KR102116432B1

KR102116432B1 - 식물의 염 스트레스 내성을 조절하는 벼 유래의 OsSIRP3 유전자 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102116432B1
Application number: KR1020180142298A
Authority: KR
Inventors: 장철성; 박용찬
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2018-11-19
Filing date: 2018-11-19
Publication date: 2020-05-28
Also published as: KR20200057956A

Abstract

본 발명은 식물의 염 스트레스 내성을 조절하는 벼 유래의 OsSIRP3 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 OsSIRP3 유전자의 발현을 조절하여 식물체의 염 스트레스에 대한 내성을 조절할 수 있으므로, 환경 스트레스에 내성을 갖는 새로운 형질전환 식물체를 개발하는데 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

식물의 염 스트레스 내성을 조절하는 벼 유래의 OsSIRP3 유전자 및 이의 용도{OsSIRP3 gene from Oryza sativa for controlling salt stress tolerance of plant and uses thereof}

본 발명은 식물의 염 스트레스 내성을 조절하는 벼 유래의 OsSIRP3 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.

식물은 병원균 감염 및 초식 동물, 곤충의 공격과 같은 생물 스트레스와 가뭄, 더위, 추위, 영양결핍과 같은 환경 스트레스 속에서 끊임없이 신호를 주고받으며 살아간다. 환경 스트레스에 저항성이 낮은 식물은 분리한 환경에 적응할 때 많은 에너지를 필요로 하고 많은 물과 비료를 소비하여 환경에 큰 부담을 줄 수 있다. 환경 스트레스 중 고염, 가뭄, 온도의 변화는 고착생활을 하는 식물의 생육과 발달에 큰 영향을 미친다. 토양에서 염의 농도가 증가할 경우 식물의 성장, 개화시기 등에 영향을 줄 수 있고, 세포 내 이온 농도와 삼투압의 불균형이 일어나 영양 장해, 대사 장해 또는 광합성 장해 등을 유발시켜 식물의 생산량을 감소시킬 수 있다. 이처럼 고착 생활을 하는 식물은 여러 환경 스트레스에 직면하여 살아가고 있다. 스트레스를 받는 환경에서 식물들은 이온 및 식물의 저항성과 세포의 안정성을 위해 단백질 대사 및 유전자 발현을 조절한다.

한편, RING(Really Interesting New Gene) E3 리가아제는 시스테인과 히스티딘 잔기로 이루어진 공통서열(Cys-X2-Cys-X9-Cys-X1-3-His-X2-3-Cys/His-X2-Cys-X4-48-Cys-X2-Cys, X는 모든 아미노산이 위치할 수 있음)을 가지고 있으며, 이들 구조는 2개의 아연 원자와 결합하고 있다. 이러한 구조는 일반적으로 링-핑거 단백질(RING-finger protein)들이 시스테인 또는 히스티딘 위치에 근거하여 RING-H2 및 RING-HC를 포함하는 2개의 기본 형태로 분류된다고 알려져 있다. 또한, RING-D, RING-v, RING-S/T, RING-G 및 RING-C2와 같은 몇 가지 변형된 형태가 애기장대 또는 벼의 게놈을 포함하는 고등식물에서 발견되었다.

최근 많은 연구자들이 환경 스트레스에 대한 유전자들의 기능에 관심을 가지고 활발히 연구하고 있으며, 육종가들은 교배를 통해 품종 개량하여 내염성 작물을 개발하고자 시도를 하고 있다. 기존의 품종개량 기술은 각각 원하는 특성을 지닌 유사한 종들을 교배하여 생성된 잡종 중 목적하는 품종만을 선별하는 것으로, 한 품종을 개발하기 위해서는 많은 시행착오와 시간이 소요된다. 이에 비해 유전자 재조합 기술은 원하는 특성을 가진 유전자를 다른 생물체에 직접 삽입함으로써 목적하는 품종을 얻을 수 있다. 또한 삽입하고자 하는 유전자는 같은 생물종뿐만 아니라 서로 다른 생물종에서도 얻을 수 있으므로, 품종개량의 폭이 넓고 종래의 품종개량에 비해 소요시간이 짧은 장점이 있다.

