HU226090B1 - Early inflorescence-preferred regulatory elements and uses thereof - Google Patents
Early inflorescence-preferred regulatory elements and uses thereof Download PDFInfo
- Publication number
- HU226090B1 HU226090B1 HU0600155A HUP0600155A HU226090B1 HU 226090 B1 HU226090 B1 HU 226090B1 HU 0600155 A HU0600155 A HU 0600155A HU P0600155 A HUP0600155 A HU P0600155A HU 226090 B1 HU226090 B1 HU 226090B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- plant
- sequence
- sequences
- expression
- expression cassette
- Prior art date
Links
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 title claims description 47
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 86
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 55
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 53
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 43
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 43
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 27
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 23
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 22
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 18
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 13
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 9
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 9
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 8
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims description 6
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 6
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 claims description 6
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 6
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 claims description 5
- 244000082988 Secale cereale Species 0.000 claims description 5
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 claims description 4
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 claims description 4
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 claims description 4
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 claims description 4
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 claims description 2
- 241000209140 Triticum Species 0.000 claims 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims 1
- 230000004136 fatty acid synthesis Effects 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 26
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 21
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 14
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 9
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 9
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 8
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 8
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 8
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 6
- 230000008124 floral development Effects 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 6
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 5
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 241000721701 Lynx Species 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 4
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 4
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- 108020004491 Antisense DNA Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 241000694589 Gesneria viridiflora Species 0.000 description 3
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 3
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 3
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 3
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 3
- 239000003816 antisense DNA Substances 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 230000009105 vegetative growth Effects 0.000 description 3
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 2
- 244000099147 Ananas comosus Species 0.000 description 2
- 235000007119 Ananas comosus Nutrition 0.000 description 2
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 2
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 2
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 description 2
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 description 2
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 2
- 240000000385 Brassica napus var. napus Species 0.000 description 2
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 2
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 2
- 241001164374 Calyx Species 0.000 description 2
- 241000207199 Citrus Species 0.000 description 2
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 description 2
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 2
- 241000218922 Magnoliophyta Species 0.000 description 2
- 241000723994 Maize dwarf mosaic virus Species 0.000 description 2
- 235000014826 Mangifera indica Nutrition 0.000 description 2
- 240000007228 Mangifera indica Species 0.000 description 2
- 240000003183 Manihot esculenta Species 0.000 description 2
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 2
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 2
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 2
- 240000007817 Olea europaea Species 0.000 description 2
- 241000282320 Panthera leo Species 0.000 description 2
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 2
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 2
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 2
- 244000299461 Theobroma cacao Species 0.000 description 2
- 235000009470 Theobroma cacao Nutrition 0.000 description 2
- 241000723792 Tobacco etch virus Species 0.000 description 2
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 2
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 235000007244 Zea mays Nutrition 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000000442 meristematic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 2
- 230000009120 phenotypic response Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 2
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- UPMXNNIRAGDFEH-UHFFFAOYSA-N 3,5-dibromo-4-hydroxybenzonitrile Chemical compound OC1=C(Br)C=C(C#N)C=C1Br UPMXNNIRAGDFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010020183 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase Proteins 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 241000724328 Alfalfa mosaic virus Species 0.000 description 1
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 description 1
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 1
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 description 1
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 1
- 240000008100 Brassica rapa Species 0.000 description 1
- 235000011292 Brassica rapa Nutrition 0.000 description 1
- 239000005489 Bromoxynil Substances 0.000 description 1
- 235000004936 Bromus mango Nutrition 0.000 description 1
- 102100022361 CAAX prenyl protease 1 homolog Human genes 0.000 description 1
- 101100342815 Caenorhabditis elegans lec-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000003643 Callosities Diseases 0.000 description 1
- 235000003255 Carthamus tinctorius Nutrition 0.000 description 1
- 244000020518 Carthamus tinctorius Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000218631 Coniferophyta Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 108010066133 D-octopine dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000218218 Ficus <angiosperm> Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000824531 Homo sapiens CAAX prenyl protease 1 homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000899240 Homo sapiens Endoplasmic reticulum chaperone BiP Proteins 0.000 description 1
- 101001003584 Homo sapiens Prelamin-A/C Proteins 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 241000234280 Liliaceae Species 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 241000710118 Maize chlorotic mottle virus Species 0.000 description 1
- 235000004456 Manihot esculenta Nutrition 0.000 description 1
- 235000016735 Manihot esculenta subsp esculenta Nutrition 0.000 description 1
- 235000010624 Medicago sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241000234295 Musa Species 0.000 description 1
- 240000005561 Musa balbisiana Species 0.000 description 1
- 235000018290 Musa x paradisiaca Nutrition 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000002725 Olea europaea Nutrition 0.000 description 1
- 241000218196 Persea Species 0.000 description 1
- 244000025272 Persea americana Species 0.000 description 1
- 235000008673 Persea americana Nutrition 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N Phosphinothricin Natural products CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 241000710078 Potyvirus Species 0.000 description 1
- 241000508269 Psidium Species 0.000 description 1
- 240000001679 Psidium guajava Species 0.000 description 1
- 235000013929 Psidium pyriferum Nutrition 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108010003581 Ribulose-bisphosphate carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 235000007230 Sorghum bicolor Nutrition 0.000 description 1
- 235000009184 Spondias indica Nutrition 0.000 description 1
- 241001406921 Squamosa Species 0.000 description 1
- 235000006468 Thea sinensis Nutrition 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 230000009661 flower growth Effects 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N formaldehyde Substances O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000008303 genetic mechanism Effects 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 1
- 239000010903 husk Substances 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000020429 meristem development Effects 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 1
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035040 seed growth Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 1
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
- C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Cultivation Of Plants (AREA)
Description
Izolált DNS-szekvenciák növényi gazdában történő expressziója olyan működőképesen kapcsolt szabályozóelemek jelenlététől függ, amelyek működőképesek a növényi gazdában. A szabályozószekvenciák kiválasztása határozza meg, hogy az organizmusban mikor és hol expresszálódik az izolált DNS-szekvencia. Amikor a növény összes sejtjére kiterjedő folyamatos expresszió kívánatos, konstitutív promotereket alkalmazunk. Ezzel ellentétben, amikor egy ingerre válaszul adott génexpresszió kívánatos, indukálható promoterek a választható szabályozóelemek. Amikor specifikus szövetekben vagy szervekben történő expresszió kívánatos, szövetspecifikus promotereket és/vagy terminátorokat alkalmazunk. Azaz ezek a szabályozóelemek képesek az expressziót irányítani specifikus szövetekben vagy szervekben. A magszekvenciáktól leolvasással ellentétes irányban található és/vagy leolvasással megegyező irányban található további szabályozószekvenciákat is alkalmazhatunk transzformációs vektorok expressziós kazettáiban, hogy izolált nukleotidszekvenciák különböző szintjeit hozzuk létre egy transzgenikus növényben.
