KR102231012B1 - 식물의 인산 흡수 효율을 증진시키는 버크홀데리아 파이로시니아 ch-67 유래 pap9 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물의 인산 흡수 효율을 증진시키는 버크홀데리아 파이로시니아 CH-67 유래 PAP9 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 식물체에서 PAP9 유전자의 발현 조절을 통해 인산 흡수율이 증진되고 인산 결핍 스트레스를 극복할 수 있는 식물체를 개발하는데 이용될 수 있을 것이다.

Description

식물의 인산 흡수 효율을 증진시키는 버크홀데리아 파이로시니아 CH-67 유래 PAP9 유전자 및 이의 용도{Purple acid phosphatase 9 gene from Burkholderia pyrrocinia CH-67 improving phosphate uptake efficiency in plant and uses thereof}

본 발명은 식물의 인산 흡수 효율을 증진시키는 버크홀레디아 파이로시니아 CH-67 유래 PAP9 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.

인구의 급속한 증가로 인해 식량 부족은 전 세계적으로 큰 문제가 되고 있으며, 이를 극복하기 위해 다수성(high yielding ability) 식량 작물의 육성이 요구되고 있다. 다수성 식량 작물을 육성하기 위해서는 작물에 충분한 영양소를 공급해야 한다. 이를 위해 비료를 처리하고 있으며, 비료의 주요 성분 중 하나가 인산이다. 인산은 식물의 생장과 발달에 중요한 필수 영양소 중 하나로, 인지질, 핵산 등을 구성하는 주요 요소일 뿐만 아니라 에너지 전달, 신호 전달, 효소 활성 조절, 대사산물의 생합성, 광합성 및 호흡 등 식물 세포 내에서 일어나는 모든 물질대사 과정에서 중요한 기능을 수행한다. 인산은 수용성 무기인산염 형태로만 사용이 가능하지만, 대부분 토양 내 인산은 주로 식물이 이용할 수 없는 유기물 또는 철이나 알루미늄과 같은 금속 이온과 결합한 형태로 존재하기 때문에 실제 식물이 이용할 수 있는 유효 인산의 양은 토양 속에 극히 적은 양으로 존재하고 있다. 식물은 인산이 결핍된 조건에서 뿌리의 생장과 뿌리털의 형성을 촉진하여 표면적을 넓히고, 고친화성 인산 운반체, 탈인산화효소 및 유기산 생합성과 분비에 관련된 유전자들의 발현을 유도함으로써 인산 흡수 능력을 향상시키고 인산 이용성을 증가시키는 것으로 알려져 있다.

식물 생장을 위해 인산을 비료 형태로 공급하고 있으나, 공급된 대부분의 인산이 토양에 존재하는 유기물 또는 금속 이온과 결합하여 식물이 이용할 수 없는 형태로 고정화되며, 특히, 산성 토양의 경우 과다 축적된 알루미늄 이온으로 인해 더 활발한 인산 고정화가 일어나기 때문에 토양의 인산 유효성이 더욱 낮다. 식물 생장에 필요한 토양 내 유효 인산 농도를 증가시키기 위해 처리되는 비료는 농업 생산 비용을 증가시키는 원인이 될 뿐만 아니라, 비료의 과다 사용으로 인해 미처 흡수되지 못한 비료는 토양에 집적되고 토양 산성화를 일으켜 작물의 생육에 악영향을 미치고 지하수 오염 및 지표수의 부영양화를 초래한다. 이러한 문제의 근본적인 해결 방안은 토양 내 인산이 결핍된 조건에서 식물의 인산 흡수력을 향상시켜 비료의 사용량을 줄이는 것이다. 따라서, 토양 내 인산 결핍 조건에서도 효율적으로 생장할 수 있는 식물체의 개발이 요구되고 있다.

식물의 무기양분 흡수와 관련된 연구는 재배학적 측면의 연구와 식물 생리학적 측면의 연구가 오래전부터 이루어져 왔으나, 최근에는 무기양분 흡수에 대한 분자 수준의 기초 연구를 토대로 무기양분 흡수와 관련된 유전자들을 이용하여 작물의 생육과 수량을 증가시키고, 극도로 양분이 제한된 조건에서도 생장이 가능한 작물을 육종하기 위한 연구들이 세계적으로 활발히 진행되고 있다.