한편, 한국공개특허 제1915296호에는 '식물의 염 스트레스 내성을 조절하는 벼 유래의 OsPHYB 유전자 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1270231호에는 '식물의 염 스트레스에 대한 저항성을 증가시키는 AtSZF2 유전자 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 식물의 염 스트레스 내성을 조절하는 벼 유래의 OsSIRP3 유전자 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 벼 식물체에 염 처리시 뿌리에서 OsSIRP3(Oryza sativa salt-induced RING finger protein 3) 유전자의 발현이 무처리 대조구에 비해 현저히 증가하는 것을 확인하였고, OsSIRP3 유전자를 과발현하는 벼 형질전환체를 제조하여 분석한 결과, 과발현 형질전환체에서 대조구 식물체에 비해 종자 발아 및 뿌리 생장이 감소하는 것을 통해 OsSIRP3 유전자의 과발현에 의해 염 스트레스에 대한 민감성을 증가시킬 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsSIRP3(Oryza sativa salt-induced RING finger protein 3) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환시켜 OsSIRP3 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 염 스트레스 내성을 조절하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsSIRP3 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 염 스트레스 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 염 스트레스 내성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsSIRP3 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 식물체의 염 스트레스 내성 조절용 조성물을 제공한다.

본 발명의 OsSIRP3 유전자는 식물의 염 스트레스 내성을 조절할 수 있으므로, 환경 스트레스에 대해 내성을 갖는 식물체를 개발하여 농작물의 생산성을 향상시킬 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 벼에 염(NaCl)을 처리하고 벼의 뿌리(root) 및 줄기(shoot)에서 OsSIRP3 유전자의 발현이 증가하는 것을 확인한 결과이다.
도 2A는 OsSIRP3 단백질과 다른 벼과 식물인 조(Setaria italica) 유래 Si006712m, 큰개기장(Panicum virgatum) 유래 Pavirv00036239m, 수수(Sorghum bicolor) 유래 Sb10g012170, 옥수수(Zea mays) 유래 GRMZM2hG395842 및 야생 잔디(Brachypodium distachyon) 유래 Bradi1g42720 단백질의 링 핑거 도메인(RING finger domain)을 다중 정렬 분석한 결과이고, 도 2B 및 도 2C는 OsSIRP3 단백질의 E3 리가아제 활성을 확인한 in vitro 유비퀴틴화 분석(ubiquitination assay) 결과이다. *; RING-HC 도메인을 형성하는 시스테인(C) 또는 히스티딘(H)의 보존된 금속-리간드 잔기, MBP; 말토오즈 결합 단백질(maltose binding protein), MBP-OsSIRP3; MBP와 OsSIRP3의 융합 단백질, Poly-Ub; 폴리 유비퀴틴 사슬(poly-ubiquitin chain), OsSIRP3^C245A; OsSIRP3 단백질의 링 핑거 도메인에서 245번째 잔기의 시스테인(Cysteine, C)이 알라닌(Alanine, A)으로 치환된 단백질.
도 3A는 OsSIRP3 유전자가 과발현된 벼 형질전환체(35S: OsSIRP3 - EYFP; #1. #3, #4)에서 OsSIRP3 유전자의 발현량을 확인한 q-PCR(quantitative real time polymerase chain reaction) 결과이고, 도 3B 및 C는 염(NaCl)을 처리한 OsSIRP3 유전자 과발현체 및 대조구 식물체(35S: EYFP)에서 종자 발아율(Germination; B) 및 뿌리 생장률(Root length; C)을 확인한 결과이다. AtUBC(하우스키핑 유전자); 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 UBC(Ubiquitin C).