A növényeknek két alapvető növekedési módja van az életciklusukban - a vegetatív növekedés és a virág és mag növesztése. A növény föld feletti vegetatív növekedése a csúcsmerisztémából fejlődik ki. Ebből a vegetatív merísztémából alakul ki az összes levél, amely a növényen található. A növény mindaddig fenntartja a vegetatív növekedési mintázatát, amíg a csúcsmerisztéma meg nem változik. Ez a változás átalakítja a merisztémát vegetatív merisztémából virágzati merisztémává. A virágzati merisztéma kis leveleket hoz létre, mielőtt virágmerisztémákat hozna létre. A virágmerisztéma az, amelyből a virág kialakul.
A virágmerisztéma egy sor fejlődési változáson megy keresztül, amelyek végső soron a virág négy alapvető szerkezetének, a csészelevelek, sziromlevelek, porzószálak és termőlevelek kialakulását eredményezik. Ezen szerkezetek mindegyike egymás után alakul ki a virágmerisztémából kifejlődő érvekből. Az első örv alakul ki elsőnek, és az fejlődik tovább a növény csészeleveleivé. A második örv fejlődik a sziromlevelekké. A harmadik és negyedik örv alkotja a porzószálakat (hím szaporítószervek) és termőleveleket (női szaporítószervek).
Genetikai szempontból két fenotípusos változás van a növénybe programozva, amely a vegetatív és virágos növekedést szabályozza. Az első genetikai változás a vegetatívból a virágos állapotba történő átkapcsolást foglalja magában. Ha ez a genetikai változás nem működik megfelelően, akkor a virágzás nem következik be. A második genetikai esemény azután következik be, hogy a növény elkötelezte magát a virágzás mellett. Az a megfigyelés, hogy a növény szervei egymást követően fejlődnek ki, azt sugallja, hogy létezik egy olyan genetikai mechanizmus, amelyben egy sor gén egymás után kapcsolódik be és ki. Ez a kapcsolódás szükséges mindegyik örv esetében, hogy az megkapja a végső egyedi jellegét.
Egy sor Arabidopsis mutánst azonosítottak, amelyekben a normális virágokat olyan szerkezetek helyettesítik, amelyek virágzati merisztémára és azokra hajtásokra hasonlítanak, amelyek azokból kifejlődnek. Egy ilyen mutáns a LEAFY. Ez a mutáns egyáltalán nem tartalmaz normális virágokat. Azok helyett a kifejlődő korai virágszerkezetek virágzati hajtásoknak tűnnek, míg a későbbi virágok részlegesen normális virágokra hasonlítanak. Ezek a később kifejlődő virágok csésze- és termőlevélszerű szerkezeteket tartalmaznak, azaz nincsenek bennük sziromlevelek és porzószálak. Ez azt sugallja, hogy a LEAFY mutánsban két olyan funkció van, amely elkötelezi a növényt virágmerisztéma kifejlesztésére és sziromlevelek és porzószálak kialakítására.
Az APETALA1 mutánsok virágai nem változnak meg olyan drámaian, mint a LEAFY mutánsok. Ezek a mutánsok részleges virágzati merisztéma fenotípust mutatnak, amelyben másodlagos virágmerisztéma tűnik fel a csészelevelek tengelyrégiójában. De amikor az APETALA1 és LEAFY mutánsokat kombináljuk, a virágok virágzati hajtásoknak tűnnek. Az APETALA1 gén oroszlánszáj-analógja, a SQUAMOSA, sokkal súlyosabb hatású, és a virágok virágzati hajtásoknak látszanak. Az APETALA1 befolyásolja a csészelevelek és sziromlevelek normális fejlődését is.
Az Arabidopsist virágzásra elkötelező, és a virágszervek kifejlődését szabályozó gének klónozását vagy oroszlánszájgénekkel történő heterológ próbázással, vagy transzpozoncímkézéssel hajtották végre. Általában ezeknek a géneknek a szekvenciaelemzése azt sugallja, hogy MADS-boxot tartalmazó géneknek, vagy más szerkezetet tartalmazó génnek sorolhatók be.
A MADS-box gének központi szerepet játszanak a virágok fejlődésében a növényekben. Önmagában az a tény, hogy az oroszlánszáj MADS-box géneket alkalmazták heterológ próbaként, bizonyíték arra, hogy a gének ezen osztálya fontos más fajokban. A fontosságuk további bizonyítékát adták azáltal, hogy homológ szekvenciákat találtak egyszikűekben is, mint például kukoricában.