한편, 한국등록특허 제1546728호에는 '식물의 인산 흡수 효율을 증진시키는 OgPT 유전자 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1064590호에는 '인산결핍조건에서 발현되는 벼 탈인산화효소 유전자 OsPAP1 및 형질전환 식물체'가 개시되어 있으나, 본 발명의 식물의 인산 흡수 효율을 증진시키는 버크홀데리아 파이로시니아 CH-67 유래 PAP9 유전자 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 버크홀데리아 파이로시니아(Burkholderia pyrrocinia) CH-67 유래 PAP9(purple acid phosphatase 9) 유전자를 과발현하는 애기장대 형질전환체를 제조하였다. 또한, 인산결핍조건에서 대조구 식물체(야생형 애기장대)에 비해 PAP9 과발현 형질전환체에서 산성인산분해효소(acid phosphatase, APase) 활성 및 인산 함량이 증가된 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 버크홀데리아 파이로시니아(Burkholderia pyrrocinia) CH-67 유래 PAP9(purple acid phosphatase 9) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 PAP9 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물체의 인산 흡수 효율을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 버크홀데리아 파이로시니아 CH-67 유래 PAP9 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는 야생형에 비해 인산 흡수 효율이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 인산 흡수 효율이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 버크홀데리아 파이로시니아 CH-67 유래 PAP9 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 식물체의 인산 흡수 효율 증가용 조성물을 제공한다.

본 발명의 버크홀데리아 파이로시니아(Burkholderia pyrrocinia) CH-67 유래 PAP9(purple acid phosphatase 9) 단백질을 코딩하는 유전자는 식물체의 인산 흡수 효율을 증진시키므로, 식물체에서 PAP9 유전자의 발현 조절을 통해 인산 흡수능이 증진된 식물체를 개발하는데 이용할 수 있다. 또한, 인산 흡수 능력이 향상된 식물체는 인산 결핍 스트레스를 극복할 수 있으므로, 비료 투입량 절감에 따른 농업 생산 비용 감소 및 환경 오염 방지 효과도 얻을 수 있을 것으로 예상된다.

도 1은 버크홀데리아 파이로시니아(Burkholderia pyrrocinia) CH-67 유래 PAP9(purple acid phosphatase 9) 단백질과 기존에 보고되어진 식물 및 동물의 PAP 단백질들 간의 아미노산 서열을 비교한 그림이다. 네모칸: 보존된 모티브(GDLA/GDLCY/GNHE/VQMH/GHDH), 노란색: 활성 위치, 검정색 점: 금속 결합 부위(D165, D199, Y203, N237, H354, H391, H393).
도 2는 PAP9 재조합 단백질의 효소 활성을 측정한 결과로, (A)는 pH 조건에 따른 효소 활성, (B)는 최적 pH 8.5에서 온도에 따른 효소 활성 및 (C)는 온도와 시간에 따른 열 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 3A는 인산충분(+Pi) 및 인산결핍(-Pi) 조건에서 배양된 PAP9 과발현 형질전환체(#3 및 #9)에서 PAP9 유전자의 발현을 확인한 RT-PCR 결과이고, 도 3B 및 3C는 pH 5.4/37℃, pH 8.5/37℃, pH 5.4/75℃ 또는 pH 8.5/85℃의 인산충분 및 인산 결핍 조건에서 배양된 PAP9 과발현 형질전환체의 APase 활성을 측정한 결과이다.
도 4A는 인산충분(+Pi) 및 인산결핍(+Pi) 조건에서 배양된 PAP9 과발현 형질전환체(#3 및 #9)의 뿌리를 대상으로 BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate) 염색을 수행한 사진이고, 도 4B는 인산충분(+Pi) 및 인산결핍(-Pi) 조건에서 배양된 PAP9 과발현 형질전환체의 뿌리 표면(root-associated APase)과 배양 배지(Medium APase)의 APase 활성을 측정한 결과이고, 도 4C는 인산충분(+Pi), +Pi/pH 5.4, +Pi/pH 8.5, 인산결핍(-Pi), -Pi/pH 5.4 또는 -Pi/pH 8.5 배지에서 배양된 PAP9 과발현 형질전환체의 뿌리 표면에서 root-associated APase 활성을 측정한 결과이며, 도 4D는 pH 8.5 조건에서 pNPP, ATP, Glu-6-P(glucose-6-phosphate), TSPP(pyrophosphate tetrabasic), Ser-P(O-phosphoserine) 또는 Tyr-P(O-phosphotyrosine) 기질 처리에 따른 root-associated APase 활성을 측정한 결과이다.
도 5A는 인산결핍(-Pi), 인산결핍(-Pi)+Tyr-P(50μM) 또는 인산충분(+Pi) 배지에서 배양된 PAP9 과발현 형질전환체(#3 및 #9)의 생장 상태를 나타낸 사진이고, 도 5B는 인산결핍(-Pi), 인산결핍(-Pi)+Tyr-P(50μM) 또는 인산충분(+Pi) 배지에서 배양된 PAP9 과발현 형질전환체(#3 및 #9)의 뿌리 및 줄기의 생중량을 측정한 결과이며, 도 5C는 인산결핍(-Pi), 인산결핍(-Pi)+Tyr-P(50μM) 또는 인산충분(+Pi) 배지에서 배양된 PAP9 과발현 형질전환체(#3 및 #9)의 뿌리 및 줄기 내 인산 함량을 측정한 그래프이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 버크홀데리아 파이로시니아(Burkholderia pyrrocinia) CH-67 유래 PAP9(purple acid phosphatase 9) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 PAP9 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물체의 인산 흡수 효율을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 버크홀데리아 파이로시니아 CH-67 유래 PAP9 단백질의 범위는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질이 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체의 인산 흡수 효율 증진 활성을 의미한다.