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsSIRP3(Oryza sativa salt-induced RING finger protein 3) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환시켜 OsSIRP3 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 염 스트레스 내성을 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 식물체의 염 스트레스 내성을 조절하는 방법은, 상기 OsSIRP3 단백질을 식물세포에서 과발현시켜 식물체의 염 스트레스에 대한 민감성을 증가시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 OsSIRP3 단백질의 범위는 벼로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. 본 발명에 있어서, 용어 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체의 염 스트레스 내성을 조절하는 활성을 의미한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 OsSIRP3 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하며, 상기 유전자의 범위는 OsSIRP3 단백질을 코딩하는 게놈 DNA, cDNA 및 합성 DNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 OsSIRP3 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)을 포함할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 명세서에서, 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 발현 또는 클로닝을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예를 들면, pLλ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보솜 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(Escherichia coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(pLλ 프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 상기 프로모터는 형질전환에 적합한 프로모터들로서, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터 또는 히스톤 프로모터일 수 있으며, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서, 용어 "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시성(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 항시성 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 항시성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

재조합 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 상기 마커 유전자는 항생제 내성 유전자(antibiotics resistance gene)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 원핵세포의 예로는, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 츄린겐시스(Bacillus thuringiensis)와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세슨스(Serratia marcescens) 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포(예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법, 하나한 방법(Hanahan, D., 1983 J. Mol. Biol. 166, 557-580) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsSIRP3 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 염 스트레스 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 염 스트레스 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법에 있어서, 상기 OsSIRP3 단백질의 범위는 전술한 것과 같다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 튜머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

또한, 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 염 스트레스 내성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.

상기 식물체는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물 또는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 당근, 미나리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽일 수 있고, 바람직하게는 단자엽 식물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 벼일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsSIRP3 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 식물체의 염 스트레스 내성 조절용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 유효성분으로 식물체의 염 스트레스에 대한 내성을 조절할 수 있는 벼 유래 OsSIRP3 단백질 코딩 유전자를 포함하며, 상기 유전자의 발현이 증가되면, 식물체의 염 스트레스에 대한 민감성을 증가시킬 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명은 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 염 처리에 따른 벼 식물체에서 OsSIRP3 유전자의 발현 양상 분석

벼에 염화나트륨(NaCl) 200 mM이 함유된 배양액을 시간별(6, 12 또는 12 시간)로 처리한 후 OsSIRP3 유전자의 발현량을 확인하였다. 그 결과, 무처리 대조군에 비해 염을 처리한 실험군의 벼 뿌리 및 줄기에서 OsSIRP3 유전자의 발현이 증가하였고, 특히 벼의 뿌리에서 OsSIRP3 유전자의 발현이 현저하게 증가한 것을 확인하였다(도 1).

실시예 2. OsSIRP3 단백질의 구조 및 E3 리가아제 활성 분석

2-1. OsSIRP3 단백질의 구조 분석

OsSIRP3 단백질의 구조를 분석하기 위해 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 보존 도메인 데이터베이스(Conserved Domain Database, CDD; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)를 이용하여 서열 유사성 분석을 수행하였다. 그 결과, OsSIRP3 단백질이 HC 타입의 링 핑거 도메인(RING finger domain; RING-HC)을 갖고 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명의 OsSIRP3 아미노산 서열과, RING-HC를 갖고 있는 다른 벼과 식물의 아미노산 서열을 이용하여 다중 정렬 분석(Clustalw2 software, http://ebi.ac.uk/clustalw/)을 수행한 결과, OsSIRP3 단백질이 조(Setaria italica) 유래 Si006712m, 큰개기장(Panicum virgatum) 유래 Pavirv00036239m, 수수(Sorghum bicolor) 유래 Sb10g012170, 옥수수(Zea mays) 유래 GRMZM2hG395842 및 야생 잔디(Brachypodium distachyon) 유래 Bradi1g42720 단백질과 유사한 시퀀스임을 확인할 수 있었다(도 2A).

