KR101581657B1 - AtSGR2 유전자를 이용한 비생물적 스트레스 내성이 증가된 녹색 지속 변이 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 AtSGR2 유전자를 이용한 비생물적 스트레스 내성이 증가된 녹색 지속 변이 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체에 관한 것으로, 애기장대 유래의 SGR2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키면 식물체에서 녹색 지속(stay-green) 형질이 나타나고 비생물적 스트레스에 대한 내성이 증가하므로, 식물체에서 SGR2 단백질 코딩 유전자의 발현 조절을 통해 비생물적 스트레스 저항성이 증가된 형질전환 식물체를 개발할 수 있다.

Description

AtSGR2 유전자를 이용한 비생물적 스트레스 내성이 증가된 녹색 지속 변이 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체{Method for producing stay-green transgenic plant with increased resistance to abiotic stresses using AtSGR2 gene and the plant thereof}

본 발명은 AtSGR2 유전자를 이용한 비생물적 스트레스 내성이 증가된 녹색 지속 변이 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 애기장대 유래 SGR2(STAY-GREEN 2) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물의 녹색 지속(stay-green) 형질을 유지하거나 또는 비생물적 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법, 상기 SGR2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 비생물적 스트레스 내성이 증가된 녹색 지속 변이 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 변이 식물체 및 이의 종자 및 상기 SGR2 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는, 식물의 녹색 지속 형질 유지 또는 비생물적 스트레스에 대한 내성 증가용 조성물에 관한 것이다.

노화과정 동안 식물체는 잎으로부터 가치있는 영양 성분들을 재사용하여, 다음 세대에 있어서 생존율을 극대화시킨다. 노화에 있어서, 다른 분해 과정들 중에서, 엽록소(chlorophyll)는 다단계의 이화작용 경로를 통해 무색의 분해 산물로 전환된다. 이 경로는 엽록체에 위치한 몇몇의 반응으로 구성되고, 이 반응들은 여섯 개의 알려진 엽록소 분해효소(CCE, Chlorophyll catabolic enzyme)와 금속 킬레이팅 물질(MCS, metal-chelating substance)을 필요로 한다. 게다가 STAY -GREEN1(SGR1) 유전자 또한 엽록소 분해의 중요한 조절자로 작용한다. SGR1 오솔로그(ortholog)의 돌연변이는 애기장대, 벼, 콩, 토마토, 피망, 및 대두와 같은 많은 식물체 종에서 녹색 지속(stay-green) 형질을 유발하였다. SGR1 단백질은 광계(photosystem) Ⅱ의 광수용 복합체(LHC, light-harvesting complex) 서브유닛과 특별히 반응하고, 다른 요소들과는 반응하지 않는다. 더욱이, 최근에 SGR1 단백질이 알려진 여섯 종의 모든 엽록소 분해효소와 물리적으로 반응하고, 자연적인 노화과정 동안 엽록소 해독을 위한 매우 고도로 역동적인 다중 단백질 구조를 형성하는 것이 확인되었다(Sakuraba et al., 2012, Plant Cell. 24:507-518; Sakuraba et al., 2013, Biochem. Biophys. Res. Commun. 430:32-37).

대부분의 고등 식물체는 두 개 또는 그 이상의 SGR1 유전자의 상동체를 가지고 있으며, 모두 엽록체 내에 존재하는 것으로 예상되며, 이는 색소체 내에서 그리고 엽록소 대사과정에 있어서 SGR1 유전자의 상동체들이 기능하는 것으로 사료되었다. 계통학적 분석을 통해 고등 식물체의 SGR 단백질 패밀리는 두 그룹으로 분류됨이 밝혀졌다. 첫 번째는 진짜 SGR 서브패밀리로 간주되는 그룹으로 녹색 지속 형질을 유발하는 돌연변이 멤버들을 포함한다. 두 번째 SGR 단백질 서브패밀리는 SGRL(SGR LIKE)로 일컬어지는 그룹으로, 다른 종류의 식물 종으로부터 고도로 보존된 멤버들을 포함한다. 최근에 벼 SGRL 유전자를 과발현하는 벼 형질전환 식물체가 암(dark)-유도 노화과정 동안에 잎의 이른 황화현상(yellowing)을 보였고, 이는 SGRL 단백질이 벼에서 SGR1 단백질과 같은 기능을 가지고 있음을 시사하였다.

애기장대 게놈은 세 종의 SGR 유전자 상동체 SGR1 / NYE1(At4g22920), SGR2 (At4g11910) 및 SGRL(At1g44000)을 포함하고 있으며, 지금까지 애기장대 SGR1/NYE1 단백질의 분자적, 생리학적 및 생화학적 기능이 잘 연구되어 있다. 벼 SGRL 단백질과 같이, 애기장대 SGRL 단백질 역시 비노화(presenescent) 잎에서 엽록소 분해 또는 엽록소 턴오버에 기여하는 것으로 보인다. 최근에, 대두에서 dld2 이중 돌연변이의 녹색 지속 형질이 D1 / SGR1과 D2 / SGR2의 무효(null) 돌연변이에 의한 것임이 보고되었고, 이는 그 두 개의 노화 유도 SGR 단백질인 D1과 D2가 잎 노화 동안에 엽록소 분해를 과다하게 촉진함을 시사했다. 하지만, 애기장대 sgr2 -1 녹아웃 돌연변이체는 잎 노화 동안에 녹색 지속 형질을 나타내지 않았다. 그래서, 노화하는 잎에서 엽록소 대사 동안에 애기장대 SGR2 단백질의 분자적, 생리학적 및 생화학적 기능은 불분명한 상태이다.

이에, 본 발명에서는 SGR2 유전자의 기능을 분석하기 위해 SGR2 유전자 과발현 및 녹아웃 돌연변이 식물체를 제조하여 다양한 노화 유도 조건에서의 변화를 관찰하고자 한다.