본 발명에 따른 버크홀데리아 파이로시니아 CH-67 유래 PAP9 단백질은 pH 8~9 및 80~85℃, 바람직하게는 pH 8.5 및 85℃에서 최적의 효소 활성을 가질 수 있다. 상기 식물체의 인산 흡수 효율 증가는 pH 8~9에서 인산 충분 조건에 비해 인산 결핍 조건에서 뿌리 표면의 APase(acid phohphatase) 활성을 증가시킴으로써 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 PAP9 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하며, 상기 유전자의 범위는 PAP9 단백질을 코딩하는 게놈 DNA, cDNA 및 합성 DNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 PAP9 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 명세서에서, 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 발현 또는 클로닝을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들면, pLλ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보솜 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(Escherichia coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ 프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 상기 프로모터는 형질전환에 적합한 프로모터들로서, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터 또는 히스톤 프로모터일 수 있으며, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서, 용어 "프로모터"는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시성(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 항시성 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 항시성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

재조합 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 상기 마커 유전자는 항생제 내성 유전자(antibiotics resistance gene) 또는 영양요구 마커 유전자(auxotrophic marker gene)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 원핵세포의 예로는, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 츄린겐시스(Bacillus thuringiensis)와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세슨스(Serratia marcescens) 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포(예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법, 하나한 방법(Hanahan, D., 1983 J. Mol. Biol. 166, 557-580) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 버크홀데리아 파이로시니아 CH-67 유래 PAP9 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는 야생형에 비해 인산 흡수 효율이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 인산 흡수 효율이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법에 있어서, 상기 PAP9 단백질의 범위는 전술한 것과 같다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 튜머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

또한, 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 제조방법에 의해 제조된 인산 흡수 효율이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

상기 식물체는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수 수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물 또는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 쌍자엽 식물일 수 있고, 더욱 바람직하게는 애기장대일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 버크홀데리아 파이로시니아 CH-67 유래 PAP9 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 식물체의 인산 흡수 효율 증가용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 유효성분으로 버크홀데리아 파이로시니아 CH-67 유래 PAP9 유전자 또는 상기 PAP9 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 포함하며, 상기 유전자의 발현이 증가되면 식물체의 인산 흡수 효율을 증가시킬 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 버크홀데리아 파이로시니아 CH-67 유래 PAP9 유전자의 분리

본 발명에서는 토양미생물인 버크홀데리아 파이로시니아(Burkholderia pyrrocinia) CH-67을 사용하였다. B. pyrrocinia CH-67의 게놈 서열을 토대로 PAP9 유전자에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머(정방향 프라이머 5'-CACCATGTCGAACCCGG ACAAC-3'(서열번호 3) 및 역방향 프라이머 5'-TTACCGTTCGCGGCGCTT-3'(서열번호 4))를 제작하였고, PCR을 통해 유전자의 코딩 영역을 증폭하였다. 증폭된 산물을 pEntr 벡터에 클로닝하여 시퀀싱을 통해 유전자의 염기서열을 확인하였다. 또한, 본 발명의 PAP9 아미노산 서열과 기존에 보고되어진 식물 및 동물의 PAP 아미노산 서열들 간의 상동성을 분석하기 위하여 PSI-BLAST(Position-specific iterated BLAST) 검색과 Clustal W 프로그램을 이용하여 비교한 결과, 본 발명의 PAP9 단백질과 기존의 식물 및 동물의 PAP 단백질은 5개의 보존된 모티프(GDLA/GDLCY/GNHE/VQMH/GHDH)와 7개의 금속 결합 부위(D165, D199, Y203, N237, H354, H391, H393)를 갖고 있는 것을 확인하였다(도 1).