A kukorica egyszikű növényfaj, amely a fűfélék családjába tartozik. A virágzó növények között szokatlan, hogy egyivarú virágzataik legyenek. A hím virágzat (címer) szárvégi pozícióban fejlődik ki, míg a női virágzat (cső) a vegetatív levelek hónaljában nő. A virágzatok amint az tipikus a füvek esetében - kalászkákból állnak. A kukorica esetében mindegyik kalászka két virágocskát tartalmaz (fűvirág), amelyeket egy pár fellevél zár be (belső és külső pelyva).
Mindegyik virágocska tartalmaz két bezáró fellevelet (lemma és palea), két lodikulát (pikkelyszerű szervek, amelyek csak a hím virágokban feltűnőek), három porzószálat és a központi helyzetű bibét, amely egyetlen magkezdeményt tartalmaz.
A fűvirágok eléggé különböznek a tipikus zárvatermő virágtól. Ez utóbbi csészelevelek és sziromlevelek koncentrikus örveiből áll, amelyek porzószálak és bibék orvéit zárják be. A zárvatermő virágszövetek és a fűvirágocska homológiáját több mint 200 éven keresztül vitatják.
A találmány szerint fejlődésileg specifikus szabályozószekvenciákat tárunk fel, amelyek lehetővé teszik
HU 226 090 Β1 gének transzkripcióját a virágfejlődés kritikus ideje folyamán, mint például amelyek a korai virágszövetekben szövetpreferáltak, mint például a merisztémában, manipulálva a virágzási időt, virágzás megkezdését és a merisztéma fejlődését a növényekben.
A növények virágzási sajátosságainak javítása érdekében szükség van a korai virágfejlődésben preferált olyan promoterek és terminátorok izolálására és jellemzésére, amelyek szabályozóelemekként szolgálhatnak jelentőséggel bíró izolált nukleotidszekvenciák virágpreferált expressziójához.
A találmány tárgya kukoricából származó szabályozóelem, amely az alábbiakat tartalmazza: TATA-boxot, és amely képes az expresszió irányítására hasonlóképpen a növényi sejtekben, különösen a kukoricanövény sejtjeiben található AP-1-szerű génhez. A promotert ZM-MADS PRO1 néven ismerjük, vagy mint ZAP (Zea mays APETALA), de a továbbiakban AP-1-szerűnek nevezzük. A találmány tárgyát képezik továbbá expressziós konstrukciók, amelyek a találmány szerinti szabályozóelemet DNS-szekvenciákhoz működőképesen kapcsolva tartalmazzák, az expressziós konstrukciókat tartalmazó vektorok, a konstrukciókkal transzformáit növényi sejtek, és azokból regenerált növények. A találmány szerinti szabályozóelemek biztosítják a működőképesen kapcsolt szekvenciák expresszióját a kukorica virágzásával kapcsolatos szövetekben.
Az AP-1-szerű gén többféle növény virágfejlődésének specifikus szakaszait szabályozza. A találmány tárgyát olyan nukleotidszekvenciák képezik, amelyek lehetővé teszik a transzkripció iniciálását a korai virágzásban szerepet játszó a szövetekben, mint például merisztémaszövetben, AP-1-szerű expressziós mintázattal. A találmány szerinti szekvenciák olyan transzkripciós iniciációs régiókat tartalmaznak, amelyek időben a virágzással, térben a virágfejlődési szövetekkel kapcsolatosak. Ily módon a találmány szerinti készítmények olyan új nukleotidszekvenciákat tartalmaznak, amelyek a kukorica AP-1-szerű génjét kódoló nukleotidszekvenciákkal természetben kapcsolatos szabályozóelemeket kódolnak.
A találmány tárgyát képezi eljárás izolált nukleotidszekvenciák expresszáltatására növényben a találmány szerinti transzkripciós iniciációs szekvenciák alkalmazásával. Az eljárás szerint növényi sejtet olyan transzformációs vektorral transzformálunk, amely izolált nukleotidszekvenciát tartalmaz működőképesen kapcsolva egy vagy több találmány szerinti növényi szabályozószekvenciához, és stabilan transzformált növényt regenerálunk a transzformált növényi sejtből. Ily módon a szabályozószekvenciák alkalmazhatók endogén és exogén termékek expressziójának szabályozására virágfejiődés-preferált módon.
A virágfejlődés-specifikus régió transzkripciós iniciációs szabályozása alatt áll a jelentőséggel bíró szekvencia, amely biztosítja a fejlődő virág fenotípusának a módosítását. Ilyen módosítások közé tartozik endogén termék termelésének a modulálása mennyiség, viszonylagos eloszlás és hasonlók tekintetében, vagy exogén expressziós termék termelése új funkció vagy termék biztosítására a virágban, a virág méretének a manipulálása, a virágzás idejének, a virágzás hosszának és hasonlóknak a manipulálása.
A „virágfejlődés” kifejezés alatt kedvezményezett expressziót értünk az újonnan kifejlődő virágban, nem korlátozó példaként merisztémaszövetben.
A „szabályozóelem kifejezés alatt olyan szekvenciákat értünk, amelyek felelősek a kapcsolódó kódolószekvencia időleges expressziójáért, beleértve promotereket, terminátorokat, enhanszereket, intronokat és hasonlókat.
A „terminátor” kifejezés alatt olyan szekvenciákat értünk, amelyek szükségesek a transzkripció terminációjához. A DNS olyan szabályozórégiója, amely az RNS-polimeráz disszociációját okozza a DNS-ről, a transzkripció terminációját okozza.