한편, 한국등록특허 제0647767호에는 '신규 녹색지속유전자 및 녹색지속성 변이 식물체의 제조 방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2011-0138290호에는 '생물적 및 비생물적 스트레스에 대한 증가된 저항성을 나타내는 유전자 도입 식물 및 이를 생산하는 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 AtSGR2 유전자를 이용한 비생물적 스트레스 내성이 증가된 녹색 지속 변이 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 애기장대 유래의 SGR2 단백질을 코딩하는 유전자를 식물체에 과발현시켜 형질전환 식물체의 잎이 다양한 스트레스 조건하에서 녹색 지속 형질을 나타내고, 염, 가뭄, 열 및 광 스트레스에 대한 내성이 야생형 식물체에 비해 증진된 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 애기장대 유래 SGR2(STAY-GREEN 2) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물의 녹색 지속(stay-green) 형질을 유지하거나 또는 비생물적 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

애기장대 유래 SGR2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 비생물적 스트레스 내성이 증가된 녹색 지속 변이 식물체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 비생물적 스트레스 내성이 증가된 녹색 지속 변이 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 상기 애기장대 유래 SGR2 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는, 식물의 녹색 지속(stay-green) 형질 유지 또는 비생물적 스트레스에 대한 내성 증가용 조성물을 제공한다.

본 발명의 애기장대 유래 SGR2 단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시키면 식물체에서 녹색 지속(stay-green) 형질이 나타나고, 비생물적 스트레스에 대한 내성이 증가하므로, SGR2 단백질 코딩 유전자의 발현 조절을 통해 비생물적 스트레스에 대한 저항성이 증가된 형질전환 식물체를 개발할 수 있으며, 작물의 상품성 및 생산성 증대에 기여할 수 있다.

도 1은 세 가지 애기장대 SGR 유사체의 발현양상을 발달 과정 동안 또는 암(dark) 유도 노화 조건에서 확인한 결과이다. DDI: 암(dark) 조건의 배양 일수.
도 2는 SGR 과발현 형질전환 식물체의 3주령 로제타 잎에서 SGR 유전자들의 발현 수준을 확인한 결과이다. -OX: 과발현(overexpression).
도 3은 두 종의 SGR 과발현 식물체의 표현형 특징을 분석한 결과로, (A)는 야생형과 과발현 식물체를 암 조건에서 배양하기 전(0 DDI)과 후(8 DDI)의 로제타 잎의 표현형을 비교한 사진이고, (B)는 총 엽록소의 수준 변화를 확인한 결과이며, (C)는 광합성 단백질들의 수준 변화를 면역블랏으로 확인한 결과이고, (D)는 야생형과 SGR2 과발현 식물체의 잎에서 광계Ⅱ의 광화학적 효율을 확인한 결과이며, (E)는 세포막 이온 누출 정도를 확인한 결과이다. CP43 및 D1, 광계Ⅱ 코어; Lhcb1, Lhcb2, Lhcb4 및 Lhcb5, 광계Ⅱ 안테나; Lhca1, 광계I 안테나; RbcL, 루비스코 큰 소단위체; CytF, 시토크롬 F; PAO, 페오포비드 A 옥시게나제(pheophorbide A oxygenase).
도 4는 SGR2 과발현 형질전환 식물체들의 암 처리 조건에서의 녹색 지속 표현형 특징을 확인한 사진이다.
도 5는 SGR2 과발현 형질전환 식물체의 메틸 자스모네이트(MeJA, methyl jasmonate) 처리에 의한 노화 유도 조건에서의 녹색 지속 표현형을 확인한 사진(A)과 총 엽록소 함량을 측정한 결과(B)이다.
도 6은 SGR1과 SGR2 유전자의 단일 및 이중 돌연변이 식물체에서 암 유도 노화 조건에 따른 표현형적 특징을 관찰한 사진(A)과 총 엽록소 함량을 측정한 결과(B)이다. nye1 -1; SGR1 돌연변이, sgr2 -1; SGR2 돌연변이, nye1 -1 sgr2 -1; SGR1 및 SGR2 돌연변이.
도 7은 염 스트레스 조건에서 SGR 과발현 식물체들의 잎 색 변화를 확인한 사진(A)과 총 엽록소 함량(B) 및 세포막 이온 누출(C)을 확인한 결과이다. WT; 야생형, S1-OX; SGR1 과발현, S2-OX; SGR2 과발현.
도 8은 염 스트레스 조건에서 SGR1과 SGR2 유전자의 단일 및 이중 돌연변이 식물체에서 표현형적 특징을 관찰한 사진(A)과 총 엽록소 함량을 측정한 결과(B)이다. DST; 염 처리 일수, WT; 야생형, nye1 -1; SGR1 돌연변이, sgr2 -1; SGR2 돌연변이, nye1 -1 sgr2 -1; SGR1 및 SGR2 돌연변이.
도 9는 가뭄 스트레스 조건에서 SGR 과발현 식물체들의 잎 색 변화를 확인한 사진(A 및 B)과 총 엽록소 함량(C)을 확인한 결과이다. WT; 야생형, S1-OX; SGR1 과발현, S2-OX; SGR2 과발현, HDT; 가뭄 처리 시간.
도 10은 열 스트레스 조건에서 SGR 과발현 식물체 및 돌연변이 식물체의 잎 색 변화를 확인한 사진(A)과 총 엽록소 함량(B)을 확인한 결과이다. WT; 야생형, S1-OX; SGR1 과발현, S2-OX; SGR2 과발현, nye1 -1; SGR1 돌연변이, sgr2 -1; SGR2 돌연변이.
도 11은 광(high light) 스트레스 조건에서 SGR 과발현 식물체들의 잎 색 변화를 확인한 사진(A)과 총 엽록소 함량(B)을 확인한 결과이다. WT; 야생형, S1-OX; SGR1 과발현, S2-OX; SGR2 과발현.
도 12는 암 유도 노화 동안에 SGR 과발현 식물체 및 돌연변이 식물체에서 엽록소 분해 효소인 NYC1과 PPH 유전자의 발현 수준의 변화를 확인한 결과이다. NYC1, non-yellow coloring1; PPH, pheophytinase; WT, 야생형; S1-OX, SGR1 과발현; S2-OX, SGR2 과발현; nye1 -1, SGR1 돌연변이; sgr2 -1, SGR2 돌연변이.
도 13은 SGR2 단백질의 틸라코이드 막에서 광계Ⅱ 광수용 복합체(LHCⅡ)와의 상호작용을 확인한 결과로, (A)는 SGR 단백질의 엽록체 위치를 확인하기 위한 형광 사진이고, (B)는 SGR-GFP 단백질의 분포를 확인한 면역블랏 결과이며, (C)는 LHCⅡ 소단위체들과 SGR2 단백질의 상호작용을 확인한 풀-다운(pull-down) 분석 결과이다. (A)의 bar 크기 50㎛.
도 14는 SGR1 단백질과 SGR2 단백질의 엽록소 분해 효소들과의 물리적 상호작용을 분석한 결과로, (A)는 SGR1 및 SGR2 단백질과 6종의 엽록소 분해 효소들과의 조합(pairwise) 상호작용을 효모 이중 혼성화 분석을 통해 확인한 결과이고, (B)는 노화된 엽록체에서 SGR 단백질들과 엽록소 분해 효소들간의 상호 면역침강(Co-IP) 분석 결과이며 (C)는 풀-다운 분석 결과이다.
도 15는 SGR1 단백질과 SGR2 단백질의 동형(homo) 또는 이형이합체(heterodimer) 형성을 분석한 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 SGR2(STAY-GREEN 2) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물의 녹색 지속(stay-green) 형질을 유지하거나 또는 비생물적 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 SGR2 단백질의 범위는 애기장대로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체의 녹색 지속성 형질을 유지하거나 또는 비생물적 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 활성을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 SGR2 단백질을 암호화하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 SGR2 단백질을 암호화하는 게놈 DNA 또는 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포(예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 튜메파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 녹색 지속(stay-green) 형질은 식물 노화의 전형적인 생리학적 변화는 보이지만 잎의 녹색은 유지하는 비기능성의 녹색 지속 형질이다.