실시예 2. 버크홀데리아 파이로시니아 CH-67 유래 PAP9 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용한 PAP9 단백질 활성 분석

PAP9 단백질의 활성 분석을 수행하기 위해 재조합 PAP9 단백질을 제작하였다. 우선, PAP9 유전자의 올리고뉴클레오티드 프라이머(정방향 프라이머 5'-GGATCCATGTCGAACCCGGACAAC-3'(서열번호 5) 및 역방향 프라이머 5'-AAGCTTTTACCGTTCGCGGCGCTT-3'(서열번호 6))를 이용하여 PCR을 통해 유전자의 코딩 영역을 증폭시킨 후 pGEMT-easy 벡터(Promega, 미국)에 클로닝하고, GST(glutathione S-transferase) 태그를 포함하는 단백질 발현벡터인 pET-42a(+) 벡터로 서브 클로닝하여 재조합 벡터를 제작하였다. 제조된 재조합 벡터로 대장균 BL21(DE3)을 형질전환시킨 후 1mM IPTG(Isopropyl-β-D-thio-galactoside)을 첨가하고 28℃에서 4시간 동안 배양하여 PAP9 재조합 단백질의 발현을 유도하였으며, 재조합 단백질은 GSTrap FF 컬럼으로 정제하였다. 상기 정제된 PAP9 재조합 단백질을 사용하여 다양한 pH, 온도 및 시간 조건에 따라 효소 활성을 측정하였다.

우선, 효소 활성의 최적 pH를 확인하기 위해 재조합 단백질 10ug과 1mM pNPP(p-nitrophenol phosphate) 기질을 함유하는 sodium acetate buffer(pH 3.0~6.0), Tris-maleate buffer(pH 6.0~7.5) 또는 Tris-Cl buffer(pH 7.5~9.5) 3종류의 버퍼를 각각 혼합하여 37℃에서 30분간 반응시키고, 0.1M NaOH를 첨가하여 반응을 정지시킨 후 410nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 일반적인 APase(acid phosphatase)의 최적 pH가 5.4인 것과 다르게, 본 발명의 PAP9 단백질의 효소 활성은 pH 8.5에서 가장 우수함을 확인하였다(도 2A).

또한, 효소 활성의 최적 온도를 확인하기 위해 최적 pH 8.5 조건하에 20℃에서 100℃까지 온도를 높이면서 재조합 단백질의 활성을 측정한 결과, PAP9 활성이 20℃에서 85℃까지 계속 증가하다가 85℃ 이상에서 급격하게 감소하는 것을 확인하였으며, 이를 통해 최적 온도가 대략 85℃임을 알 수 있었다(도 2B). 또한, 효소의 열 안정성을 측정하기 위해 50~85℃의 온도에서 10~60분 동안 반응시킨 후 잔류 효소 활성을 측정한 결과, 70℃에서 60분 동안 열처리하여도 여전히 효소 활성이 나타나는 것을 확인하였다(도 2C).

실시예 3. PAP9 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용한 애기장대 형질전환체 제작, 형질전환체에서 PAP9 발현량 및 포스파타아제 활성 분석

3-1. 애기장대 형질전환체의 제작 및 PAP9 발현량 분석

강한 항시성 프로모터인 CaMV 35S 프로모터에 의해 발현이 조절되는 데스티네이션 벡터(destination vector; pH7WG2D,1)에 PAP9 유전자의 코딩 영역을 클로닝하여 재조합 벡터를 구축한 후 삼친교배(triparental mating) 방법으로 아그로박테리움 튜머파시엔스 GV2260에 도입하였으며, 상기 재조합 벡터가 도입된 아그로박테리움 튜머파시엔스 균주를 이용하여 야생형 애기장대(Col-0)에 형질전환하였다.

상기 PAP9 과발현 애기장대 식물체로부터 수확한 종자를 대조구(야생형 애기장대 종자)와 함께 MS배지에 치상하고 7일 후, 인산결핍(0.0125mM KH₂PO₄)과 인산충분(1.25mM KH₂PO₄) 조건의 MS 배지(200mM NH₄NO₃, 200mM KNO₃, 3mM MgSO₄·7H₂O, 1.25mM KH₂PO₄, 6mM CaCl₂·2H₂O, 10mM Na₂-EDTA, 10mM FeSO₄·7H₂O, 1mM H₃BO₃, 1.5mM MnSO₄·4H₂O, 0.3mM ZnSO₄·7H₂O, 0.5mM KI, 10uM Na₂MoO₄·2H₂O, 55M Myo inositol, 3M Tiamin-HCl, 0.8M Nicotinic acid, 0.5M Pyridoxine HCl, 0.01M CuSO₄·5H₂O, 0.01M CoCl₂·6H₂O, 2.3mM MES, 1.2% Sucrose 및 6% Agar; pH 5.7)로 옮기고 7일간 배양한 다음 RT-PCR을 통해 PAP9 유전자의 도입 여부를 확인하였다. RT-PCR을 수행하기 위해 RNA purification reagent(Invitrogen, 미국)로 RNA를 추출한 후 SuPrimeScript RT-PCR 키트(GeNet Bio, 한국)를 사용하였으며, RT-PCR에 사용된 프라이머의 정보는 다음과 같다: PAP9 정방향 프라이머 5'-CGTGGCTTCCTGAAACTCGC-3'(서열번호 7), PAP9 역방향 프라이머 5'-GCTCGCGGTGAACGGTTG-3'(서열번호 8), ACTIN 정방향 프라이머 5'-AGTGTGTCTTGTCTTATCTGGTTCG-3'(서열번호 9) 및 ACTIN 역방향 프라이머 5'-AGCTGCATTGTCACCCGATACT-3'(서열번호 10).

