KR20160131964A - 천연고무 중합효소 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 파라고무나무 (Hevea brasiliensis) 유래의 천연고무를 생합성하는 고무중합효소 단백질, 상기 고무중합효소 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것으로, 본 발명의 고무중합효소 유전자는 고무나무의 천연고무 생산량 증대 기술 또는 다른 식물체, 미세조류 또는 미생물 등에서 천연고무를 생산하는 기술 또한 인 비트로(in vitro) 상에서 바이오고무의 생산 기술에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

천연고무 중합효소 유전자 및 이의 용도{Natural rubber polymerase gene and uses thereof}
본 발명은 천연고무 중합효소 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.
천연고무는 말레이시아, 인도네시아, 태국 및 미얀마 등의 동남아시아 지역에서 90% 이상이 생산되고 있으며, 약 2,000종의 식물에서 고무가 생산되지만, 파라고무나무에 우량 품질의 고무가 풍부하고 수확이 쉽기 때문에 파라고무나무가 천연고무의 주요 원천으로 이용되고 있다. 한국은 연간 20만 톤 이상의 천연고무를 소비하고 있는데 전량을 수입에 의존하고 있는 실정이며, 고무의 수요가 증가하고 고무나무 재배 면적이 감소함에 따라 천연고무를 대체하여 고무를 합성하거나, 다른 고무 원천을 개발하는 것에 대한 연구가 요구되고 있다.
고무나무(rubber tree)라고 알려진 파라고무나무 (Hevea brasiliensis)는 대극과 (Euphorbiaceae)에 속하는 나무로서 히비아 (Hevea) 속 중에서 경제적으로 가장 중요한 나무이다. 파라고무나무는 천연고무 (시스-1,4-폴리이소프렌)의 주요 원료인 라텍스를 다량으로 생산할 수 있으며, 현재 산업적으로 이용 가능한 거의 유일한 천연고무 자원으로 알려져 있다.
고무나무에서 고무의 생합성은 고무나무 유액균사 (lactifer)의 세포질인 라텍스 중에 부유되어 있는 고무입자 (rubber particle)의 표면에서 일어난다. 고무 생합성의 첫 번째 단계는 IPP (isopentenyl diphosphate) 이성화효소에 의해 IPP가 DMAPP (dimethylallyl pyrophosphate)로 이성화하는 반응이며, 고무 전이효소 (또는 폴리머라아제)에 의해 촉매되는 5-탄소 중간물질의 연속적인 헤드-투-테일 (head-to-tail) 축합반응에 의해 고무가 생성되는 것으로 알려져 있다.
최근에는 민들레가 천연고무 함량이 높고, 단위면적당 생산량이 많아 미국, 유럽 및 러시아 등에서 천연고무 생산 대체작물로서 주목받고 있다. 미국 천연고무 연구팀은 러시아 민들레 뿌리에서 10~20%의 천연고무 성분을 추출하였다고 발표하였다. 뿐만 아니라 몇 년에 걸쳐 재배해야 하는 목본에 비하여 민들레는 재배 기간이 짧다. 현재 천연고무 생산은 히비아 속 고무나무 한 종에만 의존하고 있기 때문에, 병에 의한 천연고무 생산이 감소 또는 중단될 위험성이 있으므로, 이를 극복하기 위해 천연고무 대체 작물 개발이 시급한 실정이다.
본 발명자는 파라고무나무 (Hevea brasiliensis)에서 천연고무를 생합성하는 고무중합효소 유전자를 분리하였고, 상기 천연고무중합효소를 코딩하는 유전자를 이용하여 천연고무의 생산량을 증대시키거나, 또는 천연고무를 다른 식물체나, 미세조류 또는 미생물에서 대량으로 생산하여 산업적으로 이용하고자 한다. 또한 인 비트로(in vitro) 상에서 고무 생합성에 필요한 전구물질들과 보조인자(cofactor) 및 고무입자를 함유한 용액에 상기 고무중합효소를 넣어 바이오고무를 대량생산하는데 이용하고자 한다.