2-2. OsSIRP3 단백질의 E3 리가아제 활성 분석

유비퀴틴(ubiquitin, Ub)과 기질의 결합은 기질분자의 라이신(lysine)과 Ub-C 말단 글리신(glycine) 사이의 이소펩타이드 결합(isopeptide bond)을 통해 일어나며, 다중-효소 연쇄증폭(multi-enzyme cascade; E1, E2, E3)에 의해 Ub와 효소의 티올 에스테르(thiol ester) 형성으로 이루어진다. 즉, Ub-활성 효소(activating enzyme; E1)는 Ub-C 말단 글리신과 E1의 시스테인을 연결하는 고에너지의 티올 에스테르 결합을 통해 ATP-의존적인 반응으로 Ub을 활성화시킨다. Ub-결합효소(conjugating enzyme; E2)는 UBC(Ub-conjugating) 도메인 내의 시스테인에 E1으로부터 활성화된 Ub를 받아서 다시 고에너지 티올 에스테르를 형성하고, 이를 E3 리가아제(ligase)에 전달하거나 또는 기질 단백질(Lys의 ε-아미노기)에 직접 전달한다. E3 효소도 역시 기질 단백질의 라이신과 Ub의 글리신 간의 안정된 이소펩타이드 결합을 촉매한다. 기질 단백질에 결합된 Ub-C 말단의 라이신에 또 다른 Ub이 연결될 수 있는데, 이러한 과정을 반복하여, 기질 단백질에 여러 개의 Ub이 가지를 친 모양으로 연결되어 폴리-유비퀴틴 사슬(poly-ubiquitin chain)을 형성하면, 그 단백질은 26S 프로테아좀(proteasome)에 인식되어 선택적으로 분해된다. 본 발명은 OsSIRP3 단백질의 E3 유비퀴틴 리가아제(E3 Ub ligase)로서의 기능 여부를 확인하기 위해 in vitro 유비퀴틴화 분석(ubiquitination assay)을 수행하였다.

MBP(maltose binding protein)가 포함된 pMAL-c5x 벡터(New England BioLabs, 미국)에 OsSIRP3 유전자를 클로닝하였고, 단백질 발현을 위해 대장균 BL21 (DE3) pLysS(promega, 미국)를 사용하였다. 발현된 단백질은 아밀로스 레진(amylose resin; New England BioLabs)을 이용하여 정제하였으며, 정제된 MBP-OsSIRP3 단백질은 인간 E1(Sigma-Aldrich, 미국), 애기장대 E2(AtUBC10), 유비큐틴(Ub) 및 유비퀴틴화 버퍼(1M Tris-HCl, PH 7.5; 40mM ATP; 100mM MgCl₂; 40mM DTT)에서 30℃ 조건으로 3시간 동안 반응시켰다. 면역 분석법(Immunoblot analysis)에서는 1차 항체로 anti-Ub 항체(Sigma-Aldrich)를, 2차 항체로 goat anti-rabbit IgG 항체(Sigma-Aldrich)를 사용하였고, Super Signal West Pico(ThermoScientific, 미국)로 항체를 검출한 후 ChemiDoc^TM XRS+(Bio-Rad)를 이용하여 밴드를 확인하였다. 그 결과, MBP-OsSIRP3 단백질을 E1과 AtUBC10에서 반응시켰을 때(레인 4) 폴리-유비퀴틴 사슬(poly-ubiquitein chain; Poly-Ub)이 확인되었다(도 2B).

또한, OsSIRP3 단백질의 링 핑거 도메인에서 245번째 시스테인(Cysteine, C)을 알라닌(Alanine, A)으로 치환시켜 구조상 변화를 유도한 후 anti-Ub 항체를 이용하여 면역 분석법을 수행한 결과, MBP-OsSIRP3 단백질에서는 Poly-Ub이 확인되었으나, MBP-OsSIRP3^C245A에서는 Poly-Ub이 확인되지 않았다(도 2C). 상기 결과를 통해, OsSIRP3 단백질이 E3 리가아제 활성을 가지는 것을 알 수 있었다.

