KR101875836B1 - 파라고무나무 유래의 라텍스 분비 조직 특이적 pep16 유전자 프로모터 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 파라고무나무 유래의 라텍스 분비 조직 특이적 PEP16 유전자 프로모터 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 파라고무나무(Hevea brasiliensis) 유래의 PEP16 유전자 프로모터를 이용하면 상시적으로 외래 유전자를 라텍스 분비 조직에서 특이적으로 발현하는 형질전환 식물체를 얻을 수 있으므로, 식물체에서 천연 고무 생합성 과정과 생산성 증감을 조절할 수 있어, 관련 산업에 매우 유용하다. 또한, 본 발명의 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 라텍스 조직 특이적으로 외래 유전자를 발현시켜 천연고무 이외의 유용물질 생산에도 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

파라고무나무 유래의 라텍스 분비 조직 특이적 PEP16 유전자 프로모터 및 이의 용도{Laticiferous tissue-specific PEP16 gene promoter from Hevea brasiliensis and uses thereof}

본 발명은 파라고무나무 유래의 라텍스 분비 조직 특이적 PEP16 유전자 프로모터 (pPEP16) 및 이의 용도에 관한 것이다.

프로모터(promoter)는 구조유전자(gene)의 상류(upstream)에 연결되어 있는 유전체(genome) 부위로서, 이에 연결된 구조유전자가 mRNA로 전사(transcription)되도록 조절하는 역할을 한다. 식물체로 도입되는 외래 유전자 (즉, 트랜스진(transgene))의 발현은 전사적, 후-전사적 (post-transcriptional), 번역적 및 후-번역적(posttranslational) 요소들에 의해 큰 영향을 받는다. 상기 요소들 중 특히, 전사적 요소에 속하는 프로모터는 외래 유전자의 전사에 직접적인 영향을 끼쳐 결과적으로 발현의 수준을 변화시키며, 외래 유전자가 발현되는 단계, 조직 또는 세포 특이성을 변화시킬 수 있는 가장 중요한 요소이다. 현재까지, 외래 유전자의 발현을 위하여 다양한 식물체로부터 수많은 프로모터들이 분리되었지만, 그들 중 소수만이 식물의 형질전환에 실제로 이용되고 있다.

조직 특이적 프로모터는 특정한 세포에서만 유전자가 발현되게 하는 프로모터로 유전자 발현을 특이 조직 또는 세포에 한정시키는 데 이용할 수 있다. 외래 유용 유전자의 식물 조직 특이적인 발현은 식물에 변형된 특성을 나타내도록 할 수 있기 때문에 연구 및 원예 산업 분야에 있어서 중요한 가치를 지닌다.

흔히 고무나무(rubber tree)라고 알려진 파라고무나무(Hevea brasiliensis)는 대극과 (family Euphorbiaceae)에 속하는 나무로서 헤베아 속 중에서 경제적으로 가장 중요한 나무이다. 파라고무나무는 천연고무의 주요 원료인 라텍스(latex)를 다량으로 생산할 수 있으며, 현재 산업적으로 이용 가능한 거의 유일한 천연고무 자원으로 알려져 있다. 천연고무는 말레이시아, 인도네시아, 태국 및 미얀마 등의 동남아시아 지역에서 90% 이상이 생산되고 있으며, 한국은 연간 20만 톤 이상의 천연고무를 사용하고 있는데 전량을 수입에 의존하고 있다.

단백질의 합성은 DNA에 암호화된 유전 정보가 mRNA로 전달되는 전사 (transcription) 과정을 통해 개시된다. 상기 전사는 유전자의 상류(upstream)에 위치한 프로모터에 RNA 폴리머라제 (polymerase)가 결합함으로써 시작된다. 모든 프로모터는 전사 개시점으로부터 일정한 위치에 공통염기서열(consensus sequence)을 갖는데, 이는 RNA 폴리머라제의 프로모터 인식 및 결합에 중요한 것으로 알려져 있다. 이러한 프로모터는 재조합 단백질의 생산 효율을 결정하는데 중요한 인자 중 하나이다.