한편, 한국등록특허 제1281068호에는 '파라고무나무 유래의 라텍스 분비 조직 특이적 SRPP 프로모터 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제0302100호에는 '고무입자-결합 단백질 (SRPP)을 발현하는 재조합 미생물'이 개시되어 있으나, 본 발명의 천연고무 중합효소 유전자 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 파라고무나무에서 천연고무를 생합성하는 고무중합효소 유전자를 분리하였고, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 러시안민들레 식물체에 형질전환하여 고무중합효소가 발현되는 형질전환 식물체가 비형질전환 식물체에 비해 고무함량 증가 등 식물체에서 천연고무 생합성이 증가되었음을 확인하였다.
또한, 본 발명에서 분리한 고무중합효소에 대한 항체를 만들고 이를 이용하여 고무나무 라텍스로부터 고무중합효소를 면역침강하여 확보하고, 이 분리한 고무중합효소 단백질을 천연고무 생합성 전구물질인 크기가 작은 이소프레노이드 화합물 기질들 및 Triton-X 100 detergents로 단백질들을 제거한 고무입자를 섞은 용액에 첨가하여 인 비트로(in vitro)에서 반응시켜 이소프레노이드 모노머(isoprenoid monomers)를 중합하여 크기가 큰 이소프레노이드 폴리머(isoprenoid polymer) 천연고무를 만들 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 파라고무나무 (Hevea brasiliensis) 유래의 천연고무를 생합성하는 고무중합효소 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 고무중합효소 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하여 비형질전환 식물체에 비해 천연고무 함량 또는 고무 폴리머의 분자량이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 천연고무 함량 또는 고무 폴리머의 분자량 증가용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 미생물 세포를 형질전환시켜 고무중합효소 단백질을 코딩하는 유전자를 발현하는 단계를 포함하는 미생물의 천연고무 함량을 증가시키거나 또는 고무 폴리머의 분자량을 증가시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 세포 내에서 또는 인 비트로(in vitro)에서 재조합 고무중합효소를 생산하거나 또는 식물체에서 고무중합효소를 분리한 후, 인 비트로(in vitro)에서 기질과 보조인자 및 고무입자를 넣고 바이오고무를 생합성하는 방법을 제공한다.
본 발명의 식물체 유래 천연고무 생합성 중합효소 유전자는 식물체에서 천연고무의 질적·양적 향상을 가져오는 기능성 유전자로, 천연고무의 생산성 증가에 기여할 수 있다. 또한, 다른 식물체, 미세조류 또는 미생물에서 대량으로 천연고무를 생산하는 기술에 이용될 수 있으며, 유용 자원물질인 천연고무를 생산하는 산업작물을 개발하면, 천연고무의 수입 의존도를 낮출 수 있을 뿐만 아니라 합성고무의 원료인 석유의 사용을 줄여 국가 저탄소 녹색성장에도 이바지할 수 있다.
도 1은 고무나무 라텍스의 고무입자에 붙어 있는 고무중합효소 단백질(HvPep16로 명명)을 HvPep16에 대한 항체를 이용하여 면역침강(Immuno-precipitation)한 후 SDS-PAGE를 수행한 다음 웨스턴 블럿한 결과이다.
도 2는 고무나무 라텍스의 고무입자에서 도 1과 같이 면역침강하여 분리한 고무중합효소를 인 비트로(in vitro) 반응용액에 첨가한 다음, 고무성분의 이소프레노이드 폴리머를 생성하는 고무중합효소 활성을 대조구(고무입자 단백질을 넣지 않고 실시한 IP)와 비교하여 %로 나타낸 결과이다. 첨가량이 증가함에 따라 생성된 고무폴리머 양도 증가하였다. 또한, 열로 불활성화시킨 후 첨가하면 효소 활성이 없어지는 것을 확인하였다.
도 3은 고무나무에서 분리한 고무중합효소 유전자(HvPep16로 명명)를 러시안민들레에 도입하기 위하여 제작한 바이너리 벡터(binary vector)이다.
도 4는 도 3에 기재된 바이너리 벡터를 아그로박테리움(LBA4404)에 넣은 다음 러시안민들레 잎 조직 캘러스에 접종하여 형질전환체 형성을 유도한 결과이다. 접종한 캘러스 조직은 하이그로마이신을 포함한 재생유도 배지에 옮겨 형질전환된 캘러스에서만 새로 신초(Shoots)가 재생되어 올라오게 하였다. 하이그로마이신에 의하여 대부분의 캘러스 조직과 재생 신초가 죽고 극히 일부 형질전환된 것으로 추정되는 신초만 계속 성장하는 모습을 보여준다.