A „promoter kifejezés alatt a DNS olyan szabályozórégióját értjük, amely általában TATA-boxot tartalmaz, és amely képes irányítani az RNS-polimeráz-ll-t az RNS-szintézis iniciálására egy adott kódolószekvencia megfelelő transzkripciós iniciációs helyén. A promoter ezenfelül tartalmazhat a TATA-box 5’-végétől leolvasással ellentétes irányban található, leolvasással ellentétes irányban található promoterelemeknek nevezett más felismerési szekvenciákat is, amelyeket befolyásolják a transzkripció iniciációjának sebességét. Nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti promoterrégiót kódoló nukleotidszekvenciák azonosításával a szakember képes további szabályozóelemeket izolálni és azonosítani a találmány szerinti promoterrégiótól leolvasással ellentétes irányban található 5' nem transzlálódó régióban. Ily módon a találmány szerinti promoterrégió általában definiálható azáltal, hogy olyan leolvasással ellentétes irányban található szabályozóelemeket tartalmaz, mint például amelyek a kódolószekvencia szöveti és időbeli expressziójáért felelősek, mint például enhanszerek és hasonlók. Ugyanilyen módon azonosíthatók, izolálhatok és más magpromoterekkel együtt alkalmazhatók azok a promoterelemek, amelyek lehetővé teszik a kívánt szövetben, mint például címerben történő expressziót, hogy igazoljuk a korai címerben és virágfejlődésben preferált expressziót.
A találmány szerinti izolált promoterszekvenciákat módosíthatjuk, hogy az izolált nukleotidszekvencia különböző expressziós szintjét biztosítjuk. A teljes promoterrégiónál kisebb részt alkalmazhatunk, és megtarthatjuk a virágfejiődés-preferált expresszió képességét. Azonban nyilvánvaló, hogy az mRNS expressziós szintje csökkenhet a promoterszekvencia részleteinek a deléciójával. Ily módon a promotert módosíthatjuk gyenge vagy erős promoterré. Általában a „gyenge promoter” kifejezés alatt olyan promotert értünk, amely a kódolószekvencia alacsony szinten történő expresszióját irányítja. Az „alacsony szint kifejezés alatt körülbelül 1/10 000 transzkriptum és körülbelül 1/100 000 transzkriptum és körülbelül 1/500 000 transzkriptum közötti szintet értünk. Ezzel ellentétben egy erős promoter a kódolószekvencia magas szinten történő expresszióját irányítja, vagy körülbelül 1/10 transzkriptum és körülbe3
HU 226 090 Β1 lül 1/100 transzkriptum és körülbelül 1/1000 transzkriptum közötti szinten. Általában egy izolált promoterszekvenciának legalább körülbelül 20 nukleotidját alkalmazhatjuk nukleotidszekvencia expressziójának az irányítására.
Nyilvánvaló, hogy a transzkripciós szint növelésére enhanszereket is alkalmazhatunk a találmány szerinti promoterrégióval kombinálva. Az enhanszerek olyan nukleotidszekvenciák, amelyek a promoterrégió expressziójának növelésére hatnak. Az enhanszerek ismertek a szakterületen, és közéjük tartozik az SV40 enhanszerrégió, a 35S enhanszerelem, és hasonlók.
A találmány szerinti promotereket a megfelelő transzkripciós iniciációs helyet szegélyező 5' nem transzlálódó régióból izolálhatjuk. Hasonlóképpen a terminátort a megfelelő stopkodont szegélyező 3’ nem transzlálódó régióból izolálhatjuk. Az „izolált” kifejezés alatt olyan anyagot, mint például nukleinsavat vagy fehérjét értünk, amely: (1) alapjában véve vagy lényegében mentes olyan komponensektől, amelyek normálisan együtt találhatók vagy kölcsönhatásba lépnek az anyaggal a természetes környezetében, vagy (2) ha az anyag a természetes környezetében van, az anyag módosítva lett szándékos emberi beavatkozás útján olyan készítménnyé, és/vagy olyan helyre lett helyezve a sejtben, amely különbözik az anyag természetes előfordulási helyétől. Promoterrégiók izolálására alkalmas eljárások jól ismertek a szakterületen. Egy eljárást ismertetnek a 06/098 690 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben, amely 1998. augusztus 31-én lett bejelentve, és amely hivatkozás útján a kitanítás részét képezi. A promoterrégió szekvenciáját az 1. azonosító számú szekvencián mutatjuk be. Az 1. azonosító számú szekvencia szerinti ΑΡ-1-szerű promoter 2287 nukleotid hosszúságú.
A találmány szerinti promoterrégiókat bármilyen növényből izolálhatjuk, nem korlátozó példaként kukoricából (Zea mays), kanolából (Brassica napus, Brassica rapa ssp.), lucernából (Medicago sativa), rizsből (Oryza sativa), rozsból (Secale cereale), cirokból (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), napraforgóból (Helianthus annuus), búzából (Triticum aestivum), szójából (Glycine max), dohányból (Nicotiana tabacum), burgonyából (Solanum tuberosum), földimogyoróból (Arachis hypogaea), gyapotból (Gossypium hirsutum), édesburgonyából (Ipomoea batatus), kasszavából (Manihot esculenta), kávéból (Cofea spp.), kókuszból (Cocos nucifera), ananászból (Ananas comosus), citrusfélékből (Citrus spp.), kakaóból (Theobroma cacao), teából (Camellia sinensis), banánból (Musa spp.), avokádóból (Persea amerícana), fügéből (Ficus casica), guavából (Psidium guajava), mangóból (Mangifera indica), olívából (Olea europaea), zabból, árpából, zöldségfélékből, dísznövényekből és tűlevelűekből. Előnyösen a növények közé tartozik a kukorica, szója, napraforgó, pórsáfrány, kanola, búza, árpa, rozs, lucerna és cirok.