한편, 한국등록특허 제1281068에는 '파라고무나무 유래의 라텍스 분비 조직 특이적 ＳＲＰＰ 프로모터 및 이의 용도'가 개시되어 있으며, 한국공개특허 제2016-0131964호에는 '천연고무 중합효소 유전자 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 '파라고무나무 유래의 라텍스 분비 조직 특이적 PEP16 유전자 프로모터 (pPEP16) 및 이의 용도'에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 파라고무나무(Hevea brasiliensis)에서 라텍스 조직 특이적으로 발현하는 고무중합효소 후보 유전자(PEP16)의 프로모터 (pPEP16)를 새롭게 분리한 것으로, 이는 상시 고발현하는 특징이 있어, 기존에 알려진 SRPP 유전자 프로모터(pSRPP)가 파라고무나무의 라텍스 분비 조직 특이적 프로모터인 점과 유사하지만, pSRPP는 평상시에는 발현이 미미하나 저온에서 고발현되는 특징이 있고(도 5), 본 발명의 pPEP16은 평상시 고발현되나 저온에서 발현이 미미한 점에서 두 프로모터는 특징이 상반되므로, 필요에 따라 선택적으로 유용하게 적용하고자 전략적으로 개발하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 파라고무나무(Hevea brasiliensis) 유래의 PEP16 유전자 프로모터(pPEP16)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환된 쌍자엽 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 식물 발현 벡터에 외래 유전자를 재조합하는 단계를 포함하는 외래 유전자를 형질전환 쌍자엽 식물체에서 라텍스 분비 조직 특이적으로 발현시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 외래 유전자가 라텍스 분비 조직 특이적으로 발현되는 형질전환 쌍자엽 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

본 발명의 파라고무나무(Hevea brasiliensis) 유래의 PEP16 유전자 프로모터(pPEP16)를 이용하면 상시적으로 외래 유전자를 라텍스 분비 조직에서 특이적으로 발현하는 형질전환 식물체를 얻을 수 있으므로, 식물체에서 천연 고무 생합성 과정과 생산성 증감을 조절할 수 있어, 관련 산업에 매우 유용하다. 또한, 본 발명의 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 라텍스 조직 특이적으로 외래 유전자를 발현시켜 천연고무 이외의 유용물질 생산에도 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 PEP16 유전자 프로모터(pPEP16)의 염기서열과 추정의 시스-액팅 인자를 나타낸다.
도 2는 pPEP16 ::GUS 유전자가 삽입된 pGA3383 벡터로 형질전환된 러시아민들레(Taraxacum koksaghyz) 식물체 라인들에서 게놈 DNA에 안정적으로 삽입되었는지 또한 유전자발현이 제대로 되었는지 확인한 결과를 나타낸다. (A)는 러시아민들레 형질전환체를 제조하는데 사용된 pPEP16 ::GUS 유전자가 삽입된 pGA3383 벡터의 구조를 모식적으로 나타낸 것이다. (B) pPEP16 ::GUS 유전자로 형질전환된 식물체에서 게놈 DNA를 추출하고 GUS와 Hygromycin(Hpt) 유전자들의 PCR 증폭을 나타낸다. (C) pPEP16::GUS 유전자로 형질전환된 러시아민들레(T. koksaghyz) 식물체에서 RNA를 추출하고 RT-PCR 분석한 결과를 나타낸다. 대조구로 형질전환하지 않은 야생 러시아민들레(Wild type; W)를 사용하였다.
도 3은 pPEP16 ::GUS 유전자로 형질전환된 러시아민들레(T. koksaghyz) 식물체에서 PEP16 유전자 프로모터(pPEP16)에 의해 유도된 GUS의 조직 특이적 발현을 나타낸다. (A)는 뿌리조직의 수직단면으로, 야생형(Wild Type) 및 pPEP16 ::GUS 형질전환 러시아민들레(pPEP16::GUS)를 나타내며, (B)는 야생형(Wild Type) 및 pPEP16 ::GUS 유전자로 형질전환된 러시아민들레 식물체(pPEP16 ::GUS)의 뿌리의 수평단면을 나타내며, (C)는 뿌리에서 채취한 라텍스 분비액의 GUS 염색을 나타내는 것으로 야생형(Wild Type) 및 pPEP16 ::GUS 유전자로 형질전환된 러시아민들레 식물체(pPEP16::GUS)를 나타낸다. (A)와 (B)의 스케일 바는 각각 1.0 mm 및 0.5 mm. sx, secondary xylem; sp, secondary phloem.
도 4는 pPEP16 ::GUS 유전자로 형질전환된 러시아민들레 식물체에서 PEP16 유전자 프로모터(pPEP16)에 의해 유도된 GUS의 뿌리조직 특이적 발현을 환경 스트레스 조건 하에서 관찰한 결과이다. (A)는 야생형(Wild Type), (B)는 pPEP16 ::GUS 형질전환 러시아민들레 대조구(Control), (C)는 염분스트레스 처리구(NaCl), (D)는 4℃ 저온 처리구(cold), (E)는 암 조건 처리 후(Dark)와 다시 광을 처리한 후(Light) GUS 발현이 변화되는 것을 나타낸다. 스케일 바 = 1 mm. sx, secondary xylem; sp, secondary phloem; ck, cork; p, pith.
도 5는 pSRPP ::GUS 유전자로 형질전환된 러시아민들레 식물체에서 SRPP 유전자 프로모터(pSRPP)에 의해 유도된 GUS의 뿌리조직 특이적 발현을 스트레스 조건 하에서 관찰한 결과이다. (A) 빛-처리(중간 패널) 및 태핑-처리(오른쪽 패널) 후 뿌리 단면에서 GUS-염색 이미지를 나타낸다. 대조구(왼쪽 패널) 및 태핑-처리(오른쪽 패널)는 암조건에서 실시하였다. 스케일 바 = 1 mm. (B) GUS-염색 이미지는 저온 처리 뿌리(오른쪽 패널) 단면에서 GUS-염색 이미지를 나타낸다. 대조구(왼쪽 패널) 및 저온 처리 식물체는 12h 광주기로 유지했다. 스케일 바 = 1 mm. sp(secondary phloem), sx(secondary xylem), ck(cork), p(pith).