또한, 본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 비생물적 스트레스는 염, 가뭄, 열 또는 광 등의 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은

애기장대 유래 SGR2(STAY-GREEN 2) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 비생물적 스트레스 내성이 증가된 녹색 지속 변이 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 SGR2 단백질의 범위는 전술한 바와 같다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 비생물적 스트레스는 염, 가뭄, 열 또는 광 등의 스트레스 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 비생물적 스트레스 내성이 증가된 녹색 지속 변이 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

상기 본 발명에 따른 방법이 적용될 수 있는 식물체로는 애기장대, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩 및 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 쌍자엽 식물이며, 더욱 바람직하게는 애기장대(Arabidopsis thaliana)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 SGR2(STAY-GREEN 2) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는, 식물의 녹색 지속(stay-green) 형질 유지 또는 비생물적 스트레스에 대한 내성 증가용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 SGR2 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하며, 상기 유전자를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 녹색 지속 형질을 유지하거나 또는 비생물적 스트레스에 대한 내성을 증가시킬 수 있는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 제한되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 식물 재료

애기장대 생태형 콜롬비아-0(Col-0)를 야생형으로 사용하였다. 애기장대에서 카복실 말단 에피토프 태깅을 위해 종결 코돈이 없는 SGR1 및 SGR2 유전자의 전체 길이 cDNA는 총 RNA를 주형으로 하고 AtSGR1 정방향 프라이머(5'-ATGTGTAGTTTGTCGGCGATTATG-3'; 서열번호 3) 및 AtSGR1 역방향 프라이머(5'-GAGTTTCTCCGGATTTGGAGTAG-3'; 서열번호 4), AtSGR2 정방향 프라이머(5'-ATGTGTAGTTTGGCTACAAATCTG-3'; 서열번호 5) 및 AtSGR2 역방향 프라이머(5'-TCCCTTTGATTTCCCAGGGTT-3'; 서열번호 6)를 이용하여 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 통해 증폭하였다. SGR1 및 SGR2 cDNA를 pCR8/GW/TOPO 게이트웨이 삽입 벡터(Invitrogen, 미국)로 삽입한 후에, 삽입체는 카복실 말단에 GFP, FLAG 및 TAP 태그를 도입하기 위해 각각 바이너리 게이트웨이 벡터인 pEarleyGate 103, 202 및 205로 재결합시켰다. 애기장대 형질전환 식물체는 상기 벡터들로 형질전환한 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 균주 GV3101을 이용한 꽃대 침지법(Clough and Bent, Plant J. 16: 735-743, 1998)을 통해 얻었다. 생체내(in vivo) 풀-다운(pull-down) 분석을 위한 음성 대조구로서, P35S : GFP를 가지고 있는 식물체를 사용하였다. T-DNA 삽입 유도 sgr2 -1 돌연변이 식물체(SALK_003830C)는 애기장대 생물자원센터(ABRC, 미국)로부터 구매하였으며, SGR1 단백질의 돌연변이 식물체로는 nye1 -1 돌연변이체를 사용하였다.

2. 성장 조건

애기장대 야생형 및 돌연변이 식물체는 토양에서 광도 90~100μmol m^-2 s^-1의 백색형광등 하의 22℃ 온도의 성장 챔버에서 장일 재배조건(14시간 낮 조건/10시간 밤 조건) 또는 단일 재배조건(10시간 낮 조건/14시간 밤 조건)으로 재배하였다. 3~4주 성장한 식물체의 녹색의 로제트(rosette) 잎을 떼어 암(dark) 유도 노화 및 비생물적 스트레스 처리를 위한 시료로 사용하였다. 떼어낸 잎은 첨가제가 들어간 3mM MES 버퍼(pH 5.8)에서 명(light) 또는 암(dark) 조건, 22℃ 온도 조건으로 배양하였다. 전체 식물체의 암 유도 노화 처리를 위해서는 3주 성장한 식물체 전체를 완전한 암 조건으로 옮겨 배양하고, 배양 후 어두운 녹색광 하에서 로제트 잎을 채취하였다.

3. 색소 분석

전체 엽록소는 차가운 아세톤을 사용하여 4℃에서 로제트 잎 조직으로부터 추출하였다. 상층액을 차가운 물을 사용해서 희석하여 최종 아세톤 농도가 80%가 되게 하였다. 엽록소의 농도는 이전의 보고에 사용된 방법을 이용하여 UV/VIS 분광광도계로 측정하였다(Lichtenthaler, Methods Enzymol. 148: 350-382, 1987).

4. 레이저 주사 공초점 현미경 관찰( Laser Scanning Confocal Microscopy )

GFP로 태깅된 벡터로 형질전환된 식물체의 시료에서 GFP의 발현 위치를 분석하기 위한 형광 이미지는 레이저 주사 공초점 현미경(LSM510, Zeiss, 독일)을 사용하였다. GFP 형광과 엽록소 자가형광은 각각 525nm와 660nm 파장에서 이미지를 촬영하였다.