RT-PCR 수행 결과, 대조구 식물체(야생형 애기장대)에서는 PAP9이 발현되지 않고 형질전환체서만 PAP9이 발현되는 것을 확인하였고, 이를 통해 형질전환체에 PAP9이 제대로 도입되었음을 알 수 있었으며 유전자 발현량이 높은 형질전환체 #3와 #9를 선발하여 실험에 사용하였다.

3-2. PAP9 과발현 형질전환체의 포스파타아제 활성 분석

PAP9 과발현 형질전환체의 포스파타아제 활성을 측정하기 위해, 대조구 식물체와 형질전환체를 pH 5.4/37℃, pH 8.5/37℃, pH 5.4/75℃ 및 pH 8.5/85℃ 4가지 조건의 인산충분과 인산결핍 MS 배지에서 7일간 배양한 후 줄기와 뿌리를 액체질소로 분말화하고, 단백질 추출 버퍼(100mM potassium acetate, 20mM CaCl₂, 2mM EDTA, 0.1mM phenylmethylsulfonyl fluoride 및 20% glycerol; pH 5.4)로 현탁한 후 30분간 차가운 곳에서 반응시키고 4℃, 14,000g 조건에서 20분 동안 원심분리하여 상등액만 취하여 단백질 추출물을 제조한 다음 APase(acid phophatase) 활성을 측정하였다.

그 결과, pH 8.5/85℃ 조건을 제외한 3가지 조건에서 대조구와 형질전환체의 단백질 추출물 처리군의 총 APase 활성은 인산충분(+Pi) 조건에 비해 인산결핍(-Pi) 조건에서 약 2배 증가하였으며, 특히, pH 8.5/85℃의 인산결핍(-Pi) 조건에서 형질전환체의 APase 활성이 가장 우수함을 확인하였다(도 3B 및 3C).

실시예 4. 식물체의 뿌리에서 분비되는 PAP9 효소 활성 분석

PAP9 단백질이 식물체의 뿌리 부분에서 분비되는 것인지 확인하기 위해, 인산충분 및 인산결핍 조건의 배지에서 배양된 대조구 식물체(야생형 애기장대) 및 PAP9 과발현 형질전환체의 뿌리에 6% agar와 0.01% BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate)가 포함된 sodium acetate buffer(pH 5.4) 및 Tris-Cl buffer(pH 8.5)을 각각 처리하고 밤새 반응시켜 BCIP 염색을 수행하였다.

그 결과, 인산충분 및 인산결핍 조건 모두 대조구에 비해 형질전환체의 뿌리에서 강한 발색이 나타난 것을 확인하였고, 특히 인산결핍 조건의 형질전환체 뿌리에서 발색이 더 강한 것으로 보아 인산결핍 조건에서 형질전환체의 APase 활성이 가장 우수함을 알 수 있었다(도 4A).

또한, 인산충분 및 인산결핍 조건의 배지에서 배양된 식물체 뿌리 표면과 사용된 배지(medium)를 대상으로 APase 활성을 측정하였다. 뿌리-관련 APase 활성(이하, root-associated APase)은 Wang L(Plant Physiol, 157, 1283-1299, 2011)에 기재된 방법을 일부 변형하여 측정하였으며, 구체적으로 7일간 배양된 대조구 식물체 및 PAP9 과발현 형질전환체를 인산충분 또는 인산결핍 배지가 포함된 2㎖ 튜브에서 3일간 배양한 후 증류수로 세척하고 새로운 인산충분 또는 인산결핍 배지가 포함된 튜브에서 다시 배양하였다. 그리고 인산충분 인산결핍 배지에서 배양된 식물체를 다시 sodium acetate buffer(pH 5.4) and Tris-Cl buffer(pH 8.5)가 담긴 튜브에 옮기고, 1mM pNPP를 첨가하여 APase 활성을 측정하였다. 방출된 인산은 몰리브덴 블루법(molybdenum blue method)을 사용하여 측정하였다.

