ELEMENTOS DE REGULACION DE INFLORESCENCIA TEMPRANA PREFERIDA Y SUS USOS ANTECEDENTES DE LA INVENCION La expresión de secuencias de DNA aisladas en un huésped de planta es dependiente de la presencia de elementos de regulación operablemente enlazados que son funcionales dentro del huésped de planta. La elección de las secuencias de regulación determinará cuándo y dónde se expresa dentro del organismo la secuencia de DNA aislada. Donde se desea expresión continua por todas las células de una planta, se utilizan promotores constitutivos. En contraste, donde se desea la expresión de gen en respuesta a un estimulo, los promotores inducibles son los elementos de regulación de elección. Donde se desea la expresión en tejidos u órganos específicos, se usan promotores y/o terminadores preferidos del tejido. Es decir, estos elementos de regulación pueden inducir la expresión en tejidos u órganos específicos. Las secuencias de regulación adicionales corriente arriba y/o corriente abajo de las secuencias de núcleo pueden ser incluidas en casetes de expresión de vectores de transformación para originar niveles variables de expresión de secuencias de nucleótidos aisladas en una planta transgénica. Las plantas tienen dos modos de crecimiento básicos durante sus ciclos de vida crecimiento vegetativo y crecimiento de flor y semilla. El crecimiento vegetativo arriba de la tierra de la planta se desarrolla a partir del meristema apical. Este meristema vegetativo da origen a todas las hojas que son encontradas en la planta. La planta mantendrá su patrón de crecimiento vegetativo hasta que el meristema apical se somete a un cambio. Este cambio realmente altera la identidad del meristema desde un meristema vegetativo a un meristema de inflorescencia. El meristema de inflorescencia produce hojas pequeñas antes de que enseguida produzca meristemas florales. Este es el meristema floral del cual se desarrolla la flor. El meristema floral se somete a una serie de cambios de desarrollo que eventualmente dan origen a las cuatro estructuras básicas de la flor, sépalos, pétalos, estambres y carpelos. Cada una de estas estructuras es derivada secuencialmente de un verticilo que se desarrolla del meristema floral. El verticilo 1 es el primero que apar¼ce, y se desarrolla en los sépalos de la planta. El segundo verticilo se desarrolla en pétalos. El tercero y cuarto verticilo definen el estambre (órganos reproductores masculinos) y el carpelo (órganos reproductores femeninos), respectivamente. Desde una perspectiva genética, dos cambios fenotipicos que controlan el crecimiento vegetativo y floral son programados en la planta. El primer cambio genético involucra la conmutación del estado vegetativo al estado floral. Si este cambio genético no está funcionando de manera adecuada, entonces no ocurrirá la floración. El segundo evento genético sigue el cometido de la planta para formar flores. La observación de que los órganos de la planta se desarrollan de una manera secuencial sugiere que existe un mecanismo genético en el cual una serie de genes son secuencialmente activados y desactivados. Esta conmutación es necesaria para cada verticilo -para obtener su identidad única inal . Se han identificado una serie de mutantes de Arabidopsis en los cuales las flores normales son reemplazadas con estructuras que se asemejan a meristemas de inflorescencia y los retoños que normalmente se desarrollan a partir de éstos. Un mutante de tal clase es LEAFY. Este mutante no contiene ninguna de las flores normales. Más bien, las estructuras de flor temprana que se desarrollan aparecen como*',, retoños de inflorescencia, mientras que las flores tardías parcialmente se asemejan a flores normales. Estas últimas flores en desarrollo contienen estructuras similares a sépalos y carpelos; es decir carecen de pétalos y estambres. Esto sugiere que LEAFY tiene dos funciones, someter la planta al desarrollo de meristema floral y definir pétalos y estambres. Las flores de los mutantes APETALA1 no son alteradas tan dramáticamente como los mutantes LEAFY . Estos imitantes expresan un fenotipo de meristema de inflorescencia parcial donde los meristemas florales secundarios aparecen en la región de eje del sépalo. Pero cuando los mutantes APETALA! y LEAFY son combinados, las flores aparecen como un retoño de inflorescencia. El análogo de boca de dragón (snapdragon) al gen APETALA1, SQUAMOSA es mucho más severo, y las flores aparecen como retoños de inflorescencia. APETALA1 también afecta el desarrollo normal de los sépalos y pétalos. La clonación del gen de Arabidopsis involucrado en el cometido de la floración y los genes que controlan el desarrollo _ del órgano de flor se ha logrado ya sea mediante el sondeo heterólogo con genes de boca de dragón . o mediante la etiquetación de transposón. En general, el análisis de secuencia de esos genes sugiere que pueden ser clasificados como un gen que contiene el cuadro o caja MADS o un gen con otra estructura. ', Los genes del cuadro MADS desempeñan una función central en el desarrollo de flores en las plantas. El hecho de que los genes del cuadro MADS de boca de dragón se usaron como sondas heterólogas por si mismas es evidencia de que esta clase de genes es importante en otras especies. La evidencia adicional de su importancia se ha demostrado por el hecho de que las secuencias homologas se han encontrado en monocotiledóneas tal como el maíz.