5. 펄스진폭변조( PAM , Pulse Amplitude Modulation )을 이용한 광화학적 효율( Fv/Fm)의 측정

광계(photosystem) Ⅱ의 최대 광화학적 효율(Fv/Fm)을 PAM2000 형광계(Heinz Walz, 독일)를 사용하여 측정하였다. 로제타 잎을 5분간 암 순응시키고(dark-adapted), 20℃에서 Fv/Fm 비율을 측정하였다.

6. 이온 누출( Ion leakage ) 분석

이온 누출 분석은 선행 보고를 참조하여 실시하였다(Fan et al., Plant Cell 9: 2183-2196, 1997). 막 누출은 식물체에서 분리한 잎의 전해질 (또는 이온) 측정을 통해 분석하였다. 각각의 스트레스 처리된 10개의 잎들은 상온에서 6㎖의 0.4M 만니톨 용액에 넣은 후 3시간 동안 약하게 교반하면서 반응시켰고, 반응시킨 각각의 용액은 전도율 측정기(CON6 METER, LaMOTTE, 미국)를 이용해 전도율을 측정하였다. 전체 전도율은 각각의 샘플을 85℃에서 20분간 처리한 후 측정하였다. 이온 누출의 비율은 각 샘플에서 전체 전도율과 처리 후 전도율을 백분율로 표시하여 서로 비교하여 분석하였다.

7. 유전자 발현 분석

유전자 발현 수준은 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 및 정량적 실시간 중합효소연쇄반응(RT-qPCR) 분석을 통해 측정하였다. 잎으로부터 총 RNA를 추출하고, 역전사 반응을 위해서, 첫 번째 가닥 cDNA는 5㎍의 총 RNA, M-MLV 역전사 효소 및 올리고-dT 프라이머(Promega, 미국)를 사용하여 합성하였다. 합성된 cDNA는 물을 이용하여 5배 희석시키고 RT-qPCR을 위한 주형으로 사용하였다. RT-qPCR은 2㎕ cDNA, 10㎕ LightCycler 480 SYBR Green I Master(Roche, 스위스) 및 0.25μM 농도의 각 유전자에 대한 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 수행하였고, 각 유전자들의 상대적인 발현 수준은 GAPDH 유전자를 사용하여 표준화하였다. 본 발명에 사용된 프라이머의 목록은 하기 표 1과 같다.

유전자 명칭	정방향(5'→3')(서열번호)	역방향(5'→3')(서열번호)
SGR1	TGGGCAAATAGGCTATACCG (7)	CCACCGCTTATGTGACAATG (8)
SGR2	ATTGTTCCGGGACGAAGTAG (9)	CGCGATGAGATTCAAGAAGA (10)
SGRL	TTGCTGAGTGGAAGAAGGTG (11)	ACCTAAGCTCAGCAGCAACA(12)
NYC1	GTTAACAGACGCGATGGAGA (13)	GCCTGGAAAAGAGCTAGGTG (14)
NOL	TGCAGATGCAAGATGTCAAA (15)	TGGTGTAGGCTTTGATTCCA (16)
HCAR	CGGTACTCGTTGGACTACCAT (17)	CTATTTGGCCGTTTTTTGTTGT (18)
PPH	TCTCACGTATTGTGGAGGTCA (19)	ATAGCTCTCCACCAGGAGCA (20)
PAO	CTCTGGTTTGATCGGAATGAT (21)	GAAGCTCGTGCTGTTAAATCC (22)
PCCR	CGCCGAAAATTTATGGAGTT (23)	GAAGCTCGTGCTGTAAATCC (24)
ACT2	CTTCCGCTCTTTCTTTCCAA (25)	CATATGCATCCTTCTGGTTC (26)
GAPDH	TTGGTGACAACAGGTCAAGCA (27)	AAACTTGTCGCTCAATGCAATC (28)

8. 시험관내 ( in vitro ) 및 생체내 ( in vivo ) 풀-다운 분석

SGR 단백질 유사체와 엽록소 분해효소(CCE) 또는 광계 단백질들과의 상호 작용을 알아보기 위해, 총 잎 단백질들을 3주령 식물체(3DDI)로부터 추출하였고, 세포막-인리치드(enriched) 분획들은 Native Membrane Protein Extraction Kit(Calbiochem, 미국)를 사용하여 분리하였다. SGR1 단백질과 SGR2 단백질 사이의 상호 작용을 알아보기 위해서, 1주령의 백화(etiolated) 유묘로부터 단백질 추출 키트를 사용하여 총 단백질을 추출하였다. 그 후, 각 추출물을 이전에 보고된 방법(Sakuraba et al., 2012, Plant Cell. 24:507-518)에 따라 아가로스 비드 컨쥬게이팅 항-GFP 항체(MBL, 일본)를 사용하여 풀 다운시켰다. 아가로스 비드는 세척 버퍼(50mM Tris-HCl[pH 7.2], 200mM NaCl, 0.1% Nonidet P-40, 2mM EDTA 및 10% 글리세롤)을 사용하여 세 번 세척하였고, 세척된 비드는 20㎕의 샘플 버퍼와 함께 5분간 끊인 후, SDS-PAGE와 면역블랏 분석에 사용하였다.

9. SDS - PAGE 및 면역블랏 분석

단백질 추출 또는 공동-면역침강법의 분획은 샘플 버퍼(50mM Tris-HCl[pH 6.8], 2mM EDTA, 10%(w/v) 글리세롤, 2%(w/v) SDS 및 6%(v/v) 2-머캅토에탄올)에서 이루어졌고, 75℃에서 3분간 가열하여 변성화시킨 후 SDS-PAGE로 단백질을 분리하였다. 분리한 단백질은 Immunobilon-P 트랜스퍼 멤브레인(Millipore, 미국)으로 블랏팅하였고, 단백질 밴드, 겔 또는 멤브레인의 시각화를 위해 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue, Sigma-Aldrich, 미국) 염색을 하였다. 단백질 검출을 위해서 항 GFP 항체(Abcam, 미국), 항 FLAG 항체(Cell signaling, 미국), 항 NOL 항체 및 항 NYC1 항체(Sato et al., 2009, Plant J. 57:120-131), 항 RCCR 항체(Pruzinska et al., 2007, Plant Cell. 19:369-387), 항 PAO 항체 및 광계 단백질들(Lhcba1, Lhcb1, Lhcb2, Lhcb4, Lhcb5, CytF, CP43 및 D1)에 대한 항체들(Agrisera, 스웨덴)을 사용하였다. 이차 항체의 퍼록시다제(peroxidase) 활성은 WEST SAVE 화학 발광 검출 키트(AbFrontier, 한국)를 사용하여 확인하였다.