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 파라고무나무(Hevea brasiliensis) 유래의 PEP16 유전자 프로모터(pPEP16)를 제공한다. 바람직하게는, 상기 PEP16 유전자 프로모터(pPEP16)는 특정 유전자를 라텍스 분비 조직에서 특이적으로 발현시킬 수 있다.

기존에 널리 사용되고 있는 꽃양배추 모자이크 바이러스 유래의 CaMV35S 프로모터가 전 조직에서 도입된 유전자를 발현시키는데 비해, 본 발명의 라텍스 분비 조직 특이적 발현 프로모터는 형질전환 식물체에서 도입된 유전자를 라텍스 분비 조직에서 특이적으로 발현시킬 수 있다.

또한, 상기 프로모터 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상동체는 염기 서열은 변화되지만, 서열번호 1의 염기 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기 서열이다. 구체적으로, 상기 프로모터 서열은 서열번호 1의 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.

폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 PEP16 유전자 프로모터(pPEP16)를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다. 바람직하게는, 상기 재조합 식물 발현 벡터는 PEP16 유전자 프로모터(pPEP16)의 하류(downstream)에 목적 단백질을 암호화하는 목적 유전자를 작동 가능하게 연결시켜 제조될 수 있다. 본 발명에서, "작동 가능하게 연결된"은 이종 단백질을 발현하기 위한 단위로서 기능하는 발현 카세트의 성분을 말한다. 예를 들면, 단백질을 코딩하는 이종 DNA에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 이종 DNA에 해당하는 기능적 mRNA의 생산을 촉진한다.

본 발명의 라텍스 분비 조직 특이적 발현 벡터는 외래 유전자를 도입한 식물체 내에서 일시적으로 발현시킬 수 있는 일시적 (transient) 발현 벡터 및 외래 유전자를 도입된 식물체에서 영구적으로 발현시킬 수 있는 식물 발현 벡터로 사용할 수 있다.