도 5는 하이그로마이신 선발 배지에서 살아남은 신초에서 뿌리가 나오면 흙 포트로 옮겨 6주 동안 키웠다. 소량의 잎 절편에서 DNA를 추출하여 도입한 고무중합효소유전자(HvPepo16)의 프라이머로 PCR하여 형질전환 여부를 검정하였다. 총 16개의 독립적인 HvPep16-형질전환 라인을 얻었다.
도 6은 고무중합효소유전자(HvPepo16)를 도입한 러시안민들레 형질전환체의 뿌리에서 라텍스를 채취하여 라텍스 조직 내 고무중합효소의 효소활성을 측정한 결과이다. 대조구는 GUS 유전자를 도입한 형질전환체를 사용하였다. 라텍스는 5㎕를 각각 채취하였으며 C14-IPP (isoprenoid monomer)가 포함되어 있는 반응 버퍼에 첨가한 후 3일 동안 반응시켰다. 고무중합효소의 활성은 C14-라벨링된 이소프레노이드 모노모가 이소프레노이드 폴리머(생합성 고무)로 전환된 양을 방사선 활성(dpm, disintegrations per minute)을 측정하여 조사하였다.
도 7은 고무중합효소유전자(HvPepo16)를 도입한 러시안민들레 형질전환체 뿌리의 고무함량을 측정한 결과이다. 대조구는 GUS 유전자를 도입한 형질전환체를 사용하였다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 파라고무나무 (Hevea brasiliensis) 유래의 천연고무를 생합성하는 고무중합효소 단백질을 제공한다.
본 발명에 따른 고무중합효소 단백질의 범위는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 천연고무를 생합성하는 활성을 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 고무중합효소 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 상기 고무중합효소 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 천연고무를 생합성하는 고무중합효소 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(E. coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.
한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 식물 발현 벡터이다.
식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리 (binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 유전자를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스 (예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
본 발명에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 SRPP(small rubber particle-associated protein), CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제 (NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린 (phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인 (Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또한, 본 발명의 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 미세조류, 미생물 등을 포함한 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모 (Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 식물세포이다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 비형질전환 식물체에 비해 천연고무 함량 또는 고무 폴리머의 분자량이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에서, 상기 고무 폴리머의 분자량은 중량평균분자량(weight-average molecular weight)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및 (또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법, 원형질체의 전기천공법, 식물 요소로의 현미주사법, 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법, 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.
본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.