실시예 3. OsSIRP3 유전자가 과발현된 벼 형질전환 식물체에서 염 스트레스에 대한 반응 분석

OsSIRP3 유전자가 과발현된 벼 형질전환 식물체를 개발하기 위해, 35S: OsSIRP3-EYFP 및 35S: EYFP(대조구)가 포함된 아그로박테리움(Agrobacterium) GV3101 균주를 사용하여 벼 식물체를 형질전환시켰다. 형질전환된 종자(T₃)는 무라시게-스쿠그 배지(Murashige and Skoog medium; MS배지)에서 14시간(명):10시간(암), 28℃ 조건의 성장 챔버에서 14일간 배양하였으며, 염화나트륨은 농도별(100, 150 및 200 mM)로 MS 배지에 처리하였다.

OsSIRP3 유전자가 벼 식물체의 염 스트레스의 내성 조절에 미치는 영향을 분석하기 위해, OsSIRP3 유전자가 과발현된 형질전환체 T₃ 라인(#1, #3 및 #4)과 대조구 식물체(35S: EYFP)의 전사체 발현 수준을 q-PCR(quantitative real time polymerase chain reaction)로 분석하였다. 그 결과, 대조구 식물체에 비해 OsSIRP3 유전자 과발현체에서 OsSIRP3 유전자의 발현이 증가하였고, 이를 통해 OsSIRP3 유전자 과발현체가 제대로 제작되었음을 확인하였다(도 3A).

또한, OsSIRP3 유전자 과발현체 및 대조구 식물체에 다양한 농도의 염화나트륨을 각각 처리하여 종자 발아율 및 뿌리 생장률을 확인한 결과, 염을 처리하지 않은 경우, 종자 발아율 및 뿌리 생장률은 대조구 식물체와 OsSIRP3 유전자 과발현체 간에 유의적 차이가 없었으나, 벼에 처리한 염의 농도가 증가할수록 종자 발아율 및 뿌리 생장률은 대조구 식물체에 비해 OsSIRP3 유전자 과발현체에서 유의적으로 감소한 것을 확인하였다.

상기 결과를 통해, OsSIRP3 유전자가 식물체에서 과발현되면 염 스트레스에 대한 민감성이 증가되는 것을 알 수 있었고, OsSIRP3 유전자의 발현 조절을 통해 식물체의 염 스트레스에 대한 내성을 조절할 수 있을 것으로 사료되었다.