El maíz es una especie de planta monocoti ledónea y pertenece a la familia de hierbas. Esto es inusual para una planta en floración ya que tiene inflorescencias unisexuales. La inflorescencia masculina (espiguilla) se desarrolla en una posición terminal, mientras que las inflorescencias femeninas (espigas) crecen en la axila de las hojas vegetativas. Las inflorescencias, como son típicas para las hierbas, están compuestas de espiguitas. En el caso del maíz tal espiguita contiene dos flósculos (la flor de hierba) encerrados por un par de brácteas (gluma interna y externa) . Cada flósculo o florecilla consiste de dos brácteas de encerramiento (lemma y pálea), dos lodículas (órganos similares a escamas, solamente prominentes en las flores masculinas) , tres estambres y un pistilo central que encierra un solo óvulo. La flor de hierba es suficientemente diferente de una flor de angiosperma típica. Esta última está compuesta de verticilos concéntricos de sépalos y pétalos que encierran verticilos de estambres y pistilos. Las homologías de los tejidos de flor de angiosperma a aquellos del flósculo de hierba se han debatido por más de 200 años. De acuerdo con la invención, se describen secuencias de regulación específicas del desarrollo que permiten la transcripción de genes durante el tiempo crítico del desarrollo de florescencia, tales como tejidos preferidos para los tejidos de floración temprana tales como los meristemas para manipular el tiempo de floración, iniciación de la flor y el desarrollo de meristema en plantas. El aislamiento y la caracterización de promotores y terminadores del desarrollo de flor temprana preferida que pueden servir como elementos de regulación para la expresión de secuencias de nucleótidos aisladas de interés en una manera de floración preferida son necesarios para mejorar las cualidades de floración en las plantas. BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION De acuerdo con la invención, se proporciona en la presente un elemento de regulación aislado del Maíz que comprende lo siguiente: un cuadro TATA y que es capaz de inducir la expresión similar a aquella del gen similar a API en células de plantas, particularmente células de plantas de maíz. El promotor se conoce como ZM-MADS PROl, también como ZAP (Zea mays APETALA) pero posteriormente en la presente será* referido como similar a AP-1. La invención también comprende construcciones de expresión que comprenden los elementos de regulación de la invención operablemente enlazados a las secuencias de DNA, vectores que incorporan las construcciones de expresión, células de plantas transformadas con estas construcciones y las plantas resultantes generadas a partir de las mismas. Los elementos de regulación de la invención proporcionan la expresión de secuencias operablemente enlazadas en tejidos involucrados en la floración en el maíz. BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es un análisis de Northern de la expresión de gen similar a AP-1 de maíz en' la planta de tipo silvestre ( 22), planta W22 introingresada con el cromosoma teosinte IL (TIL) , planta W22 introingresada con los cromosomas teosinte 1L y 3L (T1L3L) , heterocigoto (het) y Tbl/tbl-mum3 y homocigotos (tbl) tbl-mum3. Todos están en 22 anterior. La Figura 2 es un diagrama que muestra el plásmido PHP 18979 que comprende el elemento de regulación similar a AP-1 de la invención. La Figura 3 es la secuencia SEQ ID NO: 2 del plásmido PHP representado en la Figura 2. La Figura 4 es un diagrama que muestra la secuencia de promotor similar a API de la invención »'t La Figura 5 es la secuencia del promotor similar a
API en la Figura 4. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION El gen API regula las etapas especificas del desarrollo de floración en una gama de especies. De acuerdo con la invención, se proporcionan secuencias de nucleótidos que permiten la iniciación de transcripción en tejidos involucrados en el desarrollo de floración . temprana tal como el tejido de meristema, en un patrón de expresión similar a API. Las secuencias de la invención comprenden regiones de iniciación de transcripción asociadas temporalmente con el desarrollo de la flor y especialmente con los tejidos de desarrollo de la flor. Asi, .las composiciones de la presente invención comprenden secuencias de nucleótidos novedosas para elementos de regulación de plantas nativamente asociados con las secuencias de nucleótidos que codifican para el gen similar a API de maíz. Se proporciona un método para expresar una secuencia de nucleótidos aislada en una planta usando las secuencias de iniciación de transcripción descritas en la presente. El método comprende transformar una célula de planta con un vector de transformación que comprende una secuencia de nucleótidos aislada operablemente enlazada a una o más de las secuencias de regulación de la planta de la presente invención y regenerar una planta establemente transformada a partir de la célula de planta transformada. De esta manera, las secuencias de regulación son útiles para controlar ia expresión de productos endógenos asi como productos exógenos en una manera de desarrollo de flor preferida . Bajo la iniciación de transcripción, la regulación de la región específica del desarrollo de floración será una secuencia de interés, que proporcionará la modificación del fenotipo de la flor en desarrollo. Tal modificación incluye la modulación de la producción de un producto endógeno, en cuanto a la cantidad, distribución relativa, o similares o la producción de un producto de expresión exógeno para proporcionar una función novedosa o producto en la flor, la manipulación del tamaño de la flor, la manipulación del tiempo de floración, la duración de la floración y similares. Por "desarrollo de floración" se propone la expresión favorecida en los tejidos de florescencia recientemente en desarrollo incluyendo pero no limitados al tejido de meristema. Por "elemento de regulación" se proponen secuencias responsables para la expresión de tejido y temporal de la secuencia de codificación asociada incluyendo promotores, terminadores , aumentadores , intrones y similares. Por "terminador" se proponen secuencias que son necesarias para la terminación de la transcripción. Una regi¾n de regulación de DNA que ocasiona que la RNA polimerasa se desasocie del DNA, ocasionando la terminación de la transcripción. Por "promotor" se propone una región de regulación de DNA que usualmente comprende un cuadro TATA capaz de dirigir la RNA polimerasa II para iniciar la síntesis de RNA en el sitio de iniciación de transcripción apropiado para una secuencia de codificación particular. Un promotor adicionalmente puede comprender otras secuencias de