10. 효모 이중 혼성화( Yeast Two - Hybrid )

삽입 벡터 pCR8/GW/TOPO 벡터 내 SGR2 유전자의 전장 cDNA는 베이트(bait)로서 목적 벡터 pDEST32 내로 삽입되었다. SGR1과 CCEs의 베이트(pDEST32) 및 프레이(pDEST22) 벡터는 이전에 보고된 방법에 따라 준비하였다(Sakuraba et al., 2012b; Sakuraba et al., 2013). 효모 균주 Mav203을 베이트와 프레이 클론들의 공동 형질전환에 사용하였고, β-갈락토시다제 활성은 효모 프로토콜 핸드북(Clontech)에 따라 클로로페놀 레드-β-D-갈락토시드(CPRG, chlorophenol red-βD-galactoside, Roche, 스위스)를 사용하여 액상 분석을 통해 측정하였다.

11. 비생물적 스트레스 처리

염 스트레스의 분석은 이전에 기술된 방법(Wu et al., 2012, Plant Cell. 24:482-506)에 약간의 변형을 더하여 수행하였다. 염 스트레스 유도 엽록소 분해의 분석을 위해, 3주령 식물체로부터 떼어낸 로제타 잎들을 150mM 염화나트륨을 포함하고 있는 3mM MES 버퍼(pH 5.8)에 향축(adaxial)이 위로 오게 띄우거나 또는 토양에서 자란 3주령 식물체에 200mM 염화나트륨 용액을 공급하고, 지속적인 명(light) 조건(22℃, 90-100 μmol m^-2 s^-1)에서 3일(잎) 또는 6일(식물체)간 배양하였다. 열 스트레스 유도 엽록소 분해의 분석을 위해서, 2g/ℓ MS 배지(Sigma-aldrich, 미국)를 포함하는 3mM MES 버퍼(pH 5.8)에 띄어진 3주령 식물체를 45℃에서 4시간 배양하고 장일 조건(16시간 낮 조건/8시간 밤 조건) 하의 22℃ 조건에서 72시간 배양하였다. 가뭄 스트레스 유도 엽록소 분해의 분석을 위해서, 3주령 식물체를 버퍼가 없는 상태의 페트리 디쉬에서 23℃ 온도로 12시간 배양한 후, 지속적인 명 조건(22℃, 90-100 μmol m^-2 s^-1) 하에서 24시간 동안 물을 재공급하였다.

실시예 1. 애기장대에서 SGR 유사체의 발현 분석

애기장대에는 SGR1 / NYE1(At4g22920), SGR2(At4g11910) 및 SGRL(At1g44000)으로 일컬어지는 세 종류의 SGR 유사체가 존재한다. 본 발명에서는 애기장대 SGR 유사체의 발현 경향을 장일 조건에서와 암(dark) 유도 노화 조건에서 식물 발달 동안 확인하였다.

장일 조건에서는 SGR1과 SGR2의 발현이 자연적인 노화(약 발아 후 4주) 동안에 급증하였다(도 1A 및 B). 반면에 SGRL의 발현은 초기 영양단계에서는 증가하다가 발아 후 3주째에 최고치를 보이다가 그 후 감소하였다(도 1C). 유사한 발현 경향이 암 유도 노화 조건에서도 관찰되었는데, SGR1과 SGR2의 발현은 암 배양 3일째에 최고치를 보였고(도 1D 및 E), SGRL의 발현은 어둠 조건에서 급격하게 하향조절되었다(도 1F).

실시예 2. 암 유도 노화 동안 SGR2 과발현 식물체의 녹색 지속( stay - green ) 형질 분석

SGR2 유전자의 가능한 생리학적 기능을 찾기 위해서, 두 개의 SGR 유전자들에 대해서 카복실 말단에 TAP(Tandem affinity purification)를 태깅한 과발현 애기장대 식물체를 제작하였고, 각각을 SGR1-OX 및 SGR2-OX로 명명하였다. 각각의 형질전환 식물체에서 SGR 유전자들의 발현 수준을 역전사-정량적 실시간 중합효소 연쇄반응(RT-qPCR)을 이용하여 확인하였고, 가장 높은 발현 수준을 나타낸 SGR1-OX#4와 SGR2-OX#3 개체를 선발하였다. 선발된 식물체들은 장일 조건 하의 영양단계 동안에 어떠한 표현형도 나타내지 않았다(도 3A, 0 DDI). 그러나, 암(dark) 유도 노화 조건에서는 SGR2-OX 식물체의 로제타 잎은 강한 녹색 지속 형질을 보여주었고, SGR1-OX 식물체의 잎은 가속된 잎 황화 현상이 확인되었다(도 3A, 8 DDI). SGR2-OX 식물체의 녹색 지속 형질은 #3 개체 외 다른 독립적인 형질전환 개체들에서도 확인되었다(도 4). 암 유도 노화 동안에, 잎의 총 엽록소 양과 광계(photosystem)의 서브유닛들의 발현양이 야생형 식물체의 잎에 비해서 SGR2-OX 식물체의 잎에서 훨씬 높게 확인되었다(도 3B 및 C). 반면에 SGR1-OX 식물체에서는 야생형 식물체보다 감소된 수준으로 관찰되었다. SGR2-OX 식물체 잎의 녹색 지속 표현형은 자연 노화 동안에도 관찰되었으며, 메틸 자스모네이트(MeJA, methyl jasmonate) 처리에 의한 노화 유도에서도 관찰되었다(도 5).