"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 열매, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체 (protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타 (in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 식물체는 이에 한정하지 않으나, 고무를 생산하는 고무식물이면 상관없으며, 파라고무나무, 인도고무나무, 세알라 고무나무, 아라비아고무나무, 엉겅퀴, 상추, 러시안민들레 또는 구아율 등일 수 있고, 바람직하게는 파라고무나무, 러시안민들레 또는 구아율 등의 식물체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 미생물 세포를 형질전환시켜 고무중합효소 단백질을 코딩하는 유전자를 발현하는 단계를 포함하는 미생물의 천연고무 함량을 증가시키거나 또는 고무 폴리머의 분자량을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 상기와 같은 재조합 벡터를 이용한 형질전환 방법 이외에, non-GMO 기술을 이용하여 식물체의 천연고무 함량을 증가시킬 수도 있다. Non-GMO 기술로는 징크핑거 뉴클레아제(zinc finger nuclease) 또는 TALEN(transcription activator-like effector nuclease) 등의 유전자가위를 이용한 방법, 올리고뉴클레오티드 지정 돌연변이유발(oligonucleotide-directed mutagenesis), 동종기원(cisgenesis) 및 인트라제네시스(intragenesis), RNA directied DNA 메틸화 등의 돌연변이 유발 방법, 접붙이기, 역교배 또는 아그로인필트레이션 방법 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 천연고무 함량 또는 고무 폴리머의 분자량 증가용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 유효성분으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 파라고무나무 (Hevea brasiliensis) 유래의 천연고무를 생합성하는 고무중합효소 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하며, 상기 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시킴으로써 식물체의 천연고무 함량 또는 고무폴리머의 분자량을 증가시킬 수 있는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 고무중합효소 단백질을 코딩하는 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 천연고무 함량을 증가시키거나 또는 고무 폴리머의 분자량을 증가시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 세포 내에서 또는 인 비트로(in vitro)에서 재조합 고무중합효소를 생산하거나 또는 식물 조직에서 고무중합효소를 분리 생산하는 단계; 및
상기 생산된 고무중합효소 단백질에 기질, 보조인자(cofactors) 및 고무입자를 첨가하여 반응하는 단계를 포함하는 인 비트로(in vitro)에서 바이오고무를 생합성하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 인 비트로에서 바이오고무를 생합성하는 방법으로서, 1단계는 미생물에 본 발명의 유전자를 형질전환하여 형질전환된 미생물에서 재조합 고무중합효소 단백질을 생산하는 단계이다. 미생물에 본 발명의 유전자를 형질전환하는 방법은 전술한 바와 같다. 사용가능한 미생물로는 대장균, 효모, 슈도모나스(Pseudomonas) 등을 예로 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 고무중합효소 재조합 단백질은 인 비트로 단백질 합성방법으로 생산 확보할 수 있다. 또한 식물 조직에 있는 고무중합효소를 추출하고, 분리 정제하여 단백질을 확보할 수 있다.
2단계는 상기 생산된 재조합 고무중합효소 단백질에 기질, 보조인자(cofactors) 및 고무입자를 첨가하여 반응하는 단계이다. 사용가능한 기질로는 이소펜테닐 피로포스페이트(Isopentenyl pyrophosphate), 파네실 피로포스페이트(Farnesyl pyrophosphate), 제라닐제라닐 피로포스페이트(geranylgeranyl pyrophosphate) 등이 있으며, 보조인자(Cofactor)로서 마그네슘(Magnesium) 및/또는 망간(Manganese) 이온이 있다. 고무입자는 식물체에서 분리하거나 또는 인조로 만들 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 파라고무나무 유래 고무중합효소 단백질 및 유전자 서열 분석
파라고무나무 (Hevea brasiliensis) 표피의 유액균사 (laticifer) 조직에 상처를 준 다음 흘러나오는 라텍스 유액을 받아 얼음에 보관하였다. 라텍스를 인산 완충액 (phosphate buffer)과 섞은 다음 초고속 원심분리하여 상층과 구분되는 고무입자 층을 분리하였다. 분리한 고무입자 층을 인산 완충액을 이용하여 3번 세척하여 준 다음 고무입자에 붙어 있는 고무입자 단백질을 0.02% Triton-X로 분리하였다. 분리한 고무입자 단백질을 일련의 크로마토그래프 또는 전기영동 과정으로 분리추출하고 추출한 단백질의 고무 생합성 활성을 측정한 후 활성이 있는 단백질을 분리하여 3 개의 펩타이드 단편 서열을 얻었다(내부 펩티드 1: LTEGFYSLR(서열번호 3), 내부 펩티드 2: RDFESGLDAAFAACR(서열번호 4), 내부 펩티드 3: YALLDYSEPR(서열번호 5).
이러한 3 개의 단편 펩타이드 서열정보를 이용하여 해당 단백질의 전체 서열정보를 얻기 위하여 라텍스 용액에서 총 RNA을 추출하고 대용량 RNA 시퀀싱을 수행하였다. RNA 시퀀싱 데이터베이스 중 분리한 단편 펩타이드 서열과 일치하는 DNA 콘티그(contig)를 Assembled database를 블라스팅하여 얻은 다음, 로우 데이터베이스(raw database)를 차례로 블라스팅하여 서열을 이어가 해당 유전자의 전체 서열(서열번호 1)을 얻었으며 유전자 이름을 HvPep16으로 명명하였다. 확보한 유전자 서열을 아미노산 서열로 번역하여 고무중합효소 단백질의 전체서열(서열번호 2)을 얻었다.