reconocimiento generalmente ubicadas corriente arriba o 5' al cuadro TATA, referido como elementos promotores corriente arriba, que influyen en la proporción de iniciación de transcripción. Se reconoce que habiendo identificado las secuencias de nucleótidos para la región de promotor descrito en la presente, está dentro del estado de la técnica aislar e identificar elementos de regulación adicionales en la región no traducida 5' corriente arriba de la región de promotor particular identificada en la presente. Asi la región de promotor descrita en la presente es generalmente además definida al comprender elementos de regulación corriente arriba tales como aquellos responsables para la expresión de tejido y temporal de la secuencia de codificación, aumentadores y similares. De la misma manera, los elementos promotores que permiten la expresión en el tejido deseado tal como la espiga pueden ser identi-ficados, aislados y utilizados con otros promotores de núcleo para confirmar la expresión de espiga temprana y el desarrollo de floración preferida. Las secuencias de promotor aisladas de la presente invención se pueden modificar para proporcionar una gama de niveles de expresión de la secuencia de nucleótidos aislada. Menos de la región de promotor completa puede ser utilizada y la habilidad para inducir la expresión de desarrollo de floración preferida, retenida. Sin embargo, se reconoce que los niveles de expresión de mRNA pueden ser disminuidos con supresiones de porciones de la secuencia de promotor. Asi, el promotor puede ser modificado para ser un promotor débil o fuerte. Generalmente, por "promotor débil" se propone un promotor que induce la expresión de una secuencia de codificación a un bajo nivel. Por "bajo nivel" se proponen niveles de aproximadamente 1/10,000 transcripciones a aproximadamente 1/100,000 transcripciones a aproximadamente 1/500,000 transcripciones. A la inversa, un' promotor fuerte induce la expresión de una secuencia de codificación a un alto nivel, o aproximadamente 1/10 transcripciones a aproximadamente 1/100 transcripciones a aproximadamente 1/1,000 transcripciones. Generalmente, por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos de una secuencia de promotor aislada serán usados para inducir la expresión de una secuencia de nucleótidos. <¦·, Se reconoce que para incrementar los niveles de transcripción, se pueden utilizar aumentadores en combinación con las regiones de promotor de la invención. Los aumentadores son secuencias de nucleótidos que actúan para incrementar la expresión de una región de promotor. Los aumentadores son conocidos en la técnica e incluyen la región de aumentador SV40, el elemento aumentador 35S, y similares. Los promotores de la presente invención pueden ser aislados a partir de la región no traducida 5' que flanquea su sitio de iniciación de transcripción respectivo. Del mismo modo, el terminador puede ser aislado de la región no traducida 3' que flanquea su codón de detención respectivo. El término "aislado" se refiere al material, tal como el ácido nucleico o proteina, que está: (1) sustancialmente o esencialmente libre de componentes que normalmente acompañan o interactúan con el material como es encontrado en su ambiente en que ocurre de manera natural o (2) si el material está en su medio ambiente natural, el material ha sido alterado mediante la intervención humana deliberada a una composición y/o colocado en un sitio en una célula diferente del sitio nativo al material. Los métodos para el aislamiento de regiones de promotor son bien conocidos en la técnica. Un método es descrito en la solicitud de patente norteamericana No. de serie 06/098, 690 presentada el 31 de agosto de 1998, incorporada en la presente por referencia. Las secuencias paradla región de promotor se exponen en la SEQ ID NO:l. El promotor similar a Api expuesto en la SEQ ID NO:l es de 2287 nucleótidos en longitud. Las regiones de promotor de la invención pueden ser aisladas de cualquier planta, incluyendo, pero no limitadas a maíz {Zea mays) , cánola {Brassica napus, Brassica rapa ssp.)r alfalfa [Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeno {Sécale cereale) , sorgo {Sorghum bicolor, Sorghum vulgare) , girasol (Helianthus annuus) , trigo {Triticum aestivum) , soya (Glicine mas.), tabaco (Nicotiana tacabum) , papa (Solanum tube osum) , cacahuate (Arachis hipogaea) , algodón (Gossypium hirsutum) , camote ( Ipomoea batatus) , mandioca (Manihot esculenta) , café (Cofea spp) , coco- (Cocos nucífera) , piña (Ananas comosus) , árboles cítricos (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), té (Camellia sinensis) , plátano (Musa spp.), aguacate (Persea americana) , higo (Ficus casica) , guayaba (Psidium guajava) , mango (Mangifera indica), olivo (Olea europaea) , avena, cebada, vegetales, plantas ornamentales y coniferas. De preferencia, las plantas incluyen maíz, soya, girasol, cártamo, cánola, trigo, cebada, centeno, alfalfa y sorgo. Las secuencias de promotor de otras plantas pueden ser aisladas de acuerdo con técnicas bien conocidas, basadas en su homología de secuencia a las secuencias de promotor expuestas en la presente. En estas técnicas, toda o parte de la secuencia de promotor conocida se utiliza como una sonda que selectivamente híbrida a otras secuencias presentes en una población de fragmentos de DNA genómicos clonados (es decir, bibliotecas genómicas) a partir de un organismo elegido. Los métodos son fácilmente disponibles en la técnica para la hibridación de secuencias de ácido nucleico. La secuencia de promotor completa o porciones de la misma se pueden usar como una sonda capaz de hibridar específicamente las secuencias de promotor correspondientes. Para obtener la hibridación específica bajo una variedad de condiciones, tales sondas incluyen secuencias que son únicas y de preferencia son de por lo menos aproximadamente 10 nucleótidos en longitud, y mucho más de preferencia por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos en longitud. Tales sondas se pueden usar para amplificar secuencias de