녹색 지속성 형질을 나타내는 개체들은 그 성질에 따라 5가지 형태로 구분되는데(Thomas and Howarth, J. Exp. Bot., 51:329, 2000), A형 및 B형은 곡식이 여무는 동안 엽록소 함량과 광합성 효율이 모두 높게 유지되는 '기능성 녹색 지속(functional stay-green)' 형태이고, C형, D형 및 E형은 광합성 능력은 정상적으로 노화가 진행되었지만, 잎의 녹색은 유지되는 '비기능성 녹색 지속성(nonfunctional stay-green)' 또는 '표면적 녹색 지속성(cosmetic staygreen)' 형태이다.

SGR2-OX가 기능성(functional)의 녹색 지속 형태인지 또는 비기능성(nono-functional)의 녹색 지속 형태인지를 확인하기 위해서, 노화 관련 변화 외에 엽록소 파괴에 대해서 조사해보았다. 우선, 암(dark) 순응 잎에서 광계 Ⅱ의 최대 광화학적 효율(Fv/Fm)을 비교하였다. 자연 노화(발아 후 5~6주) 동안에, SGR2-OX 잎의 Fv/Fm 비율은 야생형 식물체의 잎에 비해 조금 낮게 확인되었다(도 3D). 또한, 암 유도 노화 동안에 잎의 이온 누출(ion leakage)을 측정하였는데, 야생형에 비해서 SGR2-OX 식물체의 잎에서 이온 누출이 보다 높은 수준으로 관찰되었다(도 3E). 이상의 결과를 통해 SGR2-OX 식물체는 전형적인 노화 변화는 보이지만 잎의 녹색을 유지하는 비기능성의 녹색 지속 형질임을 확인할 수 있었다.

실시예 3. 암 유도 노화 조건에서 SGR 돌연변이체의 표현형 분석

엽록소 분해에 미치는 두 SGR 유전자들의 영향을 분석하기 위해서, 암 유도 노화 조건에서 애기장대 nye1 -1 돌연변이체와 sgr2 -1 돌연변이체의 황화 속도를 비교하였다. nye1 -1 돌연변이체는 SGR1 유전자의 넌센스 돌연변이로서, 녹색 지속 형질을 보이는 것으로 이미 보고된 것이고(Ren et al., 2007, Plant Physiol. 144:1429-1441), sgr2 -1 돌연변이체는 SGR2 유전자 내에 T-DNA가 삽입된 돌연변이체이다(SALK_003830C). 과발현 식물체에서와 같이 두 sgr 유전자의 돌연변이체들은 영양단계 동안에는 어떠한 눈에 띄는 표현형은 관찰되지 않고 정상적으로 성장되었다(도 6A, 0 DDI). 하지만 6일 암 조건에서 배양 후에, sgr2 -1 돌연변이체는 과발현체 식물에서 나타난 결과와는 반대로 이른 잎 황화 현상을 나타내었다(도 6A, 6 DDI). 이러한 결과는 SGR1과 SGR2 단백질의 각각의 존재가 잎 노화 동안에 엽록소 분해에 직접적으로 영향을 미침을 나타냈다. 두 유전자의 돌연변이 형태인 nye1 -1 sgr2-1을 제작하여 잎의 녹색 지속성을 확인한 결과(도 6A 및 B), 애기장대 잎 노화에 있어서 SGR2 단백질은 주로 SGR1 단백질 활성을 완화시키는 기능이 있음을 확인하였다.

실시예 4. 비생물적 스트레스 유도 엽록소 분해에 있어서 SGR2 단백질의 역할

노화과정 외에도 다양한 비생물적 스트레스 조건에 의해서 엽록소의 분해가 유발된다. 비록 질병 유도 잎 백화(chlorosis) 현상에 SGR1 유전자의 관련이 보고된바 있지만, 여전히 비생물적 스트레스 유도 노화에 있어서 두 SGR 유전자들의 역할은 불분명하다. 이에 비생물적 스트레스 조건 하에서 두 SGR 유전자들의 역할을 알아보고자 다양한 실험을 수행하였다.

먼저, SGR1-OX 및 SGR2-OX 식물체의 염 스트레스 조건 하에서 잎 표현형을 조사하였다. 염 처리 6일 후에, SGR1-OX 식물체는 가속화된 잎 황화 표현형을 보여주었고(도 7A), 가시적인 현상과 일치하게, 총 엽록소 수준이 높은 이온 누출을 동반하며 극적으로 감소하였다(도 7B 및 C). 또한, 과발현 식물체 외 두 SGR 유전자들의 돌연변이 식물체의 염 스트레스 조건 하에서의 잎 표현형도 조사하였다. 염 처리 3일 후에, sgr2 -1 돌연변이체의 잎은 이른 황화 현상을 보인 반면, nye1 -1 돌연변이체의 잎은 높은 수준의 엽록소 함량과 함께 녹색 지속 표현형을 유지하였다(도 8). 이상의 결과를 통해, 암(dark) 유도 엽록소 분해 외에도 SGR2 단백질은 염(salt) 유도 엽록소 분해에도 개입함을 알 수 있었다.

추가로 염 스트레스 외에 가뭄, 열 및 광(high light) 등의 다른 종류의 비생물적 스트레스 조건하에서 SGR 유전자들의 과발현 식물체들에서 잎 표현형을 분석하였다. 그 결과, 상기와 같은 스트레스 조건하에서, SGR1-OX 식물체는 심각한 잎 황화현상을 보여주었고, SGR2-OX 식물체는 상기와 같은 스트레스 조건하에서도 일관되게 녹색 지속 표현형을 나타내었다(도 9, 10 및 11). 상기와 같은 결과를 통해, SGR2 단백질이 노화 유도 및 스트레스 유도 엽록소 분해의 조절에 음성적으로 관여하고 있음을 확인하였다.

실시예 5. SGR 과발현 돌연변이체에서 엽록소 분해 효소 유전자들의 발현 분석

SGR1과 SGR2의 유전자의 발현이 녹색 지속(stay-green) 형질을 유도하는 NYC1이나 PPH유전자의 발현에 어떠한 영향을 주는가를 확인하기 위해, 암 처리를 통해 유도된 노화시 각 SGR 유전자들의 과발현체와 돌연변이체에서 상기 NYC1이나 PPH유전자들의 발현 수준을 측정하였다. SGR2-OX와 nye1 -1 돌연변이체에서 NYC1과 PPH의 발현은 현저하게 낮아졌고, 빠른 노화를 보이는 SGR1-OX와 sgr2 -1 돌연변이체에서는 NYC1과 PPH의 발현이 증가하였다(도 12). 이를 통해, SGR1 단백질은 양성적으로, SGR2 단백질은 음성적으로 노화 유도 엽록소 분해 효소 유전자들(NYC1 및 PPH)의 발현에 영향을 주는 것으로 확인되었으며, 이상의 결과는 과발현체와 돌연변이체에서의 암 처리 유도 노화의 표현형 결과들과 일치하였다.

