19 (Genbank 수탁번호 U09365), pBI121, pCAMBIA 벡터 등을 사용하는 것이 좋다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편 (들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리 (binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 유전자를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스 (예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트 (glyphosate) 또는 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신 (Bleomycin), 하이그로마이신 (hygromycin), 클로람페니콜 (chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제 (NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린 (phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인 (Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환된 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및 (또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법 (Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법 (Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법 (Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법 (Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염 (EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.

"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 열매, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체 (protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타 (in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 식물 발현 벡터에 외래 유전자를 재조합하는 단계; 및 상기 재조합된 식물 발현 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 포함하는 외래 유전자를 형질전환 식물체에서 괴경 조직 특이적으로 발현시키는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 외래 유전자는 인터루킨, 인터페론, 혈소판 유도 성장 인자, 헤모글로빈, 엘라스틴, 콜라겐, 인슐린, 섬유아세포 성장 인자, 인간 성장 인자, 인간 혈청 알부민 및 에리스로포이에틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 코딩할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 외래 유전자는 감자 식물체의 괴경 조직에서 발현을 원하는 어떤 유전자도 될 수 있으며, 본 발명의 감자 괴경 조직 특이적 발현 벡터에서 상기 프로모터의 뒤에 위치하며 필요에 따라 리포터 유전자와 융합되어 발현될 수도 있다. 상기 재조합된 감자 괴경 조직 특이적 발현 벡터를 식물체에 형질전환시키는 방법은 전술한 바와 같이 실시할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 외래 유전자가 감자 괴경 조직 특이적으로 발현되는 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다. 바람직하게는, 상기 식물체는 쌍자엽 식물일 수 있고, 더욱 바람직하게는 감자일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 라케이즈 유전자의 프로모터 확보 및 염기서열 분석

감자 (Solanum tuberosum cv.Desiree) 상처 후 발현되는 EST 염기서열 라이브러리로부터 NCBI genebank 염기서열 blast 검색에 근거하여 라케이즈 유전자의 염기서열과 상동성 있는 감자 라케이즈 cDNA 유전자를 확인하였다 (http://www.ncbi.org). 감자 라케이즈 cDNA 유전자를 기반으로 상기 유전자의 프로모터 및 5'-UTR을 확보하기 위하여 라케이즈 특이적인 Lac-1: GGTTTAGTCTTGGCACAATTGGAAGAAC (서열번호 2) 및 Lac-2: CCATGGCTTTTCCTTTTTACTAAAACTCGATTC (서열번호 3) 프라이머를 제작하였다. 감자의 괴경으로부터 게놈 DNA를 추출한 다음, Universal Genome Walker Kit (Clontech)에서 제공되는 실험 방법에 근거하여 게놈 DNA를 Dra I, EcoRV, Pvu II, Stu I의 제한효소로 처리한 후, 키트에서 제공된 어댑터를 라이게이션시켜 4종류의 라이브러리를 제작하였다. 이를 토대로 하여 AP1 어댑터 프라이머 (ACTATAGGGCACGCGTGGT) (서열번호 4)와 Lac-1 프라이머 (GGTTTAGTCTTGGCACAATTGGAAGAAC) (서열번호 5)를 이용하여 첫 번째 연쇄중합반응 (이하 PCR)을 수행 후, 이 PCR 결과물을 50배 희석하여 AP2 어댑터 프라이머 (ACT ATA GGG CAC GCG TGG T (서열번호 6)와 Lac-2 특이 프라이머를 이용하여 두 번째 PCR을 수행하였다. PCR에 의해 증폭된 약 1100 bp DNA 절편을 pCR-TOPO TA 벡터 (Invitrogen, 미국)에 클로닝한 후 염기서열을 분석하였다 (도 1). 단백질 합성 개시 코돈 'ATG'는 굵은 이탤릭 글씨체로 표시하였다.