promotor correspondientes a partir de un organismo elegido mediante el proceso bien conocido de reacción en cadena de polimerasa (PCR) . Esta técnica se puede utilizar para aislar secuencias de promotor adicionales a partir de un organismo deseado o como un ensayo de diagnóstico para determinar la presencia de la secuencia de promotor en un organismo. Ejemplos incluyen la clasificación de hibridación de bibliotecas de DNñ en placas (ya sea placas o colonias; ver, por ejemplo Innis y colaboradores (1990) PCR Protocols , A Guide to Methods and Applications, eds . , Academic Press) . . Los términos "condiciones severas" o "condiciones de hibridación severas" incluyen la referencia a condiciones bajo las cuales una sonda hibridará su secuencia objetivo, a un grado detectablemente más grande que otras secuencias (por ejemplo, por lo menos 2 veces sobre el antecedente) . Las condiciones severas son dependientes de la secuencia objetivo y diferirán dependiendo de la estructura del polinucleótido . Al controlar la severidad de la hibridación y/o las condiciones de lavado, se pueden identificar secuencias objetivo que son 100% complementarias a .una sonda (sondeo homólogo) . Alternativamente, las condiciones de severidad se pueden ajustar para permitir algo de desigualación en las secuencias de modo que grados menores de similitud son detectados (sondeo heterólogo) . Generalmente, las sondas de este tipo están en una gama de aproximadamente 250 nucleótidos en longitud a aproximadamente 1,000 nucleótidos en longitud. Una guia extensiva para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hibridization with Nucleic Acid Probes, Part. I, Chapter 2 "Overview of principies of hibridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York (1993); y Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel y colaboradores, Eds . Greene Publishing and iley-Interscience , N-ew York (1995) . Ver también Sambrook y colaboradores (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). En general, las secuencias que corresponden a la secuencia de promotor de la presente invención e hibridan a la secuencia de promotor descrita en la presente serán por lo menos 50% homologas, 55% homologas, 60% homologas, 65% homologas, 70% homologas, 75% homologas, 80% homologas, 85% homologas, 90% homologas, 95% homologas y aun 98% homologas o mayor con la secuencia descrita. La especificidad es típicamente la función de los lavados de post-hibridación, los factores críticos que son la resistencia iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Generalmente, las condiciones de temperatura de lavado severo se seleccionan para ser de aproximadamente 5°C a aproximadamente 2°C menor que el punto de fusión (Tra) para la secuencia específica a una resistencia iónica y pH definidos. El punto de fusión, o desnaturalización, del DNA ocurre sobre una gama de temperatura reducida y representa la interrupción de la hélice doble en sus hebras individuales complementarias. El proceso es descrito por la temperatura del punto medio de transición, Tjn, que también es llamada la temperatura de fusión. Fórmulas están disponibles en la técnica para la determinación de temperaturas de fusión. Las condiciones de hibridación para las secuencias de p-romotor de la invención incluyen la hibridación a 42 °C en formamida al 50% (p/v) , 6X SSC, SDS al 0.5% (p/v) , 100 mg/ml de DNA de esperma de salmón. Las condiciones de lavado de baja severidad ejemplares incluyen la hibridación a 42°C en una solución de 2X SSC, SDS al 0.5% (p/v) durante 30 minutos y la repetición. Las condiciones de severidad moderadas ejemplares incluyen un lavado en 2X SSC, SDS al 0.5% (p/v) a 50 °C durante 30 minutos y la repetición. Las condiciones de alta severidad ejemplares incluyen un lavado en 2X SSC, SDS al 0.5% (p/v) a 65°C durante 30 minutos y la repetición. Las secuencias que corresponden al promotor en la presente invención se pueden obtener usando todas las condiciones anteriores . Los siguientes términos se utilizan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más ácidos nucleicos o pol inucleótidos : (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación", (c) "porcentaje de identidad de secuencia" e (d) "identidad sustancial". Como se utiliza en la presente, "secuencia de referencia" es una secuencia definida utilizada como una base para la comparación de secuencia. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia especificada; por ejemplo, como un segmento de una secuencia de promotor de longitud completa, o la secuencia de promotor completa . i; (b) Como se utiliza en la presente, "ventana de comparación" hace referencia a un segmento contiguo y especificado de una secuencia de polinucleótido, en donde la secuencia de polinucleótido puede ser comparada a una secuencia de referencia y en donde la porción de la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, espacios) comparada con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. Generalmente, la ventana de comparación es de por lo menos 20 nucleótidos contiguos en longitud y opcionalmente puede ser de 30, 40, 50, 100 o más nucleótidos contiguos en longitud. Aquellos expertos en la técnica entenderán que para evitar una alta similitud de una secuencia de referencia debido a la inclusión de espacios en la secuencia de polinucleótidos , una sanción de espacio es típicamente introducida y es sustraída del, número de igualaciones. (c) Como se utiliza en la presente, "porcentaje de identidad de secuencia" significa el valor determinado al comparar dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, espacios) como es comparado con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje es calculado al determinar el número de posiciones en la cual la base de ácido nucleico idéntica ocurre en ambas secuencias para producir el número de posiciones igualadas, al dividir el número de posiciones igualadas entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y al multiplicar el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia. (d) El término "identidad