그 결과, 도 4B에 나타난 바와 같이, 뿌리 표면 APase 활성이 배양 배지(medium) APase 활성 보다 약 2배 이상 증가하였고, 특히 뿌리 표면 APase 실험군에서 인산충분 조건에 비해 인산결핍 조건의 APase 활성이 현저히 증가한 것을 확인하였다.

또한, 도 4C에 나타난 바와 같이, 인산충분(+Pi), +Pi/pH 5.4, +Pi/pH 8.5, 인산결핍(-Pi), -Pi/pH 5.4 또는 -Pi/pH 8.5 배지에서 대조구 및 형질전환체의 root-associated APase 활성을 측정한 결과, 대조구에 비해 형질전환체에서 뿌리 표면 APase 활성이 유의적으로 증가한 것을 확인하였다. 특히, 인산충분 조건에 비해 인산결핍 조건의 형질전환체에서 뿌리 표면 APase 활성이 증가하였고, -Pi/pH 8.5의 인산결핍 및 알칼리 조건에서 대조구에 비해 형질전환체의 뿌리 표면 APase 활성이 약 3~4배 증가한 것을 확인하였다.

또한, 알칼리 조건에서 다양한 기질(pNPP, ATP, Glu-6-P(glucose-6-phosphate), TSPP(pyrophosphate tetrabasic), Ser-P(O-phosphoserine) 및 Tyr-P(O-phosphotyrosine))에 대한 root-associated APase 활성을 측정한 결과, 대조구 식물체에 비해 형질전환체에서 root-associated APase 활성이 현저하게 증가한 것을 확인하였다(도 4D). 이를 통해, PAP9 과발현 형질전환체에서 PAP9은 근권(rhizosphere)으로도 방출이 가능하고 총 root-associated APase 활성에 관여함을 알 수 있었다.

실시예 5. PAP9 과발현 형질전환체에서 인산 이용 효율 분석

상기 실험을 통해 인산결핍 조건에서 PAP9 과발현 형질전환체의 APase 활성이 향상된 것을 확인한 후 형질전환체에서 인산 이용율을 분석하기 위해, 대조구와 형질전환체를 MS 배지에 치상하고 5일간 배양한 후 인산충분 배지, 인산결핍 배지 또는 Tyr-P(O-phosphotyrosine) 50uM(이하, 50uM)이 첨가된 인산결핍 배지로 각각 옮겨 식물체의 생장 및 식물체 내 인산 함량을 측정하였다.

우선, 대조구와 형질전환체의 생중량을 비교한 결과, 인산결핍(-Pi 및 -Pi+50uM) 조건에서 형질전환체 줄기 및 뿌리의 생중량은 대조구와 유사한 수준으로 유지하거나 증가되었음을 확인하였다. 기질 Tyr-P 처리군에서는 대조구에 비해 형질전환체에서 생중량이 유의적으로 증가하였는데, 이는 인산결핍 조건에서 식물체가 기질을 사용하여 생장이 증가한 것으로 사료되었다(도 5A 및 5B).

또한, 대조구와 형질전환체의 줄기 및 뿌리 내 인산 함량을 측정한 결과, 형질전환체의 줄기 내 인산 함량은 인산결핍 조건(-Pi 및 -Pi+50uM)과 인산충분(+Pi) 조건에서 모두 대조구에 비해 유의적으로 증가하였고, 형질전환체의 뿌리 내 인산 함량 또한 인산결핍 조건(-Pi+50uM)과 인산충분 조건(+Pi)에서 대조구에 비해 유의적으로 증가한 것을 확인하였다(도 5C).