실시예 2. 고무나무 유래 고무중합효소를 분리 추출한 후 인 비트로(In vitro) 상에서 고무 생산
파라고무나무 라텍스에 존재하는 고무중합효소 단백질은 본 발명에서 분리한 고무중합효소에 대한 항체를 이용하여 면역침강하여 분리하였다(도 1). 상기 항체는 HvPep16 단백질의 아미노산 서열 중에서 항체 유도 가능성이 높은 내부 펩타이드 서열 3개를 골라 제조하고 비드에 붙인 다음 토끼에 주입하고 3차에 걸쳐 부스팅(boosting)한 후 혈액을 채취하여 확보하였다. 천연고무 생합성 전구물질인 크기가 작은 이소프레노이드 화합물 기질들과 Triton-X 100 detergents로 단백질들을 제거한 고무입자를 섞은 용액에 첨가하여 인 비트로(in vitro)에서 3일간 반응시켜 이소프레노이드 모노머(isoprenoid monomers)를 중합하여 크기가 큰 바이오고무 이소프레노이드 폴리머(isoprenoid polymer)를 만들 수 있음을 확인하였다. 전구물질 기질 화합물은 탄소 15개인 FPP (farnesyl pyrophosphate)를 사용하였으며, 이소프레노이드 모노머는 탄소 5개의 14C-radiolabeled IPP(isopentenyl pyrophosphate)를 사용하였다. 3일 동안 37℃에서 인 비트로 반응 후 생성된 이소프레노이드 폴리머를 고무성분(탄소 수가 2,000개 이상)과 작은 크기의 비고무성분으로 구분하였다. 구분은 Asawatreratanakul 등 (2003, Eur. J. Biochem. 270:4671-4680)에 의해 기재된 방법을 이용하여 실시하였다.
그 결과, 본 발명을 통해 분리한 고무나무 유래 고무중합효소를 첨가한 것이 대조구(고무입자 단백질을 넣지 않고 실시한 IP)에 비하여 3배 이상의 고무성분(탄소 수가 2,000개 이상) 이소프레노이드 폴리머를 합성하는 것을 확인함으로써(도 2), 본 발명에서 분리한 고무나무 유래의 고무중합효소의 활성을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 파라고무나무 유래 고무중합효소 유전자를 러시안민들레에 도입하여 형질전환체 제조 및 형질전환체 특성 분석
파라고무나무에서 분리한 고무중합효소 유전자 및 단백질의 기능을 검정하기 위하여 형질전환이 다소 용이한 러시안민들레에 파라고무나무 유래 고무중합효소 유전자(HvPep16)를 도입하였다. 제조한 형질전환 벡터의 구성은 도 3에 나타내었다. 유전자 발현 프로모터는 본 연구팀이 최근 분리한 라텍스 조직 특이적 발현 프로모터인 pSRPP를 사용하였다(미국특허등록 제8907074호). 러시안민들레의 형질전환은 Bae 등 (2005, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 80:51-57)에 의해 기재된 방법을 이용하여 실시하였다. 하이그로마이신 선발(Hygromycin-selection) 배지에서 살아남는 형질전환된 러시안민들레(도 4)는 흙 포트로 옮겨 6주 동안 키운 다음 잎에서 게놈 DNA를 추출하고 외래 유전자가 제대로 도입되었는지를 벡터 프라이머로 PCR하여 검정하였다(도 5). 최종 검정된 고무나무 고무중합효소 유전자가 도입된 러시안민들레 형질전환체는 LED 생장실에서 4주 동안 더 키웠다. 프로모터 pSRPP를 활성화시켜 도입유전자의 발현을 높이기 위하여 3일 밤동안(8시간) 저온(5℃) 처리한 후, 2일동안 정상 생육온도(22℃ Day/Night)에서 자라게 한 다음, 뿌리조직의 고무생합성 활성과 고무함량을 측정하였다. 대조구는 GUS 유전자를 도입한 러시안민들레를 사용하였다. 고무중합효소 유전자(HvPepo16)를 도입한 러시안민들레 형질전환체의 뿌리에서 고무생합성 활성이 대조구에 비하여 5배 증가하였다(도 6). 이러한 결과(도 6)는 도입한 파라고무나무 유래 고무중합효소가 러시안민들레의 라텍스 조직에서 발현하여 고무생합성 활성을 나타내는 것을 보여준 결과이며, 이때 수행한 방법은 도 6에 대한 도면의 간단한 설명에 기술하였으며, 실시예 2와 달리 detergent-세척한 고무입자를 반응용액에 넣지 않았다. 또한 고무중합효소 유전자를 도입한 러시안민들레 형질전환체 뿌리의 고무함량을 대조구와 비교하였을 때 1.7배 증가하였다(도 7).