sustancial" de la secuencia de polinucleótido significa que un polinucleótido comprende una secuencia que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia, de preferencia por lo menos 80%, más de preferencia por lo menos 90% y mucho más de preferencia por lo menos 95%, comparado con una secuencia de referencia usando uno de los problemas de alineación descritos usando parámetros estándares. Los métodos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. Las comparaciones de genes se pueden determinar al conducir búsquedas de BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul, S.F., y colaboradores (1993) J. Mol. Biol. 215:403-410; ver también www . ncbi . nlm . nih . gov/BLAST) bajo parámetros de error para la identidad a secuencias contenidas en la base de datos BLAST "GENE BL". Una secuencia se puede analizar para la identidad con las secuencias con DNA públicamente disponibles contenidas en la base de datos GENEMBL usando el algoritmo BLASTN bajo los parámetros de error. La identidad de la secuencia de la presente invención significará una secuencia de polinucleótido que tiene por lo menos 55% de identidad de secuencia, más de preferencia por lo menos 70% de identidad de secuencia, más de preferencia por lo menos 75% de identidad de secuencia, más de preferencia por lo menos 80% de identidad, más de preferencia, por lo menos 85% de identidad de secuencia, más de preferencia por lo menos 90% de identidad de secuencia, en donde el por ciento de identidad de secuencia está basado en la región de promotor completa . GAP usa el algoritmo de Needleman y unsch (J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970) para encontrar la alineación de dos secuencias completas que maximiza el número de igualaciones y minimiza el número de espacios. GAP considera todas las alineaciones posibles y las posiciones de espacio y crea la alineación con el número más grande de bases igualadas y los menores espacios. Esto permite la provisión de una sanción de creación de espacio y una sanción de extensión de espacio en unidades de bases igualadas. GAP debe hacer un aprovechamiento del número de sanción de creación de espacio de las igualaciones para cada espacio que este inserta. Si una sanción de extensión de espacio mayor que 0 es elegida, GAP, además, debe hacer un aprovechamiento para cada espacio insertado de la longitud de los tiempos de espacio de la sanción de extensión de espacio. Los valores de sanción de creación de espacio de error y los valores de sanción de extensión de espacio en la versión 10 del Paquete de Software de Wisconsin Genetics para las secuencias de proteínas son 8 y 2, respectivamente. Para secuencias de nucleótidos la sanción de creación de espacio de error es de 50 mientras que la sanción de extensión de espacio de error es de 3. Las sanciones de creación de espacio y de extensión de espacio se pueden expresar como un número entero seleccionado dei grupo de números enteros que consisten de 0 a 200. Asi, por ejemplo, la sanciones de creación de espacio y la extensión de espacio pueden ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o más grandes. GAP presenta un miembro de la familia de mejores alineaciones. Pueden existir muchos miembros de esta familia, pero ningún otro miembro tiene una mejor calidad. GAP muestra cuatro figuras de mérito para las alineaciones: Calidad, Relación, Identidad y Similitud. La calidad es la métrica maximizada para alinear las secuencias. La relación es la calidad dividida entre el número de bases en el segmento más corto. El por ciento de identidad es el por ciento de los símbolos que realmente se igualan. El por ciento de similitud es el por ciento de los símbolos que son similares. Los símbolos que están a través de los espacios son ignorados. Una similitud es clasificada cuando el valor de matriz de registro para un par de símbolos es mayor que o igual a 0.50, el umbral de similitud. La matriz de registro usada en la Versión 10 del Paquete de Software isconsin Genetics es BLOSUM62 (ver Henlkoff & Henikoff (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 10915) . Los fragmentos de secuencia con alto por ciento de identidad a las secuencias de la presente invención también se refieren a aquellos fragmentos de una secuencia de nucleótidos de elementos de regulación particular, descrita en la presente que opera para promover la expresión de espiga inmadura (floración temprana) -preferida de una secuencia de nucleótidos aislada operablemente enlazada. Estos fragmentos comprenderán por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos contiguos, de preferencia por lo menos -aproximadamente 50 nucleótidos contiguos, más de preferencia por lo menos aproximadamente 25 nucleótidos contiguos, aún más de preferencia por lo menos aproximadamente 100 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos de promotor particular descrito en la presente. Los nucleótidos de tales fragmentos usualmente comprenderán la secuencia al reconocimiento TATA de la secuencia de promotor particular. Tales fragmentos se pueden obtener mediante el uso de enzimas de restricción para segmentar las secuencias de nucleótidos del elemento regulador que surge de manera natural, descritas en la presente; al sintetizar una secuencia de nucleótidos de la ' secuencia de DNA que surge de manera natural; o se puede obtener a través del uso de la tecnología de PCR. Ver particularmente. Mullís y colaboradores (1987) Methods Enzymol. 155:335-350, y Erlich ed. (1989) PCR Technology (Stockton Press, New York) . Nuevamente, las variantes de estos fragmentos, tales como aquellas que resultan de la mutagénesis dirigida al sitio, están comprendidas por las composiciones de la presente invención.