<110> Dong-A University Research Foundation For Industry-Academy Cooperation <120> Purple acid phosphatase 9 gene from Burkholderia pyrrocinia CH-67 improving phosphate uptake efficiency in plant and uses thereof <130> PN19401 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1689 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Burkholderia pyrrocinia <400> 1 atgtcgaacc cggacaacgc ccccgatcag caacacgaac ccgtcgccgc cgtctcgcgc 60 cgtggcttcc tgaaactcgc cggcgtgtcc ggcctcgcga ccgcgacggg cggcctcgcg 120 gctgccggca aggccgccgc gtcgagcccg gacggcacgc ccgagcagat ccacctgacg 180 tggggcgacg acccggcgtc ggacgtcgtg atctcgtggg cgtcgctcgc gccggccgtc 240 aatccgcatg cgcggatcag cgccgacggc gagcctgcgc gcgtcgtgca cggcgtgcag 300 cgcctgtaca cggacggcct caacggcgag acggtgttca cctatcacgc gcgcgtgcac 360 ggcctcaagc ccggcacccg ctaccagtac gtgctcacgg ccgacaacga cagcaacgcc 420 gcgcaaccgt tcaccgcgag cttcacgacc gcgccgcgcg gccgcgcgcc gttccgcttc 480 acgagctacg gcgatctcgc gacgccgaac ggcgcctggg tgctgtcgtc gccgcaaagc 540 cgcttcgccg tgcaggcggt cgaacagttc cagccgctgt tccatctgct gaacggcgac 600 ctgtgctacg cgaacctgaa cccggcgcac cagcccgagg tgtggcgcga cttcggcaac 660 aacaaccaga cgtcggccgc gaatcgcccg tggatgccgt gccccggcaa ccatgaagtc 720 gagttcaaca acggcccgca gggcttcgat tcgtatctcg cgcgctacca gctgcccgag 780 aacggcacgc actttccggg ccgctggtac agcttccgcg tgagctcggt gctgttcatc 840 tcgctcgatg cggacgacgt cgtctaccag gacgcggccg cgttcgtcgc cggcccgaac 900 ccgctcgtgc cggccgccag caccggccat ccgccgatcg agccgggcac gtcgttctac 960 gtgcgcggct acagccgcgg cgagcagacc cgctggctcg aacgcacgct gcaccacgcg 1020 tcgacgagcg acgacatcga ctggatcgtc gtgcagatgc accaggacgc gctgagttcg 1080 tcgaagaccg gcaacggctc ggacaagggc atccgcgaag cgtggctgcc gctgttcgac 1140 cgctacggcg tcgatctcgt gctgtgcggc cacgatcacg actacgagcg cagctacccg 1200 gtgcgcggct gcaaccaccg cgcgggtgtc gacgccgcga cgggcgaagt ggtcgacacg 1260 ctgcagccgc gtccggccgt gccggccgat ccggcgcgcg cgacgttcga cacgagccac 1320 ggcacgatcc acctgatcct cggcggcggc ggcacgagcg cgccgctcga cgtgtatggc 1380 gaaaaccccg cgacgggctt cgcgcaagcg aaggtgttca cgaagccgaa ccggccggtg 1440 ccgggcgcgg cggcgaacac gttcgtgcgc aagccggccg acgcgctcga ggacgcgatc 1500 tggtccgcgc gccgcgatac gggcaccggc tacggaatcg cggtgttcga ccacgatccg 1560 ggcacggcgg gcggcgacac gacgatcacg atgcgctact accatgcgcc gggcgcggac 1620 cagcagccga ccgcgcggta tgagctgttc gagacgatcg tgatgagcaa gaagcgccgc 1680 gaacggtaa 1689 <210> 2 <211> 562 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Burkholderia pyrrocinia <400> 2 Met Ser Asn Pro Asp Asn Ala Pro Asp Gln Gln His Glu Pro Val Ala 1 5 10 15 Ala Val Ser Arg Arg Gly Phe Leu Lys Leu Ala Gly Val Ser Gly Leu 20 25 30 Ala Thr Ala Thr Gly Gly Leu Ala Ala Ala Gly Lys Ala Ala Ala Ser 35 40 45 Ser Pro Asp Gly Thr Pro Glu Gln Ile His Leu Thr Trp Gly Asp Asp 50 55 60 Pro Ala Ser Asp Val Val Ile Ser Trp Ala Ser Leu Ala Pro Ala Val 65 70 75 80 Asn Pro His Ala Arg Ile Ser Ala Asp Gly Glu Pro Ala Arg Val Val 85 90 95 His Gly Val Gln Arg Leu Tyr Thr Asp Gly Leu Asn Gly Glu Thr Val 100 105 110 Phe Thr Tyr His Ala Arg Val His Gly Leu Lys Pro Gly Thr Arg Tyr 115 120 125 Gln Tyr Val Leu Thr Ala Asp Asn Asp Ser Asn Ala Ala Gln Pro Phe 130 135 140 Thr Ala Ser Phe Thr Thr Ala Pro Arg Gly Arg Ala Pro Phe Arg Phe 145 150 155 160 Thr Ser Tyr Gly Asp Leu Ala Thr Pro Asn Gly Ala Trp Val Leu Ser 165 170 175 Ser Pro Gln Ser Arg Phe Ala Val Gln Ala Val Glu Gln Phe Gln Pro 180 185 190 Leu Phe His Leu Leu Asn Gly Asp Leu Cys Tyr Ala Asn Leu Asn Pro 195 200 205 Ala His Gln Pro Glu Val Trp Arg Asp Phe Gly Asn Asn Asn Gln Thr 210 215 220 Ser Ala Ala Asn Arg Pro Trp Met Pro Cys Pro Gly Asn His Glu Val 225 