본 발명에 이용될 수 있는 바이너리 벡터는 Agrobacterium tumefaciens의 Ti 플라스미드와 함께 존재시 식물체를 형질전환시킬 수 있는 T-DNA의 RB (right border)과 LB (left border)를 함유하는 어떤 바이너리 벡터도 될 수 있으나, 바람직하게는 당업계에서 자주 사용되는 pBI101(Cat#: 6018-1, Clontech, 미국), pBIN19(Genbank 수탁번호 U09365), pBI121, pCAMBIA, pGA 벡터 등을 사용하는 것이 좋다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 유전자를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환된 쌍자엽 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.

"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 열매, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 식물 발현 벡터에 외래 유전자를 재조합하는 단계 및 상기 재조합된 식물 발현 벡터로 쌍자엽 식물체를 형질전환시키는 단계를 포함하는 외래 유전자를 형질전환 쌍자엽 식물체에서 라텍스 분비 조직 특이적으로 발현시키는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 외래 유전자는 고무중합효소, 고무 생합성 관련 효소들, 인터루킨, 인터페론, 혈소판 유도 성장 인자, 헤모글로빈, 엘라스틴, 콜라겐, 인슐린, 섬유아세포 성장 인자, 인간 성장 인자, 인간 혈청 알부민 및 에리스로포이에틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 코딩할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 외래 유전자는 식물체의 라텍스 분비 조직에서 발현을 원하는 어떤 유전자도 될 수 있으며, 본 발명의 라텍스 분비 조직 특이적 발현 벡터에서 상기 프로모터의 뒤에 위치하며 필요에 따라 리포터 유전자와 융합되어 발현될 수도 있다. 상기 재조합된 라텍스 분비 조직 특이적 발현 벡터를 쌍자엽 식물체에 형질전환시키는 방법은 전술한 바와 같이 실시할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 외래 유전자가 라텍스 분비 조직 특이적으로 발현되는 형질전환 쌍자엽 식물체 및 이의 종자를 제공한다. 바람직하게는, 상기 식물체는 라텍스 조직을 가지고 있는 쌍자엽 식물체들 예를 들면, 고무나무(Hevea)가 속해 있는 대극과 (family Euphorbiaceae) 식물들이나 러시아민들레가 속해있는 민들레 속(Taraxacum) 등의 쌍자엽 식물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 파라고무나무 잎에서 PEP16 유전자 프로모터( p PEP16 )의 분리

PEP16 유전자 프로모터의 분리는 iPCR(inverse PCR) 방법을 사용하였다(Ochman et al., 1988, Genetics 120: 621-623). 파라고무나무(Hevea brasiliensis)의 잎 조직으로부터 통상적인 방법에 따라 게놈 DNA를 추출하고, 추출한 게놈 DNA(genomic DNA)에 HincII을 처리하여 조각조각 끊어낸 다음, 상기 조각낸 게놈 DNA에 리가제(ligase)를 처리하여 자가 라이게이션 (self-ligation) 시켰다. 그 후, PEP16의 첫 번째 인트론(intron)에 있는 HincII의 상류 영역인 첫 번째 엑손(exon)에서 양쪽 방향으로 프라이머를 제작한 다음 PCR을 수행하였다. 1차 PCR에는 5'-GATGATATCGAATGCAGAAGC-3'(서열번호 2), 5'-CAAGACATCCTTCGCCATGT-3'(서열번호 3)과 5'-GATACTGCACCTTATCAACAC-3'(서열번호 4), 5'-CAGCATGGATTCGAAGCAAG-3'(서열번호 5) 프라이머의 조합을 통해 1차 PCR 산물을 제작하였다. 이를 희석한 용액을 주형(template)으로 하여, 다시 2차 PCR을 수행하였다(5'-CTGAAAGTAATCAATCTGCAGC-3'(서열번호 6) 및 5'-GGATCACTATGTTCATCATAG-3'(서열번호 7)). 2차 PCR 산물에 대한 염기서열 분석을 통해 염기서열을 확인하였다(도 1).