Las secuencias de nucleótidos que comprenden por lo menos aproximadamente 20 secuencias contiguas de la secuencia expuesta en la SEQ ID NOS : 1 o 2 están comprendidas. Estas secuencias pueden ser aisladas mediante hibridación, PCR y similares. Tales secuencias comprenden fragmentos capaces de inducir la expresión de espiga inmadura (floración temprana) -preferida, fragmentos útiles como sondas para identificar secuencias similares asi como elementos responsables para la especificidad temporal o de tejido. Las variantes biológicamente activas de las secuencias de regulación también están comprendidas por las composiciones de la presente invención. Una "variante" de regulación es una forma modificada de una secuencia de regulación en donde una o más bases se han modificado, removido o adicionado. Por ejemplo, una manera rutinaria para remover parte de una secuencia de DNA es usar una exonucleasa en combinación con la amplificación de DNA para producir supresiones ensambladas unidireccionales de clones de DNA de doble hebra. Un kit comercial para este propósito es vendido bajo el nombre comercial Exo-SizeMR (New England Biolabs, Beverly, Mass) . Brevemente, este procedimiento ocasiona incubar la exonucleasa III con DNA para remover progresivamente los nucleótidos en la dirección 3' a 5' en las pendientes 5' , los extremos despuntados o muescas en el patrón de DNA. Sin embargo, la exonucleasa III es incapaz de remover los nucleótidos en 3' , pendientes de cuatro bases. Las digestiones sincronizadas de un clon con esta enzima, producen supresiones empalmadas unidireccionales. Un ejemplo de una variante de secuencia de regulación es un promotor formado por una o más supresiones de un promotor más grande. La porción 5' del promotor hasta el cuadro TATA se cerca del sitio de inicio de transcripción puede ser suprimida sin suprimir la actividad del promotor, como es descrito por Zhu y colaboradores, The Plant Cell 7:1681-89 (1995). Tales variantes deben retener la actividad del promotor, particularmente la habilidad para inducir la expresión en la espiga inmadura (floración temprana) u otros tejidos de tal clase. Las variantes biológicamente activas incluyen, por ejemplo, las secuencias de regulación nativas de la invención que tienen una o más sustituciones, supresiones o inserciones de nucleótidos. La actividad puede ser medida mediante el análisis de manchado de Northern, las mediciones de actividad del reportador cuando se usan fusiones de transcripción, y similares. Ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed. Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.), incorporada en la presente por referencia . Las secuencias de nucleótidos para los elementos de regulación de la espiga inmadura (floración temprana)-la espiga de maíz en desarrollo. Estas modificaciones dan por resultado un cambio en el fenotipo de la planta transformada. Se reconoce que los elementos de regulación pueden ser utilizados con sus secuencias de codificación nativas para incrementar o disminuir la expresión que resulte en un cambio de fenotipo en la planta transformada. En otra modalidad, los elementos de regulación de la invención se pueden utilizar para la expresión preferida del callo de los marcadores seleccionables . Por ejemplo, los elementos de regulación tal como el promotor y terminador Lecl permitirían a las plantas á ser regeneradas que no tienen resistencia en campo al herbicida pero pueden ser susceptibles al herbicida en la etapa de callo. Categorías generales de genes de interés para los propósitos de la presente invención incluyen, por ejemplo, aquellos genes involucrados en la información tales como los dedos de Zinc; aquellos involucrados en la comunicación, tales como quinasas; y aquellos involucrados en el manejo, tales como las proteínas de choque térmico. Categorías más específicas de transgenes incluyen genes que codifican cualidades importantes para la agronomía, resistencia a los insectos, resistencia a las enfermedades, resistencia a los herbicidas y características del grano, todavía otras categorías de transgenes incluyen genes para inducir la expresión de productos exógenos tales como enzimas, cofactores de hormonas de las plantas y otras eucariotas y como organismos procarióticos . Se reconoce que cualquier gen de interés, incluyendo la secuencia de codificación nativa, puede ser operablemente enlazado a los elementos de regulación de la invención expresado en el tejido de la espiga de maíz en desarrollo. Los productos exógenos incluyen enzimas y productos de plantas asi como aquellos de otras fuentes incluyendo procariotas y otras eucariotas. Tales productos incluyen enzimas, cofactores, hormonas y similares. La secuencia de nucleótidos operablemente enlazada a los elementos de regulación descritos en la presente, puede ser una secuencia antisentido para un gen dirigido. Por "secuencia de nucleótidos de DNA antisentido" se propone una secuencia que esté en orientación inversa a la orientación normal 5' a 3' de esa secuencia de nucleótidos. Cuando se suministra en una célula de planta, la expresión de la secuencia de DNA antisentido previene la expresión normal de la secuencia de nucleótidos de DNA para el gen dirigido. La secuencia de nucleótidos antisentido codifica una transcripción de RNA que es complementaria y capaz de hibridar con el RNA mensajero endógeno (mRNA) producido por la transcripción de la secuencia de nucleótidos de DNA para el gen dirigido. En este caso, la producción de la proteina nativa, codificada por el gen dirigido es inhibida para alcanzar una respuesta fenotípica deseada. Asi, las secuencias de regulación descritas en la presente pueden ser operablemente enlazadas a las secuencias de DNA antisentido para reducir o inhibir la expresión de una proteína nativa en una espiga de planta o para regular el desarrollo si es la espiga o flor. El cásete de expresión también incluirá el 3' terminal de la secuencia de nucleótidos aislada de interés, una región de terminación de . transcripción y de traducción funcional en las plantas. La región de terminación puede ser nativa con la secuencia de nucleótidos de promotor de la presente invención puede ser, nativa con la secuencia de DNA de interés, o puede ser derivada de otra fuente. Las regiones de terminación convenientes están disponibles del plásmido Ti de A. tumefaciens tales como las regiones de terminación de octopina sintasa