Más növényekből származó promoterszekvenciákat jól ismert módszerek alapján izolálhatunk azok homológiája alapján a találmány szerinti promoterszekvenciákkal. Ezekben a módszerekben az ismert promoterszekvencia egészét vagy részét alkalmazzuk próbaként, amely szelektíven hibridizál más szekvenciákhoz, amelyek jelen vannak egy kiválasztott organizmusból származó klónozott genomiális DNS-fragmensek populációjában. A szakterületen rendelkezésre állnak módszerek nukleinsavszekvenciák hibridizálására.
A teljes promoterszekvenciát vagy annak részleteit alkalmazhatjuk a megfelelő promoterszekvenciákhoz specifikusan hibridizálni képes próbaként. Különféle körülmények közötti specifikus hibridizáció eléréséhez az ilyen próbák közé olyan szekvenciák tartoznak, amelyek egyediek, és előnyösen legalább körülbelül 10 nukleotid hosszúságúak, és legelőnyösebben körülbelül 20 nukleotid hosszúságúak. Ilyen próbákat alkalmazhatunk a megfelelő promoterszekvenciák kiválasztott organizmusból történő amplifikálására a jól ismert polimeráz-láncreakció (PCR) útján. Ezt a módszert alkalmazhatjuk további promoterszekvenciák izolálására kívánt organizmusból vagy diagnosztikai vizsgálati eljárásként promoterszekvenciák jelenlétének a meghatározásra egy organizmusban. A példák közé tartozik szélesztett DNS-könyvtárak hibridizációs szkrínelése [akár tarfoltokon, akár kolóniákon; lásd például „PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, szerk.: Innis és munkatársai, kiad.: Academic Press (1990)].
A „sztringens körülmények között vagy „sztringens hibridizációs körülmények között” kifejezések alatt olyan körülményeket értünk, amelyek között egy próba detektálhatóan nagyobb mértékben (például legalább a háttér kétszeresével) hibridizál a célszekvenciájához, mint más szekvenciákhoz. A sztringens körülmények célszekvencia-függőek, és különbözhetnek a polinukleotid szerkezetétől függően. A hibridizáció és/vagy a mosási körülmények sztringensségének a szabályozásával a próbával 100%-ban komplementer célszekvenciákat azonosíthatunk (homológ próbázás). Más megoldásképpen a sztringens körülményeket úgy módosíthatjuk, hogy megengedjünk bizonyos mértékű hibás illeszkedést a szekvenciák között, oly módon, hogy kisebb mértékű hasonlóságot detektáljunk (heterológ próbázás). Általában az ilyen típusú próbák a körülbelül 250 nukleotid és körülbelül 1000 nukleotid közötti hosszúságtartományba esnek.
Nukleinsavak hibridizálásának kiterjedt iránymutatását találhatjuk meg az alábbi irodalmi helyeken: Tijssen, „Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes”, I. rész, 2. fejezet, „OverView of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”, kiad.: Elsevier, New York (1993); és „Current Protocols in Molecular Biology”, 2. fejezet, szerk.: Ausubel és munkatársai, kiad: Greene Publishing and Wiley-lnterscience, New York (1995). Lásd még Sambrook és munkatársai, „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2. kiadás, kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989).
Általában a találmány szerinti promoterszekvenciának megfelelő és a találmány szerinti promoterszek4
HU 226 090 Β1 venciákkal hibridizáló szekvenciák legalább 50%-ban homológok, 55%-ban homológok, 60%-ban homológok, 65%-ban homológok, 70%-ban homológok, 75%ban homológok, 80%-ban homológok, 85%-ban homológok, 90%-ban homológok, 95%-ban homológok és akár 98%-ban vagy nagyobb mértékben homológok a találmány szerinti szekvenciával.
A specifitás tipikusan a hibridizációt követő mosások függvénye, és a kritikus tényezők az utolsó mosóoldat ionerőssége és a hőmérséklete. Általában a sztringens mosási körülményeket úgy választjuk meg, hogy körülbelül 2 °C és körülbelül 5 °C közötti hőmérséklettel legyenek alacsonyabbak, mint a specifikus szekvenciának az olvadáspontja (Tm) egy adott ionerősség és pH mellett. A DNS olvadáspontja vagy denaturációja egy szűk hőmérsékleti tartományban következik be, és a kétszálú hélixnek a komplementer egyszálú szálakká való szétbomlását képviseli. A folyamatot az átmenet felezőpontjának a hőmérsékletével jellemezzük (Tm), amit olvadási hőmérsékletnek is nevezünk. A szakterületen hozzáférhetők képletek az olvadási hőmérsékletek meghatározására.
A találmány szerinti promoterszekvenciák hibridizációs körülményei közé tartozik hibridizáció 42 °C-on 50% (w/v) formamidot, 6*SSC-t, 0,5% (w/v) SDS-t, 100 mg/ml lazacsperma-DNS-t tartalmazó pufferben. Szemléltető alacsony sztringensségű mosási körülmények közé tartozik hibridizáció 42 °C-on 2*SSC-t, 0,5% (w/v) SDS-t tartalmazó oldatban 30 percen keresztül, és azt megismételve. Szemléltető közepes sztringensségű körülmények közé tartozik mosás 2*SSC-t, 0,5% (w/v) SDS-t tartalmazó oldatban 50 °C-on 30 percen keresztül, és azt megismételve. Szemléltető magas sztringensségű körülmények közé tartozik mosás 2*SSC-t, 0,5% (w/v) SDS-t tartalmazó oldatban 65 °C-on 30 percen keresztül, és azt megismételve. A találmány szerinti promotemek megfelelő szekvenciákat a fenti körülmények bármelyikével előállíthatjuk.