실시예 2. 라케이즈 유전자 프로모터를 이용한 식물 발현 벡터 제조

실시예 1에서 확보되어 pCR-TOPO TA 벡터에 삽입된 라케이즈 유전자의 프로모터 및 UTR 부분을 XbaI과 NcoI 제한효소를 처리하여 회수하였다. 이를 GUS 유전자가 삽입된 pCAMBIA 3301에 클로닝하여 pCAM3-LacP 벡터를 제작하여 (도 2) 아그로박테리움을 이용한 식물 형질전환에 이용하였다.

실시예 3. 제조된 식물 발현 벡터 pCAM3 - LacP 를 이용한 감자 식물체의 형질전환

상기와 같이 제조된 식물발현 벡터 pCAM3-LacP와 pCAMBIA 3301를 아그로박테리움 (Agrobacterium tumefaciens GV)에 Freeze-thaw 방법 (An, G. 1987, Methods in Enzymology, 153:292-293)으로 형질전환시켰다. 각각의 형질전환된 아그로박테리움은 2일 동안 28℃에서 진탕 배양한 후, 기내 배양 일주일 된 감자 신초 (cv. Desiree)에서 어린 잎을 취하여 잎 절편 공동배양법에 의하여 형질전환 하였다.

실시예 4. 형질전환된 감자 식물체의 조직 화학적 염색 및 효소학적 분석

아그로박테리움과 공동배양한 후 잎 절편체를 basta 선발 배지에서 저항성을 가지고 재분화되는 개체들을 각각 선발하였다. 선별된 형질전환 식물체로부터 GUS 활성을 조직 화학적 염색 방법 및 효소학적 방법을 이용하여 조사하였다. 각 형질전환 식물체의 전 조직을 염색하기 위하여, 식물체의 각 조직은 1mM X-glu (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-glucuronide), 100 mM 소듐 포스페이트 (pH 7.0), 10 mM EDTA, 0.5 mM 포타슘 페리시아나이드 (potassium ferricyanide), 0.5 mM 포타슘 페로시아나이드 (potassium ferrocyanide), 및 0.1% Triton X-100을 함유하는 용액에서 37℃에서 12 시간 동안 반응시킨 다음, 100% 에탄올을 사용하여 클로로필을 제거했다. 도 3의 A 패널에서 NC는 형질전환되지 않은 정상 감자 식물체, Lac-P는 pCAM3-LacP로 형질전환된 감자 식물체, 35S-P는 GUS 유전자에 CaMV35S가 있는 pCAMBIA 3301 형질전환 감자이다. 그 결과, CaMV35S이 있는 pCAMBIA 3301에서는 전 조직에서 GUS 활성이 나타난 반면, pCAM3-LacP 형질전환 감자에서는 괴경 조직에서 특이적으로 GUS 활성이 확인되었다.

또한, GUS의 활성을 정량적으로 조사하기 위하여, Jefferson 등 (EMBO J. 6: 3901-3907, 1987)의 방법에 의거하여 형질전환 식물체의 각 조직을 50 mM 소듐 포스페이트 (pH 7.0), 10 mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 0.1% 소듐 라우로일 사코신 (sodium lauroylsarcosine), 및 10 mM β-머캅토에탄올을 함유하는 용액에서 마쇄한 다음, 16,000 X g에서 원심분리하여 상등액을 취했다. 획득된 상등액은 1 mM MUG (4-methylumbelliferyl glucuronide)와 섞어 37℃에서 반응시킨 다음, 0.2 M Na₂CO₃를 넣어 반응을 종료시켰다. 반응이 종료된 반응액은 형광 측정기를 이용하여 360 nm 여기 (excitation) 및 460 nm 방출 (emission) 파장에서 값을 측정한 다음, 측정된 값은 MUG 표준용액을 이용하여 만든 표준곡선과 비교함으로써 GUS 활성을 계산하여 도 3의 B 패널에 나타내었다. 그 결과, pCAM3-LacP 유전자의 프로모터는 CaMV35S 프로모터보다 높은 정도로 발현됨을 알 수 있었다.