y nopalina sintasa. Ver también: Guerineau y colaboradores (1991) Mol. Gen.y^Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon y colaboradores (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen y colaboradores (1990) Plant Cell 2:1261.1272; Munroe y colaboradores (1990= Gene 81:151-158; Bailas y colaboradores (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; Joshi y colaboradores (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639. Los casetes de expresión adicionalmente pueden contener secuencias guías 5' . Tales secuencias guías pueden actuar para aumentar la transducció . Las guias de transducción . Son conocidas en la técnica e incluyen: guias de picornavirus, por ejemplo: guias de EMCV (región de no codificación 5' de Encephalomiocarditis ) , Elroy-Stein y colaboradores (1989) Proc . Wat. Acad. Sci. USA 86:6126-6130; guias de potivirus, por ejemplo, guia TEV (Virus de Grabado de Tabaco), Allison y colaboradores (1986); guia MDMV (Virus de Mosaico de í»3aíz) , Virology 154:9-20; proteína de enlace de cadena pesada inmunoglobulina humana (Bip) , acejak y colaboradores (1991) Nature 353:90-94; guía no traducida del mRNA de la proteína de recubrimiento del virus de mosaico de alfalfa (AMV RNA 4), Jobling y colaboradores (1987) Nature 325:622-6259, guía de virus de mosaico de tabaco (TMV) , Gallie y colaboradores (1989) Molecular Biology of RNA, página 237-256; guía de virus moteado clorótico del maíz (MCMV) Lommel y colaboradores (1991) Virology 81:382-385. Vertambién Della-Cioppa y colaboradores (1987) Plant Phy iology 84:965-968. El cásete también puede contener secuencias que aumentan la traducción y/o estabilidad de mRNA tales como intrones. En aquellos casos donde es deseable tener el producto expresado de la secuencia de nucleótidos aislada dirigida a un organelo particular, particularmente la plástida, amiloplasto, o el retículo endoplásmico, o secretado en la superficie de la célula o extracelularmente, y el cásete de expresión además puede comprender una secuencia de codificación para un péptido de tránsito. Tales péptidos de tránsito son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no están limitados al: péptido de tránsito para la proteina portadora de acilo, la subunidad pequeña de RUBISCO, EPSP sintasa de planta y similares. En la preparación del cásete de expresión, los diversos fragmentos de DNA pueden ser manipulados, para proporcionar las secuencias de DNA en la orientación apropiada y, como es apropiado, en la estructura de lectura apropiada. Con este fin, adaptadores o enlazadores pueden ser empleados para unir los fragmentos de DNA u otras manipulaciones pueden ser involucradas para proporcionar sitios de restricción convenientes, remoción de DNA superfiuo, remoción de sitios de restricción o similares. Para este propósito, la mutagénesis in vitro, reparación de cebador, digestiones de restricción, recocido y resu¾tituciones tales como transiciones y transversiones, pueden estar involucrados. Como es mencionado en la presente, la presente invención proporciona vectores capaces de expresar genes de interés bajo el control de los elementos de regulación. En general, los vectores deben ser funcionales en células de plantas. A veces, puede ser preferible tener vectores que son funcionales en E. coli (por ejemplo, producción de proteina para resaltar anticuerpos, análisis de secuencia de DNA, construcción de insertos, obtención de cantidades de ácidos nucleicos) . Los vectores y procedimientos para la clonación y expresión en E. coli son discutidos en Sambrook y colaboradores (supra). El vector de transformación que comprende las secuencias de regulación de la presente invención operablemente enlazadas a una secuencia de nucleótidos aislada en un cásete de expresión, también pueden contener por lo menos una secuencia de nucleótidos adicional para un gen que es cotransformado en el organismo. Alternativamente, la(s) secuencia (s) adicional (es ) se puede proporcionar en otro vector de transformación. Los vectores que son funcionales en plantas pueden ser plásmidos binarios derivados de Agrobacterium. Tales vectores son capaces de transformar células de plantas. Estos vectores contienen secuencias de limite izquierda y de-recha que ison requeridos para la integración en el cromosoma del huésped (planta) . En lo mínimo, entre otras secuencias de límite está el gen a ser expresado bajo control de los elementos de regulación de la presente invención. En una modalidad, un marcador seleccionable y un gen reportador también son incluidos. Para facilidad de obtención de cantidades suficientes de vector, se puede utilizar un origen bacteriano que permite la replicación en E. coli.
Los genes reportadores pueden ser incluidos en los vectores de transformación. Ejemplos de genes reportadores adecuados conocidos en la técnica, se pueden encontrar en, por ejemplo: Jefferson y colaboradores (1991) en Plant Molecular Biology Manual, ed. Gelvin y colaboradores ( luwer Academic Publishers) , pp. 1-33; De et y colaboradores (1987) Mol. Cell. Biol, 7:725-737; Goff y colaboradores (1990) EMBO J. 9:2517-2522; Kain y colaboradores (1995) BioTechniques 19:650-655; Y Chiu y colaboradores (1996) Current Biology 6:325-330. Los genes marcadores seleccionables para la selección de células o tejidos transformados pueden ser incluidos en los vectores de transformación. Estos pueden incluir genes que confieren resistencia al antibiótico o resistencia a herbicidas. Ejemplos de genes marcadores seleccionables adecuados incluyen, pero no están limitados a: genes que codifican la resistencia a cloranfenicol , Herrera Estrella y colaboradores (1983) EMBO J. 2:987-992; metotrexato, Herrera Estrella y colaboradores (1983) Natura 303:209-213; Meijer y colaboradores (1991) Plant Mol. Biol. 16:807-820; higromicina, Waldron y colaboradores (1985) Plant Mol. Biol. 5:103-108; Zhijian y colaboradores (1995) Plant Science 108:219-227; estreptomicina, Jones y colaboradores (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86-91; espectinomicina, Bretagne-Sagnard y colaboradores (1996) Transgenic Res. 5:131-137;