230 235 240 Glu Phe Asn Asn Gly Pro Gln Gly Phe Asp Ser Tyr Leu Ala Arg Tyr 245 250 255 Gln Leu Pro Glu Asn Gly Thr His Phe Pro Gly Arg Trp Tyr Ser Phe 260 265 270 Arg Val Ser Ser Val Leu Phe Ile Ser Leu Asp Ala Asp Asp Val Val 275 280 285 Tyr Gln Asp Ala Ala Ala Phe Val Ala Gly Pro Asn Pro Leu Val Pro 290 295 300 Ala Ala Ser Thr Gly His Pro Pro Ile Glu Pro Gly Thr Ser Phe Tyr 305 310 315 320 Val Arg Gly Tyr Ser Arg Gly Glu Gln Thr Arg Trp Leu Glu Arg Thr 325 330 335 Leu His His Ala Ser Thr Ser Asp Asp Ile Asp Trp Ile Val Val Gln 340 345 350 Met His Gln Asp Ala Leu Ser Ser Ser Lys Thr Gly Asn Gly Ser Asp 355 360 365 Lys Gly Ile Arg Glu Ala Trp Leu Pro Leu Phe Asp Arg Tyr Gly Val 370 375 380 Asp Leu Val Leu Cys Gly His Asp His Asp Tyr Glu Arg Ser Tyr Pro 385 390 395 400 Val Arg Gly Cys Asn His Arg Ala Gly Val Asp Ala Ala Thr Gly Glu 405 410 415 Val Val Asp Thr Leu Gln Pro Arg Pro Ala Val Pro Ala Asp Pro Ala 420 425 430 Arg Ala Thr Phe Asp Thr Ser His Gly Thr Ile His Leu Ile Leu Gly 435 440 445 Gly Gly Gly Thr Ser Ala Pro Leu Asp Val Tyr Gly Glu Asn Pro Ala 450 455 460 Thr Gly Phe Ala Gln Ala Lys Val Phe Thr Lys Pro Asn Arg Pro Val 465 470 475 480 Pro Gly Ala Ala Ala Asn Thr Phe Val Arg Lys Pro Ala Asp Ala Leu 485 490 495 Glu Asp Ala Ile Trp Ser Ala Arg Arg Asp Thr Gly Thr Gly Tyr Gly 500 505 510 Ile Ala Val Phe Asp His Asp Pro Gly Thr Ala Gly Gly Asp Thr Thr 515 520 525 Ile Thr Met Arg Tyr Tyr His Ala Pro Gly Ala Asp Gln Gln Pro Thr 530 535 540 Ala Arg Tyr Glu Leu Phe Glu Thr Ile Val Met Ser Lys Lys Arg Arg 545 550 555 560 Glu Arg <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 caccatgtcg aacccggaca ac 22 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ttaccgttcg cggcgctt 18 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ggatccatgt cgaacccgga caac 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 aagcttttac cgttcgcggc gctt 24 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cgtggcttcc tgaaactcgc 20 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gctcgcggtg aacggttg 18 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 agtgtgtctt gtcttatctg gttcg 25 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 agctgcattg tcacccgata ct 22

Claims (7)

1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 버크홀데리아 파이로시니아(Burkholderia pyrrocinia) CH-67 유래 PAP9(purple acid phosphatase 9) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 PAP9 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물체의 생장 및 식물체 내 인산 함량을 증가시키는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 PAP9 단백질은 pH 8~9 및 80~85℃에서 최적의 효소 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 식물체의 생장 및 식물체 내 인산 함량을 증가시키는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 식물체 내 인산 함량 증가는 pH 8~9에서 인산 충분 조건에 비해 인산 결핍 조건에서 뿌리 표면의 APase(acid phohphatase) 활성을 증가시킴으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 식물체의 생장 및 식물체 내 인산 함량을 증가시키는 방법.
4. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 버크홀데리아 파이로시니아(Burkholderia pyrrocinia) CH-67 유래 PAP9(purple acid phosphatase 9) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및
   상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 생장 및 인산 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법.
5. 제4항의 제조방법에 의해 제조된 생장 및 인산 함량이 증가된 형질전환 식물체.
6. 제5항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
7. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 버크홀데리아 파이로시니아(Burkholderia pyrrocinia) CH-67 유래 PAP9(purple acid phosphatase 9) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 식물체의 생장 및 식물체 내 인산 함량 증가용 조성물.

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