실시예 2. PEP16 유전자 프로모터( p PEP16 )에 GUS 유전자 결합 형질전환 벡터 제작

실시예 1에서 획득한 염기서열을 바탕으로 PEP16 유전자 프로모터에 대한 프라이머를 디자인하였고(5'-GGATCCGTTATATCGAGGAATATGC-3'(서열번호 8), 5'-TAGTGGTAAGGTGTATAATATTTATC-3'(서열번호 9)), pGA3383 벡터의 BamH1/HpaI에 PEP16 유전자 프로모터를 삽입함으로써 마커 유전자 GUS의 발현을 유도하도록 재조합 벡터(pGA3383-pPEP16::GUS)를 제작하였다(도 2A).

실시예 3. 라텍스 분비 모델 식물체 (러시아민들레)의 형질전환

PEP16 유전자 프로모터(pPEP16)를 분리한 파라고무나무는 형질전환이 어려울 뿐만 아니라 교목이기 때문에 결과를 얻는데 수년의 시간을 필요로 하기에, 형질전환이 비교적 용이하고 생육기간이 짧은 라텍스 분비 모델식물체인 러시아민들레(Russian dandelion)를 형질전환에 사용하였다. pPEP16 ::GUS 벡터를 아그로박테리움 균주 LBA4404에 도입하였으며 러시아민들레의 형질전환은 Bae 등 (2005, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 80:51-57)에 의해 기재된 방법을 이용하여 실시하였다. pPEP16::GUS 형질전환체를 선택배지에서 선별한 다음 토양배지에서 2-3개월 동안 생장시켰다. 게놈 DNA 및 총 RNA를 추출하여 PCR/RT-PCR 분석으로 형질전환 여부를 재차 검정하였다(도 2B 및 2C). 그 결과, 형질전환체에서 GUS 유전자가 게놈에 안정적으로 삽입되어 발현이 됨을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 형질전환 러시아민들레에서 GUS의 조직 특이적 발현

마커 유전자인 GUS의 발현을 GUS 단백질의 활성에 의하여 생성되는 블루 스테이닝으로 검정하였다. 조직학적 GUS(β-glucuronidase) 염색은 이전에 기재된 방법에 따라 수행하였다 (Jefferson et al., 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405). GUS 단백질의 활성이 pPEP16 ::GUS 형질전환체의 라텍스 분비조직이 많은 뿌리의 수직 단면에서 뚜렷하게 보이는데 비해(도 3A 오른쪽 패널), 형질전환하지 않은 야생 러시아민들레(Wild type)에서는 GUS 활성이 검출되지 않았다(도 3A 왼쪽 패널). 동일한 결과를 뿌리 수평단면과 라텍스 분비액에서 각각 얻을 수 있었다(도 3B 및 3C).

실시예 5. 형질전환 러시아민들레에서 환경 스트레스에 따른 GUS의 발현 변화

블루 스테이닝의 정도는 GUS 단백질의 효소활성의 정도를 나타내주며, GUS 단백질의 효소활성 정도는 GUS 유전자 발현의 정도를 나타내 주는 파라미터가 된다. 외부환경 스트레스 또는 신호에 따른 블루 스테이닝의 정도 변화, 즉 GUS 유전자 발현의 변화를 조사하였다. 러시아민들레 야생 뿌리조직(도 4A)에 비하여, pPEP16::GUS 형질전환 러시아민들레의 뿌리조직(도 4B)에서 높은 GUS 유전자 발현이 관찰되었다. 이에 비하여 염분(NaCl), 저온(Cold), 또는 암(Dark) 처리를 하였을 때는 GUS 유전자 발현이 현격히 감소하였다(도 4C-4E). 암 처리 후 다시 빛을 주었을 때 GUS 유전자 발현이 다소 증가하였다(도 4E 오른쪽 패널). 또한, pSRPP::GUS 유전자로 형질전환된 러시아민들레 식물체에서 SRPP 유전자 프로모터(pSRPP)에 의해 유도된 GUS의 뿌리조직 특이적 발현을 스트레스 조건 하에서 관찰한 결과, pSRPP는 평상시에는 발현이 미미하나 저온에서 고발현되는 특징을 확인하였다(도 5)(Tata et al., 2012 Industrial Crops and Products 40; 219-224).