bleomicina, Hille y colaboradores (1990) Plant Mol. Biol. 7:171-176; sulfonamida , Guerineau y colaboradores (1990) Plant Mol. Biol. 15:127-136; bromoxinilo, Stalker y colaboradores (1988) Science 242:419-423; glifosato, Shaw y colaboradores (1986) Science 233:478-481; fosfinotricina, DeBlock y colaboradores (1987) EMBO J. 6:2513-2518. Otros genes que podrían servir de utilidad en la recuperación de eventos transgénicos , pero podrían no ser requeridos en el producto final, incluirían, pero no están limitados a: GUS (b-glucoronidasa) , Jefferson (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387); GFP (proteína de fluorescencia verde), Chalfie y colaboradores (1994) Science 263:802; luciferasa, Teeri y colaboradores (1989) EMBO J. 8:343; y los genes de maíz que codifican para la producción de antocianina, Ludwig y colaboradores (1990) Science 246:449. El vector de transformación que comprende las secuencias de regulación particulares de la presente invehción, operablemente enlazado a una secuencia de nucleótidos aislada de interés en un cásete de expresión, se puede usar para transformar cualquier planta. De esta manera, se pueden obtener plantas, células de plantas, tejido de plantas, semillas genéticamente modificadas y similares. Los protocolos de transformación pueden variar dependiendo del tipo de planta o célula .de planta, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea, dirigida para la transformación. Los métodos adecuados para transformar células de planta incluyen la microinyección, Crossway y colaboradores (1986) Biotechniques 4:320-334; electroporación, Riggs y colaboradores (1986) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 83:5602-5606; transformación mediada por Agrobacterium, ver por ejemplo, Townsend y colaboradores, patente norteamericana 5,563,055; transferencia de gen directa, Paszkowski y colaboradores (1984) EMBO J. 3:2717-2722; y la aceleración de partícula balística, ver por ejemplo, Sanford y colaboradores, patente norteamericana 4,945,050; Tomes y colaboradores (1995) en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips ( Springer-Verlag, Berlín) ; y McCabe y colaboradores (1988) Biotechnology 6:293-926. También ver Weissinger y colaboradores (1988) Annual Rev. Genet. 22:421-477; Sanford y colaboradores (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebolla); Christou y colaboradores (1988) Plant Physiol, 87:671-674 (soya); McCabe y colaboradores (198¾) Bio/Technology 6:923-926 (soya); Datta y colaboradores (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein y colaboradores (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85-4305-4309 (maíz); Klein y colaboradores (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz); Klein y colaboradores (1988) Plant Physiol 91:440-444 (maíz); Fromm y colaboradores (1990) Biotechnology 8:833-839; Hooydaas-Van Slogteren y colaboradores (1984) NATURE (London) 311:763-764; Bytebier y colaboradores (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (Liliaceae ) ; De Wet y colaboradores (1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. G.P. Chapman y colaboradores (Longman, New York), pp . 197-209 (polen); aeppler y colaboradores (1990) Plant Cell Raports 9:415-418; y Kaeppler y colaboradores (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformación mediada por escobilla); D. Halluin y colaboradores (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporación) ; Li y colaboradores (1993) Plant Cell Report 12:250-255 y Christou y colaboradores (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz), Osjoda y colaboradores (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (maíz por medio de Agrobacterium turnefaciens ) ; todas las cuales son incorporadas en la presente por referencia. Las células que se han transformado pueden ser cultivadas en plantas de acuerdo con maneras convencionales. Ver, por ejemplo, McCormick y colaboradores (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas luego pueden ser cultivadas y polihizadas con la misma cepa transformada o diferentes cepas. El híbrido resultante que tiene la expresión de espiga inmadura (floración temprana) preferida de la característica fenotípica deseada luego puede ser identificado. Dos o más generaciones pueden ser cultivadas para asegurar que sea establemente mantenida y heredada la expresión de espiga inmadura (floración temprana) preferida de la característica fenotípica deseada.
Los siguientes ejemplos se presentan a manera de ilustración y no a manera de limitación. Ejemplos Las regiones de regulación de la invención se aislaron de plantas de maíz y se clonaron. Los genes se seleccionaron como una fuente para regiones de regulación de espiga inmadura (floración temprana) -preferida basada en la expresión espacial de sus productos de gen. El método para su aislamiento se describe enseguida. Ejemplo 1: Aislamiento de Secuencias de Promotor usando Genome Walker Aislamiento de DNA Genómico El DNA genómico corriente arriba de la secuencia de codificación para los genes similares a API de maíz se aisló usando el Kit Universal Genome Walker de CLONTECH (Palo Alto, CA) . Manchado de Northern El RNA se aisló de retoños de plántulas de 4 semanas usando el método TriZol (Invitrogen, Carlsbad, CA) . 15 µq de RNA total se separó en geles de agarosa al 1% MOPS-formaldehido y se mancharon en la membrana Hybond-N+ (Amersham) . Sondas de DNA se marcaron usando el kit RediPrimelI (Amersham) y se hibridaron a la membrana en ExpressHyb (CLONTECH, Palo Alto, CA) a 65°C durante la noche. Las membranas se lavaron dos veces en 2XSSC, SDS al 0.1% a temperatura ambiente y dos veces en 0.1XSSC, SDS al 0.1% a 50°C. Las membranas se autografiaron para visualizar las señales de hibridación. RESULTADOS La Expresión del Gen similar a API en los Retoños de Maíz y las Plantas Mutantes Tbl se representan en la Figura 1. Ejemplo 2 Se preparó un plásmido incorporando el promotor similar a Ap-1 de la invención y se muestra en la Figura 2 (SEQ ID NO: 2} y 3.