Az alábbi kifejezéseket alkalmazzuk két vagy több nukleinsav vagy polipeptid szekvenciájának a rokonságának a leírására: (a) „referenciaszekvencia, (b) „összehasonlítási ablak”, (c) „százalékos szekvenciaazonosság” és (d) „lényegi azonosság”.
(a) A leírás szerinti értelemben a „referenciaszekvencia” kifejezés alatt meghatározott szekvenciát értünk, mint az összehasonlítás alapja. Referenciaszekvencia lehet egy specifikus szekvencia egy részlete vagy egésze; például lehet teljes hosszúságú promoterszekvencia szegmense vagy a teljes promoterszekvencia.
(b) A leírás szerinti értelemben az „összehasonlítási ablak” kifejezés alatt egy polinukleotidszekvencia összefüggő és meghatározott szegmensét értjük, amelyen a polinukleotidszekvenciát összehasonlíthatjuk egy referenciaszekvenciával, és amelyben a polinukleotidszekvencia összehasonlítási ablakba eső részlete addíciókat és deléciókat (azaz réseket) tartalmazhat a referenciaszekvenciával összehasonlítva (amely nem tartalmaz addíciókat vagy deléciókat) a két szekvencia optimális egymás alá rendezése érdekében. Általában az összehasonlítási ablak legalább 20 összefüggő nukleotid hosszúságú, és adott esetben lehet 30, 40, 50, 100 összefüggő nukleotid hosszúságú, vagy hosszabb. A szakember számára nyilvánvaló, hogy a referenciaszekvenciához való nagymértékű hasonlóságréseknek a polinukleotidszekvenciába való beillesztésével történő elkerülésére tipikusan résbüntetést alkalmazunk, és azt levonjuk az illeszkedések számából.
(c) A leírás szerinti értelemben a „százalékos szekvenciaazonosság kifejezés alatt azt az értéket értjük, amelyet egy összehasonlítási ablakban két optimálisan egymás alá rendezett szekvencia összehasonlításával határozunk meg, ahol a polinukleotidszekvencia összehasonlítási ablakban lévő részlete addíciókat vagy deléciókat (azaz réseket) tartalmazhat a referenciaszekvenciával összehasonlítva (amely nem tartalmaz addíciókat vagy deléciókat) a két szekvencia optimális egymás alá rendezése érdekében. A százalékot azon pozíciók számának meghatározásával számítjuk ki, amelyekben azonos nukleinsavbázis fordul elő mindkét szekvenciában, ily módon kapjuk meg az illeszkedő pozíciók számát, elosztva az illeszkedő pozíciók számát az összehasonlítási ablakban lévő összes pozíció számával (azaz az ablak méretével), és megszorozva az eredményt 100-zal kapjuk meg a százalékos szekvenciaazonosságot.
(d) Polinukleotidszekvenciák „lényeges azonossága” kifejezés alatt azt értjük, hogy egy polinukleotid olyan szekvenciát tartalmaz, amely legalább 70% szekvenciaazonosságú, előnyösen legalább 80% szekvenciaazonosságú, előnyösebben legalább 90% szekvenciaazonosságú és legelőnyösebben legalább 95% szekvenciaazonosságú a referenciaszekvenciával összehasonlítva az ismertetett egymás alá rendező programok alkalmazásával a szokásos paraméterek alkalmazásával.
Szekvenciák összehasonlítás céljából történő egymás alá rendezésére alkalmas eljárások jól ismertek a szakterületen. A gén-összehasonlításokat BLAST keresések végrehajtásával határozhatjuk meg [„Basic Local Alignment Search Tool”; Altschul, S. F. és munkatársai, J. Mól. Bioi. 215, 403-410. old. (1993); lásd még http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) az alapértelmezett paraméterek alkalmazása mellett a BLAST „GENEMBL adatbázisban található szekvenciákkal való azonosságának meghatározására. Elemezhetjük egy szekvencia azonosságát a GENEMBL adatbázisban megtalálható összes nyilvánosan hozzáférhető DNSszekvenciával a BLASTN algoritmus alkalmazásával az alapértelmezett paraméterekkel. A találmány szerinti szekvenciával való azonosság olyan polinukleotidszekvenciát jelent, amelynek legalább 65% a szekvenciaazonossága, előnyösebben legalább 70% a szekvenciaazonossága, előnyösebben legalább 75% a szekvenciaazonossága, előnyösebben legalább 80% a szekvenciaazonossága, előnyösebben legalább 85% a szekvenciaazonossága, előnyösebben legalább 90% a szekvenciaazonossága, és legelőnyösebben legalább 95% a szekvenciaazonossága, amikor a százalékos szekvenciaazonosság a teljes promoterrégión alapszik.