실시예 6. SGR2 단백질의 광계 Ⅱ 광수용 복합체( LHC Ⅱ)와의 결합 분석

이전의 보고에서 SGR1 단백질이 엽록체의 틸라코이드막(thylakoid membrane)에 위치하고, LHCⅡ와 상호결합한다는 것이 보고되었다(Sakuraba et al., 2012, Plant Cell. 24:507-518). ChloroP 1.1(http://www.cbsdtu.dk/services/ChloroP/)를 통해 예측되어진 SGR2 단백질의 엽록체 위치를 확인하기 위해서 P35S : SGR2 - GFP를 이용하여 애기장대 형질전환체를 제작하였다. 이 형질전환체 떡잎의 엽록체에서, GFP 형광신호는 엽록소의 자가형광(autofluorescence)과 겹치게 나타났다(도 13A). 또한, SGR2-GFP는 성숙한 잎으로부터 얻어낸 세포막-인리치드(enriched) 분획들에서 확인되었다(도 13B). 이것은 SGR1 및 SGR2 단백질 모두가 틸라코이드막에 위치함을 의미한다. SGR2 단백질과 LHCⅡ의 결합을 확인하기 위해, 생체내(in vivo ) 풀-다운 분석을 실시하였다. 그 결과 SGR1 및 SGR2 단백질은 LHCⅡ 서브유닛(Lhcb1, Lhcb2 및 Lhcb4)에서 함께 면역침강되었고, CP43 또는 Lhca1에서는 면역침강이 이루어지지 않았다(도 13C). 상기의 결과들을 통해서 SGR1 및 SGR2 단백질이 틸라코이드막에서 LHCⅡ와 결합한다는 것을 확인하였다.

실시예 7. SGR1 단백질과 SGR2 단백질의 엽록소 분해 효소들과의 결합력 분석

이전의 보고에서, SGR1 단백질이 6개의 엽록소 분해 효소(NOL, NYC1, HCAR, PPH, PAO 및 RCCR)들과 함께 직접적 혹은 간접적으로 LHCⅡ에 물리적인 결합을 한다는 것이 증명되었다. 다양한 노화 유도 조건에서, SGR2 과발현체와 돌연변이체들의 표현형은 SGR1 과발현체 및 돌연변이 식물체와는 반대되는 표현형을 보였기 때문에, 본 발명자들은 SGR2 단백질이 엽록소 분해 효소(CCE)와 결합하는 능력이 SGR1 단백질의 CCE와의 결합력과는 차이가 있을 것으로 가정하고, SGR2 단백질의 CCE와의 결합력을 분석하였다.

먼저, 두 개의 SGR 단백질과 엽록소 분해 효소들과의 결합을 효모 이중 혼성화(yeast two hybrid)를 통해 확인하였다. 그 결과, RCCR 단백질과의 결합을 제외하고 SGR2 단백질이 다른 종류의 엽록소 분해 효소들에 결합하는 능력은 SGR1 단백질과 비교하여 현저히 제한되어짐이 확인되었다(도 14A). 이러한 현상을 엽록소 분해 효소 항체를 이용한 생체내 풀-다운 분석(도 14B)과 GFP 또는 FLAG 태그된 형질전환 식물체를 이용한 생체내 풀-다운 분석을 통해 재확인하였다(도 14C). 이전 보고에서와 같이, 풀-다운 분석을 위한 잎 샘플은 3일간 암 처리하여 노화를 유도하였고, 세포막 인리치드 분획물은 항 GFP 항체가 부착되어진 비즈를 사용하였다. 상기의 풀-다운 분석의 결과는 효모 이중 혼성화의 결과와 일치하였다. 상기의 결과들을 토대로, 두 SGR 유전자의 과발현체 및 돌연변이체들의 뚜렷히 상반된 노화 표현형이 각 SGR 단백질들의 엽록소 분해 효소와의 결합능력의 차이와 연관이 있는 것으로 판단되었다.

실시예 8. SGR 단백질들 이합체 형성능 분석

두 SGR 단백질들은 서로 상당히 유사하고, 이전의 보고에서 두 개의 유사한 단백질의 여러 조합들은 몇몇 그들의 생리학적 기능들을 조절하기 위해 이형이합체(heterodimer)를 형성하는 것이 보고되어졌기 때문에(Seo et al., 2011, Nat Commun. 2:303; Seo et al., 2012, Plant Cell. 24:2427-2442), 우리는 두 SGR 단백질의 상호 결합 여부를 분석하였다.

효모 이중 혼성화 방법을 통해, 두 개의 SGR 단백질 사이의 결합에 대해 확인해보았다. 그 결과 각각의 SGR 단백질은 이형이합체를 형성하는 능력을 가질 뿐만 아니라 그 자신의 동형이합체(homodimer)를 만드는 능력을 있음이 확인되었다(도 15A). 이러한 결합능력은 카복시 말단 GFP 또는 FLAG 태깅된 SGR 형질전환 식물체를 이용하여 생체내 풀-다운 분석 방법을 통해 재확인하였다. 또한 LHCⅡ 서브유닛들을 통한 간접적인 결합의 가능성을 배제하기 위해, 일주일 동안 암 처리한 샘플(one-week-old etiolated seedling)을 사용하여 분석을 진행하였다. 효모 이중 혼성화 방법을 이용하여, SGR1-SGR1, SGR1-SGR2 및 SGR2-SGR2의 물리적 결합능력을 확인하였고(도 15B-D), 이러한 결과들을 통해 두 개의 SGR 단백질들이 서로 동형이합체 또는 이형이합체를 형성한다는 것이 확인되었다.