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology DRB Holding Co., Ltd. <120> Laticiferous tissue-specific PEP16 gene promoter from Hevea brasiliensis and uses thereof <130> PN16489 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1079 <212> DNA <213> Hevea brasiliensis <400> 1 gttatatcga ggaatatgcc ttggaaatgt caatttaatt ttttcagtgt aagcatgttg 60 atgttatggc aaaaaatata tttctcattt ttgctgtgcg tagacatgtt gtttcaagac 120 gtgctcaatg tcgtttgtcc catgggctag ctagttttgc attgattact tagttagggc 180 atgtaaaatg aattatatgt agaatatttt gatattactt tgtggatgcc atattatatc 240 aacctttaga gagtaggatc gtcaatatta tagatccaac ggcagcattt tttcaatagt 300 tctggagact gttcattgta aattttttta aagggaacac aagtatttca cttgaaatat 360 ttttggtgtg caagtttttt tttttttttt aataattttt aattttacac gtttttcacg 420 ttaaaaaata catttacaag tacaattagt ttttaactaa aaagcacata tcacaagaaa 480 aataaaaaac tccttgaaga aaggctcgat aacctagttg ttattcatgc attgttcatg 540 ctatagtcta attattttat taatatttat attcctgtta tgaaatatgt tttgatgatt 600 tttttatttt tttttatata tttttttgta ataaattata attgacatga taatatttct 660 atagtattat atttacatcg ttttataaaa tatttgtatc atttgataca aatttacact 720 gtcaataaat tttgtaccac taacgatgaa tttgtattat gtgatattaa ctaaaaagtt 780 atacacaata aaattaacaa atgaattata aaaaattaga ctgaaatgtc aaaaaaatta 840 taatatgata aattttagaa gaatgagaaa gttttgggtg aaaaaagcat aggaaatcag 900 atagaaaacc caagagctaa tcacatagaa ttgtccataa agaaaaaaaa aaaaaactct 960 atatatatct atgcgatgat cctgttaatt ccactgcatg tacacaagca ccgctcaaaa 1020 aaaaaaaaaa aaaaacagac atctgatctt agtgataaat attatacacc ttaccacta 1079 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gatgatatcg aatgcagaag c 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 caagacatcc ttcgccatgt 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gatactgcac cttatcaaca c 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cagcatggat tcgaagcaag 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ctgaaagtaa tcaatctgca gc 22 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ggatcactat gttcatcata g 21 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ggatccgtta tatcgaggaa tatgc 25 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 tagtggtaag gtgtataata tttatc 26

Claims (9)

1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 파라고무나무 (Hevea brasiliensis) 유래의 라텍스 분비 조직 특이적 PEP16 유전자 프로모터.
2. 제1항의 PEP16 유전자 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터.
3. 제2항에 있어서, 상기 프로모터의 하류(downstream)에 목적 단백질을 암호화하는 목적 유전자를 작동 가능하게 연결시켜 제조된 재조합 식물 발현 벡터.
4. 제3항의 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환된 쌍자엽 식물체.
5. 제4항에 따른 쌍자엽 식물체의 형질전환된 종자.
6. 제2항의 재조합 식물 발현 벡터에 외래 유전자를 재조합하는 단계; 및
   상기 재조합된 식물 발현 벡터로 쌍자엽 식물체를 형질전환시키는 단계를 포함하는 외래 유전자를 형질전환 쌍자엽 식물체에서 라텍스 분비 조직 특이적으로 발현시키는 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 외래 유전자는 고무중합효소, 고무 생합성 관련 효소, 인터루킨, 인터페론, 혈소판 유도 성장 인자, 헤모글로빈, 엘라스틴, 콜라겐, 인슐린, 섬유아세포 성장 인자, 인간 성장 인자, 인간 혈청 알부민 및 에리스로포이에틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제6항의 방법에 의해 제조된 외래 유전자가 라텍스 분비 조직 특이적으로 발현되는 형질전환 쌍자엽 식물체.
9. 제8항에 따른 쌍자엽 식물체의 형질전환된 종자.

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