HU 226 090 Β1
A GAP Needleman és Wunsch algoritmusát alkalmazza [J. Mól. Bioi. 48,443-453. old. (1970)] két teljes szekvencia egymás alá rendezésének megtalálására, ami maximalizálja az illeszkedések számát, és minimalizálja a rések számát. A GAP figyelembe veszi az összes lehetséges egymás alá rendezést és réspozíciót, és a legnagyobb számú illeszkedő bázist és legkevesebb rést tartalmazó egymás alá rendezést állítja elő. Lehetővé teszi az illeszkedő bázisok számával mért résalkotási büntetés és résnagyobbítási büntetés alkalmazását. A GAP-nak hozzá kell adnia a résalkotási büntetést minden egyes inzertált rés esetében. Ha nullánál nagyobb résnagyobbítási büntetést választunk, ezenfelül a GAP-nak hozzá kell adnia minden egyes inzertéit rés esetében a rés hosszúságát szorozva a résnagyobbítási büntetéssel. Az alapértelmezett résalkotási büntetés és résnagyobbítási büntetés értékek a Wisconsin Genetics Software Package programcsomagban (Version 10) fehérjeszekvenciák esetében sorrendben 8 és 2. Nukleotidszekvenciák esetében az alapértelmezett résalkotási büntetés értéke 50, és az alapértelmezett résnagyobbítási büntetés értéke 3. A résalkotási és résnagyobbítási büntetést egész számként fejezhetjük ki a 0 és 200 közötti egész számok közül megválasztva. Ily módon a résalkotási és résnagyobbítási büntetés lehet 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,15, 20, 25, 30, 35,40,45, 50, 55, 60,65 vagy nagyobb.
A GAP a legjobb egymás alá rendezések családjának az egyik tagja. A családnak számos tagja lehet, de egyik másik tag sem jobb minőségű. A GAP négy értéket ad meg az egymás alá rendezésekre: Minőség, Arány, Azonosság és Hasonlóság. A Minőség a szekvenciák egymás alá rendezése érdekében maximalizált mérőszám. Az Arány a Minőség elosztva a rövidebb szegmensben található bázisok számával. A Százalékos azonosság az aktuálisan illeszkedő szimbólumok százaléka. A Százalékos hasonlóság a hasonló szimbólumok százaléka. A résekkel szemben lévő szimbólumokat nem vesszük figyelembe. Akkor értékeljük a hasonlóságot, ha az értékelési táblázatban található érték a szimbólumpár esetében nagyobb vagy egyenlő, mint 0,50, ami a hasonlósági küszöbérték. A Wisconsin Genetics Software Package programcsomagban (Version 10) található értékelési táblázat a BLOSUM62 [lásd Henikoff és Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89,10915. old. (1989)].
A találmány szerinti szekvenciákkal magas százalékos azonosságot mutató szekvenciafragmensek alatt értjük a találmány szerinti szabályozóelem azon fragmenseit is, amelyek egy működőképesen kapcsolt izolált nukleotidszekvencia éretlen címerben (korai virágzatban) preferált expressziójának elősegítésére hatnak. Ezek a fragmensek legalább körülbelül 20 összefüggő nukleotidot, előnyösebben legalább körülbelül 50 összefüggő nukleotidot, előnyösebben legalább körülbelül 75 összefüggő nukleotidot, még előnyösebben legalább körülbelül 100 összefüggő nukleotidot tartalmazhatnak a találmány szerinti promoter-nukleotidszekvenciából. Az ilyen fragmensek nukleotidjai általában tartalmazhatják az adott promoterszekvencia TATA felismerési szekvenciáját. Ilyen fragmenseket az alábbi módon állíthatunk elő: restrikciós enzimek alkalmazásával a találmány szerinti nukleotidszekvenciákban természetesen előforduló szabályozóelemek kihasítására, a természetben előforduló DNS-szekvenciából származó nukleotidszekvencia megszintetizálásával; vagy PCR-technológia alkalmazásával [lásd például Mullis és munkatársai, Methods Enzymol. 155, 335-350. old. (1987); és „PCR Technology”, szerk.: Erlich, kiad.: Stockton Press, New York (1989)]. Ezen fragmensek variánsai, mint például amelyek helyspecifikus mutagenezis eredményei, szintén a találmány szerinti készítmények közé tartoznak.
Az 1. vagy 2. azonosító szám szerinti szekvenciák legalább körülbelül 20 összefüggő szekvenciáját tartalmazó nukleotidszekvenciák is a találmány tárgyát képezik. Ezeket a szekvenciákat hibridizációval, PCR-rel és hasonlókkal izolálhatjuk. Ilyen szekvenciák közé tartoznak olyan fragmensek, amelyek éretlen címerben (korai virágzásban) preferált expressziót képesek irányítani, olyan fragmensek, amelyek hasznosak próbaként hasonló szekvenciák azonosítására, valamint időbeli vagy szöveti specifitásért felelős elemek.
A szabályozószekvenciák biológiailag aktív variánsai is a találmány szerinti készítmények közé tartoznak. Egy szabályozó-„variáns” egy szabályozószekvencia módosított formája, amelyben egy vagy több bázis módosítva lett, el lett távolítva, vagy hozzá lett adva. Például rutineljárás egy DNS-szekvencia egy részének eltávolítására exonukleáz alkalmazása DNSamplifikációval kombinálva, hogy unidirekcionális beágyazott deléciókat hozzunk létre kétszálú DNS-klónokban. Egy kereskedelmi forgalomban kapható reagenskészletet Exo-Size™ név alatt árusítanak (New England Biolabs, Beverly, Mass.). Röviden, ez az eljárás az alábbiakat foglalja magában: exonukleáz-lll-at inkubálunk DNS-sel, folyamatosan eltávolítva nukleotidokat 3-5’ irányban az 5' túlnyúló végeken, tompa végeken vagy a DNS-templátban található behasításoknál. Azonban az exonukleáz-lll nem képes nukleotidokat eltávolítani a 3’-végen található 4 bázisos túlnyúló végekről. Egy klón időzített emésztései ezzel az enzimmel unidirekcionális beágyazott deléciókat eredményeznek.