또한, 형질전환 감자 식물체에서 조직별 GUS 효소의 활성을 조사하였다. 그 결과, 잎, 줄기 및 뿌리에서는 GUS가 거의 발현되지 않는 반면, 괴경에서는 특이적으로 GUS가 강력하게 발현된 것을 알 수 있었다 (도 4). 상기 결과로부터, pCAM3-LacP 유전자의 프로모터는 감자의 괴경 조직 특이적으로 발현된다는 것을 알 수 있다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Tuber tissue-specific laccase promoter from Solanum tuberosum and uses thereof <130> PN11203 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1104 <212> DNA <213> Solanum tuberosum <400> 1 actatagggc acgcgtggtc gggttggttt ggtctcgggt tgtttttttt agttaaaacc 60 aaaccaaccc aaataatcgg attttttttc caataccaaa ccaagtcaaa ccaaccacta 120 gtcaggtttt ttttccgatt tgactcggtt tgcggtttgg tttgattttc ggtttggttt 180 tgtacacccc tagtgacaat tcacatccta catgatgttc tatgtgcaat ataccactca 240 cgacgtgtgt gcctacttgt tcaatttcta tacaagttta agtttctact ggtgtacatc 300 caatgttggg gcataaatag tactggttaa agcaagttaa agaacataat tatgtattat 360 gcacaaaata aaaaaataaa aacaaattaa atgtgcagtg ttgatttaat aaacctaaca 420 ttcaaatttt atttctttaa ttttctaatt ctggtgaagt ttttgttgtg ccataccaac 480 caatgacttc tatgacacaa caattttttt tttgttttta cgttttaacc cacttttggt 540 cattactttt cagagtttta agtagtaaac aatgcaaatt gctgtttaca gccattggtt 600 ctttggactt gaaatatact ttcctccgtc tatttttact tgtccatatt tgactcagta 660 cacactccta agaagtaatt aataaaatga taattttact ataccatcct tcggttataa 720 taaattcaat actatggaaa atgcggaaat gacaagacaa agatagttgt tgtatataat 780 cataacaaca aacttaaagt ttgttgaata acaacacatt gttaatgtga agcaaatacc 840 ataaaagtga tgtttacttg atgattgaaa atataacaaa cttagagaaa atgacttata 900 atatactcaa ggattaatat tcatgaaaat ttatgcaatt agataggtta agttggtgaa 960 caaatcaatt ctacaagagt tcaactaagt tttttgtaca caacttttat ctataaaagc 1020 aaactcaact ctaatatctt tcacaaacaa cttgcatttc tactaatact cgaatcgagt 1080 tttagtaaaa aggaaaagcc atgg 1104 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ggtttagtct tggcacaatt ggaagaac 28 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ccatggcttt tcctttttac taaaactcga ttc 33 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 actatagggc acgcgtggt 19 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 actatagggc acgcgtggt 19

Claims (11)

1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 감자 (Solanum tuberosum) 유래의 괴경 조직 특이적 라케이즈 (laccase) 프로모터.
2. 제1항의 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터.
3. 제2항에 있어서, 상기 프로모터의 하류 (downstream)에 목적 단백질을 암호화하는 목적 유전자를 작동 가능하게 연결시켜 제조된 재조합 식물 발현 벡터.
4. 제2항의 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환된 식물체.
5. 제4항에 따른 식물체의 종자.
6. 제2항의 재조합 식물 발현 벡터에 외래 유전자를 재조합하는 단계; 및
   상기 재조합된 식물 발현 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 포함하는 외래 유전자를 형질전환 식물체에서 괴경 조직 특이적으로 발현시키는 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 외래 유전자는 인터루킨, 인터페론, 혈소판 유도 성장 인자, 헤모글로빈, 엘라스틴, 콜라겐, 인슐린, 섬유아세포 성장 인자, 인간 성장 인자, 인간 혈청 알부민 및 에리스로포이에틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제6항의 방법에 의해 제조된 외래 유전자가 괴경 조직 특이적으로 발현되는 형질전환 식물체.
9. 제8항에 있어서, 상기 식물체는 쌍자엽 식물인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
10. 제9항에 있어서, 상기 식물체는 감자 식물인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
11. 제8항에 따른 식물체의 종자.
    

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