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology DRB Holding Co., Ltd. <120> Natural rubber polymerase gene and uses thereof <130> PN16088 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1581 <212> DNA <213> Hevea brasiliensis <400> 1 atgtcatcga ttcccccaaa ttcaccctgg agaggatgcg cagcattctt tccacaacct 60 gtatctgaaa gtaatcaatc tgcagctcaa tttcttactg aaactgtcta ctactttaat 120 tgccgtgtaa taaatcctcc tttagatgat atcgaatgca gaagcagtga tggcgaacaa 180 gacatccttc gccatgtctt ccgttgggat actgcacctt atcaacacgt ttttcagcat 240 ggattcgaag caaggcgtca aggaggtact cccgatgaaa tttacttcaa tttggatcac 300 tatgttcatc atagtggcag acctcttgat tccactaggc ctgccacgca tgtcttcatt 360 agcaccaccc ttagcagtgc ttggtatcca actctccctg atgggacaca agaagtgtat 420 cgttatgaga tatatgcacc agggggtatt tgggttgctg agacacttgg agatcgttac 480 agatatcctg cccaagatga ggttgccttt gttgctggca tagcccctca atacattcgc 540 tctgctcaat tgttcagact tacccatagt ggaaggtata caagacggga gagggtggat 600 aacagactaa ttgtcaaccg taattacaat cctcaatcac atccctcaag 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1500 cctcgcaaaa atcgtggcct tgacattcat gaacactctc ataatactcc tgaacccgat 1560 agagacaggg atgatctttg a 1581 <210> 2 <211> 526 <212> PRT <213> Hevea brasiliensis <400> 2 Met Ser Ser Ile Pro Pro Asn Ser Pro Trp Arg Gly Cys Ala Ala Phe 1 5 10 15 Phe Pro Gln Pro Val Ser Glu Ser Asn Gln Ser Ala Ala Gln Phe Leu 20 25 30 Thr Glu Thr Val Tyr Tyr Phe Asn Cys Arg Val Ile Asn Pro Pro Leu 35 40 45 Asp Asp Ile Glu Cys Arg Ser Ser Asp Gly Glu Gln Asp Ile Leu Arg 50 55 60 His Val Phe Arg Trp Asp Thr Ala Pro Tyr Gln His Val Phe Gln His 65 70 75 80 Gly Phe Glu Ala Arg Arg Gln Gly Gly Thr Pro Asp Glu Ile Tyr Phe 85 90 95 Asn Leu Asp His Tyr Val His His Ser Gly Arg Pro Leu Asp Ser Thr 100 105 110 Arg Pro Ala Thr His Val Phe Ile Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ala Trp 115 120 125 Tyr Pro Thr Leu Pro Asp Gly Thr Gln Glu Val Tyr Arg Tyr Glu Ile 130 135 140 Tyr Ala Pro Gly Gly Ile Trp Val Ala Glu Thr Leu Gly Asp Arg Tyr 145 150 155 160 Arg Tyr Pro Ala Gln Asp Glu Val Ala Phe Val Ala Gly Ile Ala Pro 165 170 175 Gln Tyr Ile Arg Ser Ala Gln Leu Phe Arg Leu Thr His Ser Gly Arg 180 185 190 Tyr Thr Arg Arg Glu Arg Val Asp Asn Arg Leu Ile Val Asn Arg Asn 195 200 205 Tyr Asn Pro Gln Ser His Pro Ser Arg Val Leu Pro Ile Gln Arg Pro 210 215 220 Val Phe Asp Tyr Ile Leu Asn Gly Arg Arg Glu Leu Leu Asn Leu Val 225 230 235 240 Ile Tyr Asn Pro Asn Ser Ala Ala Gly Ala Asn Asp Asn Ala Ser Arg 245 250 255 Glu Lys Arg Glu Val Ser Tyr Asp Val Ile Asp Trp Tyr Thr Asp Lys 260 265 270 Val Ala Asp Val Gly Thr Tyr Ile Asn Ala Ala Phe Gln Ser Ala Arg 275 280 285 Asn Arg Asp Glu Val Tyr Leu Phe Met Lys Asn Glu Tyr Val Leu Val 290 295 300 Asn Tyr Ala Pro Gly Thr