<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Method for producing stay-green transgenic plant with increased resistance to abiotic stresses using AtSGR2 gene and the plant thereof <130> PN14015 <160> 28 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 816 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 atgtgtagtt tggctacaaa tctgttacta ccatcgaaga tgaaaccagt ttttccagag 60 aaactgagca ctagctcact ctgtgtcacc actagaagat ctaagatgaa gaaccgatct 120 attgttcctg ttgcaagatt gtttggaccg gcgatttttg aagcctccaa attgaaagtg 180 ttattcttag gagttgatga gaagaagcat ccagcaaaac ttccaagaac ttacactctt 240 actcacagtg acataaccgc taaattaact ttagctatat ctcaatccat taataactct 300 cagttgcaag gatgggcaaa taaattgttc cgggacgaag tagtgggcga gtggaagaaa 360 gtgaaaggta aaatgtcgct tcatgttcat tgccacatta gcggaggcca cttcttcttg 420 aatctcatcg cgaagcttcg gtactacatc ttttgcaaag aattacctgt ggtactggaa 480 gcttttgccc atggagatga gtatttgtta aataatcacc ccgagctaca agaatctcct 540 gtttgggttt atttccattc caacatcccg gagtacaaca aggtcgaatg ttggggaccg 600 ctttgggagg ccatgtcgca gcaccagcac gacggaagga cccacaagaa gagtgaaact 660 ctaccggagc taccttgtcc tgatgagtgc aagtgttgct ttccgacggt tagcacgatt 720 ccgtggtctc atcgtcatta tcaacatacc gcagcggatg agaatgttgc ggatggcctg 780 ttggaaatac ctaaccctgg gaaatcaaag ggatag 816 <210> 2 <211> 271 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 Met Cys Ser Leu Ala Thr Asn Leu Leu Leu Pro Ser Lys Met Lys Pro 1 5 10 15 Val Phe Pro Glu Lys Leu Ser Thr Ser Ser Leu Cys Val Thr Thr Arg 20 25 30 Arg Ser Lys Met Lys Asn Arg Ser Ile Val Pro Val Ala Arg Leu Phe 35 40 45 Gly Pro Ala Ile Phe Glu Ala Ser Lys Leu Lys Val Leu Phe Leu Gly 50 55 60 Val Asp Glu Lys Lys His Pro Ala Lys Leu Pro Arg Thr Tyr Thr Leu 65 70 75 80 Thr His Ser Asp Ile Thr Ala Lys Leu Thr Leu Ala Ile Ser Gln Ser 85 90 95 Ile Asn Asn Ser Gln Leu Gln Gly Trp Ala Asn Lys Leu Phe Arg Asp 100 105 110 Glu Val Val Gly Glu Trp Lys Lys Val Lys Gly Lys Met Ser Leu His 115 120 125 Val His Cys His Ile Ser Gly Gly His Phe Phe Leu Asn Leu Ile Ala 130 135 140 Lys Leu Arg Tyr Tyr Ile Phe Cys Lys Glu Leu Pro Val Val Leu Glu 145 150 155 160 Ala Phe Ala His Gly Asp Glu Tyr Leu Leu Asn Asn His Pro Glu Leu 165 170 175 Gln Glu Ser Pro Val Trp Val Tyr Phe His Ser Asn Ile Pro Glu Tyr 180 185 190 Asn Lys Val Glu Cys Trp Gly Pro Leu Trp Glu Ala Met Ser Gln His 195 200 205 Gln His Asp Gly Arg Thr His Lys Lys Ser Glu Thr Leu Pro Glu Leu 210 215 220 Pro Cys Pro Asp Glu Cys Lys Cys Cys Phe Pro Thr Val Ser Thr Ile 225 230 235 240 Pro Trp Ser His Arg His Tyr Gln His Thr Ala Ala Asp Glu Asn Val 245 250 255 Ala Asp Gly Leu Leu Glu Ile Pro Asn Pro Gly Lys Ser Lys Gly 260 265 270 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 atgtgtagtt tgtcggcgat tatg 24 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gagtttctcc ggatttggag tag 23 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 atgtgtagtt tggctacaaa tctg 24 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tccctttgat ttcccagggt t 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tgggcaaata ggctataccg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ccaccgctta tgtgacaatg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 attgttccgg gacgaagtag 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 cgcgatgaga ttcaagaaga 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ttgctgagtg gaagaaggtg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 acctaagctc agcagcaaca 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gttaacagac gcgatggaga 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gcctggaaaa gagctaggtg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 tgcagatgca agatgtcaaa 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 tggtgtaggc tttgattcca 20 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 cggtactcgt tggactacca t 21 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 ctatttggcc gttttttgtt gt 22 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 tctcacgtat tgtggaggtc a 21 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 atagctctcc accaggagca 20 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 ctctggtttg atcggaatga t 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 gaagctcgtg ctgttaaatc c 21 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 cgccgaaaat ttatggagtt 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 gaagctcgtg ctgtaaatcc 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 cttccgctct ttctttccaa 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 catatgcatc cttctggttc 20 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 ttggtgacaa caggtcaagc a 21 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 aaacttgtcg ctcaatgcaa tc 22

Claims (10)

1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 SGR2(STAY-GREEN 2) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 SGR2 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 식물의 녹색 지속(stay-green) 형질을 유지하거나 또는 비생물적 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 비생물적 스트레스는 염, 가뭄, 열 또는 광 스트레스인 것을 특징으로 하는 식물의 녹색 지속 형질을 유지하거나 또는 비생물적 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법.
4. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 SGR2(STAY-GREEN 2) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 SGR2 유전자를 과발현시키는 단계; 및
   상기 SGR2 유전자가 과발현된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 비생물적 스트레스 내성이 증가된 녹색 지속 변이 식물체의 제조 방법.
5. 삭제
6. 제4항에 있어서, 상기 비생물적 스트레스는 염, 가뭄, 열 또는 광 스트레스인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제4항의 방법에 의해 제조된 비생물적 스트레스 내성이 증가된 녹색 지속 변이 식물체.
8. 제7항에 있어서, 상기 식물체는 쌍자엽 식물인 것을 특징으로 하는 변이 식물체.
9. 제7항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
10. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 SGR2(STAY-GREEN 2) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 SGR2 유전자 과발현용 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는, 식물의 녹색 지속(stay-green) 형질 유지 또는 비생물적 스트레스에 대한 내성 증가용 조성물.

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