<110> KNU-Industry Cooperation Foundation <120> OsSIRP3 gene from Oryza sativa for controlling salt stress tolerance of plant and uses thereof <130> PN18365 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1107 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atgtcgacca agagggttct ttgcaagttc ttcatgcatg gagcttgctt gaaaggagag 60 tactgtgagt tctcccatga ttggaatgat caaccaaaca atgtttgcac gttctaccag 120 aaaggttcat gctcgtatgg tagccgttgc cgatatgacc atgtcaaagt ttctcgtaac 180 cccacagtgg ctccaccacc aagctcaagt actacaacac gtgcatctag ttctcttcag 240 cctttgagtt tcgggcgccc tcaccatgtg gggtaccaag cagattcaag caacccaagg 300 caacagatat ctatggatgt gctggcacat tctggaagta agcctgtatg gagaaatgat 360 tttcaacatg aaagtgtact tgaggatggg attgactggt caataagtcc aactgtgcaa 420 aaccagacaa ccttgagtcc tgctgatctg ccaatctgtt cttttgctgc tggtggtaat 480 tgtccttatg gggaagagtg ccctcagatg catggagatc tgtgcacaac ctgtgggaaa 540 atgtgcttac atccttatcg tcctgatgag agggaggaac ataccaagct atgtgagaaa 600 aaccacaagc gtcttgagtc tttgaaacgt agccaagaga tagaatgcag tgtctgcctg 660 gaccgtgtgc tctcaaagcc tactgctgct gaaaggaagt ttggactctt atctgagtgt 720 gatcatccct tctgtatttc atgtattaga aattggcgta acaattctcc tacgtctgga 780 atggatgtga actcagcact gagggcttgt ccaatatgtc gcaaactttc atactatgtc 840 attccaagtg ttctttggta cttttcgaag gaggaaaagc tggagattat tgacaactat 900 aaagccaaac tcaagtctat tgactgcaag tacttcgatt ttggaactgg tacttgtccc 960 tttgggtcaa gctgtttcta caagcatgcc tacagagacg gacgcttgga agaggtcata 1020 ctgcgacatc ttgatgctga cgatggaagt acagtgattg ccaaaaatat taggttgtcg 1080 gacttcctca gtcggttaca tctttag 1107 <210> 2 <211> 368 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 2 Met Ser Thr Lys Arg Val Leu Cys Lys Phe Phe Met His Gly Ala Cys 1 5 10 15 Leu Lys Gly Glu Tyr Cys Glu Phe Ser His Asp Trp Asn Asp Gln Pro 20 25 30 Asn Asn Val Cys Thr Phe Tyr Gln Lys Gly Ser Cys Ser Tyr Gly Ser 35 40 45 Arg Cys Arg Tyr Asp His Val Lys Val Ser Arg Asn Pro Thr Val Ala 50 55 60 Pro Pro Pro Ser Ser Ser Thr Thr Thr Arg Ala Ser Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Leu Ser Phe Gly Arg Pro His His Val Gly Tyr Gln Ala Asp Ser 85 90 95 Ser Asn Pro Arg Gln Gln Ile Ser Met Asp Val Leu Ala His Ser Gly 100 105 110 Ser Lys Pro Val Trp Arg Asn Asp Phe Gln His Glu Ser Val Leu Glu 115 120 125 Asp Gly Ile Asp Trp Ser Ile Ser Pro Thr Val Gln Asn Gln Thr Thr 130 135 140 Leu Ser Pro Ala Asp Leu Pro Ile Cys Ser Phe Ala Ala Gly Gly Asn 145 150 155 160 Cys Pro Tyr Gly Glu Glu Cys Pro Gln Met His Gly Asp Leu Cys Thr 165 170 175 Thr Cys Gly Lys Met Cys Leu His Pro Tyr Arg Pro Asp Glu Arg Glu 180 185 190 Glu His Thr Lys Leu Cys Glu Lys Asn His Lys Arg Leu Glu Ser Leu 195 200 205 Lys Arg Ser Gln Glu Ile Glu Cys Ser Val Cys Leu Asp Arg Val Leu 210 215 220 Ser Lys Pro Thr Ala Ala Glu Arg Lys Phe Gly Leu Leu Ser Glu Cys 225 230 235 240 Asp His Pro Phe Cys Ile Ser Cys Ile Arg Asn Trp Arg Asn Asn Ser 245 250 255 Pro Thr Ser Gly Met Asp Val Asn Ser Ala Leu Arg Ala Cys Pro Ile 260 265 270 Cys Arg Lys Leu Ser Tyr Tyr Val Ile Pro Ser Val Leu Trp Tyr Phe 275 280 285 Ser Lys Glu Glu Lys Leu Glu Ile Ile Asp Asn Tyr Lys Ala Lys Leu 290 295 300 Lys Ser Ile Asp Cys Lys Tyr Phe Asp Phe Gly Thr Gly Thr Cys Pro 305 310 315 320 Phe Gly Ser Ser Cys Phe Tyr Lys His Ala Tyr Arg Asp Gly Arg Leu 325 330 335 Glu Glu Val Ile Leu Arg His Leu Asp Ala Asp Asp Gly Ser Thr Val 340 345 350 Ile Ala Lys Asn Ile Arg Leu Ser Asp Phe Leu Ser Arg Leu His Leu 355 360 365

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsSIRP3(Oryza sativa salt-induced RING finger protein 3) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환시켜 OsSIRP3 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 식물체의 염 스트레스에 대한 민감성을 증가시키는 방법.
삭제
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsSIRP3 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 염 스트레스에 대한 민감성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법.
제3항의 방법에 의해 제조된 염 스트레스에 대한 민감성이 증가된 형질전환 식물체.
제4항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsSIRP3 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 식물체의 염 스트레스에 대한 민감성 증가용 조성물.