Thr Asn Asp Arg Val Ile Asn Gly Pro Leu 305 310 315 320 Leu Ile Cys Asp Gly Phe Pro Ser Leu Thr Asp Thr Ala Phe Ala Glu 325 330 335 Phe Gly Val Asp Cys Ala Phe Arg Ser His His Gly Asn Glu Ala Phe 340 345 350 Ile Phe Ser Gly Asn Leu Cys Ala Arg Ile Asp Tyr Ala Pro Gly Thr 355 360 365 Leu Asn Asp Lys Ile Leu Arg Gly Pro Met Pro Ile Gly Thr Met Phe 370 375 380 Pro Phe Phe Lys Arg Thr Val Phe Glu Thr Ser Ile Asp Ala Ala Phe 385 390 395 400 Glu Ala Thr Ala Thr Asn Glu Ala Tyr Leu Phe Lys Asp Asp Gln Tyr 405 410 415 Ala Leu Ile Asp Tyr Ser Glu Pro Arg Arg Ile Ala Ile Arg Lys Ile 420 425 430 Thr Glu Gly Phe Tyr Ser Leu Arg Gly Thr Ile Phe Glu Ser Gly Ile 435 440 445 Asp Ala Ala Phe Ala Ser Ser Arg Lys Asn Glu Ala Tyr Leu Phe Lys 450 455 460 Gly Asp Gln Tyr Ala Leu Ile Asn Phe Ala Pro Gly Thr Thr Asn Asp 465 470 475 480 Tyr Ile Ile Gly Gly Val Lys Pro Ile Leu Pro Ser Trp Pro Ser Leu 485 490 495 Arg Asn Ile Leu Pro Arg Lys Asn Arg Gly Leu Asp Ile His Glu His 500 505 510 Ser His Asn Thr Pro Glu Pro Asp Arg Asp Arg Asp Asp Leu 515 520 525 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Hevea brasiliensis <400> 3 Leu Thr Glu Gly Phe Tyr Ser Leu Arg 1 5 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Hevea brasiliensis <400> 4 Arg Asp Phe Glu Ser Gly Leu Asp Ala Ala Phe Ala Ala Cys Arg 1 5 10 15 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Hevea brasiliensis <400> 5 Tyr Ala Leu Leu Asp Tyr Ser Glu Pro Arg 1 5 10

Claims (12)

  1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 파라고무나무 (Hevea brasiliensis) 유래의 천연고무를 생합성하는 고무중합효소 단백질.
  2. 제1항의 고무중합효소 단백질을 코딩하는 유전자.
  3. 제2항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 고무중합효소 단백질을 코딩하는 유전자.
  4. 제2항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  5. 제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  6. 제5항에 있어서, 상기 숙주세포는 식물 또는 미생물인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
  7. 제4항의 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및
    상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 비형질전환 식물체에 비해 천연고무 함량 또는 고무 폴리머의 분자량이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법.
  8. 제7항의 방법에 의해 제조된 비형질전환 식물체에 비해 천연고무 함량 또는 고무 폴리머의 분자량이 증가된 형질전환 식물체.
  9. 제8항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
  10. 제2항의 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 천연고무 함량 또는 고무 폴리머의 분자량 증가용 조성물.
  11. 제4항의 재조합 벡터로 미생물 세포를 형질전환시켜 고무중합효소 단백질을 코딩하는 유전자를 발현하는 단계를 포함하는 미생물의 천연고무 함량을 증가시키거나 또는 고무 폴리머의 분자량을 증가시키는 방법.
  12. 제4항의 재조합 벡터로 세포 내에서 또는 인 비트로(in vitro)에서 재조합 고무중합효소를 생산하거나 또는 식물 조직에서 고무중합효소를 분리 생산하는 단계; 및
    상기 생산된 고무중합효소 단백질에 기질, 보조인자(cofactors) 및 고무입자를 첨가하여 반응하는 단계를 포함하는 인 비트로(in vitro)에서 바이오고무를 생합성하는 방법.
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