Szabályozószekvencia-variáns egy példája olyan promoter, amely egy vagy több delécióval alakul ki egy nagyobb promoterből. Egy promoter 5’-részletét egészen a TATA-boxig a transzkripciós iniciációs hely közelében deletálhatjuk anélkül, hogy megszüntetnénk a promoter aktivitását [Zhu és munkatársai, The Plánt Cell 7, 1681-1689. old. (1995)]. Az ilyen variánsok megtarthatják az aktivitásukat, különösen a képességüket az expresszió irányítására értetlen címerben (korai virágzás) vagy más ilyen szövetekben. Biológiailag aktív variánsok közé tartoznak például a találmány szerinti natív szabályozószekvenciák, amelyek egy vagy több nukleotidszubsztitúciót, -deléciót vagy -inzerciót tartalmaznak. Az aktivitást Northern-blot-elemzéssel, transzkripciós fúziókat alkalmazó riporter aktivitási mé6
HU 226 090 Β1 résekkel és hasonlókkal mérhetjük. Lásd például Sambrook és munkatársai, „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2. kiadás, kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989), amely hivatkozás útján a kitanítás részét képezi.
Az éretlen címerben (korai virágzás) preferált találmány szerinti szabályozóelemeket kódoló nukleotidszekvenciák, valamint azok variánsai és fragmensei alkalmazhatók bármilyen növény genetikai manipulálására, amikor működőképesen kapcsolva vannak egy izolált nukleotidszekvenciával, amelynek az expressziója szabályozandó kívánt fenotípusos válasz elérése érdekében. A „működőképesen kapcsolt kifejezés alatt azt értjük, hogy az izolált nukleinsavszekvencia transzkripciója vagy transzlációja a szabályozószekvencia hatása alatt áll. Ily módon a találmány szerinti szabályozóelemeket kódoló nukleinsavszekvenciákat expressziós kazettákban biztosíthatjuk a jelentőséggel bíró növényben, közelebbről a növény éretlen címerében (karai virágzatában) expresszálandó izolált nukleinsavszekvenciákkal együtt. Egy ilyen expressziós kazettát több restrikciós hellyel láthatunk el a nukleotidszekvencia inzertálása céljából, hogy az a szabályozóelemek transzkripciós szabályozása alatt legyen.
A találmány szerinti szabályozóelemek által expresszáltatott jelentőséggel bíró géneket a címerek és virágfejlődés megváltoztatására alkalmazhatjuk. Ezt endogén vagy exogén termékek expressziójának a megnövelésével érhetjük el a fejlődő kukoricacímerekben. Más megoldásképpen az eredményeket úgy érhetjük el, hogy csökkentjük egy vagy több endogén termék, különösen enzimek vagy kofaktorok expresszióját a fejlődő kukoricacímerben. Ezek a módosítások a transzformált növény fenotípusának a megváltozását eredményezik. Nyilvánvaló, hogy a szabályozóelemeket alkalmazhatjuk a natív kódolószekvenciáikkal együtt is, hogy növeljük vagy csökkentsük az expressziót, ami a transzformált növény fenotípusának megváltozását eredményezi.
Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány szerinti szabályozóelemeket szelektálható markerek kalluszpreferált expressziójára alkalmazhatjuk. Például olyan szabályozóelemek, mint például a Lec1 promoter és terminátor, lehetővé teszik olyan növény regenerálását, amelyek termesztés során nem herbicidrezisztensek, de amelyek teljesen érzékenyek a herbicidre a kalluszstádiumban.
A találmány szempontjából jelentőséggel bíró gének általános kategóriáiba tartoznak például azok a gének, amelyek információban játszanak szerepet, mint például cinkujjak; kommunikációban, mint például kinázok; és azok, amelyek az önfenntartásban játszanak szerepet, mint például a hősokkfehérjék. A transzgének specifikusabb kategóriáiba tartoznak olyan gének, amelyek mezőgazdasági, rovarrezisztenciai, betegségrezisztenciái, gyomirtó-rezisztenciái és magjellegzetességi sajátságokat kódolnak. A transzgének még további kategóriáiba tartoznak olyan gének, amelyek növényekből és más eukarióta, valamint prokarióta organizmusokból származó exogén termékek, mint például enzimek, kofaktorok és hormonok expresszióját indukálják. Nyilvánvaló, hogy bármely jelentőséggel bíró gén - beleértve a natív kódolószekvenciát is - működőképesen kapcsolható a találmány szerinti szabályozóelemekhez, és expresszáltatható a fejlődő kukoricacímer-szövetben.
Exogén termékek közé tartoznak növényi enzimek és termékek, valamint a más forrásokból - beleértve prokariótákat és más eukariótákat is - származók is. Ilyen termékek közé tartoznak enzimek, kofaktorok, hormonok és hasonlók.
A találmány szerinti szabályozóelemekhez működőképesen kapcsolt nukleotidszekvencia lehet egy célzott génre nézve antiszensz szekvencia. Az „antiszensz DNS nukleotidszekvencia” kifejezés alatt olyan szekvenciát értünk, amely fordított irányítottságú a nukleotidszekvencia 5-3’ normális irányítottságához viszonyítva. Amikor bejuttatjuk egy növényi sejtbe, az antiszensz DNS-szekvenciák expressziója megakadályozza a célzott gént kódoló DNS nukleotidszekvencia normális expresszióját. Az antiszensz nukleotidszekvencía olyan RNS-transzkriptumot kódol, amely komplementer a célzott gént kódoló DNS nukleotidszekvencia transzkripciója útján előállított endogén hírvivő RNS-sel (mRNS), és képes azzal hibridizálni. Ebben az esetben a célzott gén által kódolt natív fehérje termelődését gátoljuk a kívánt fenotípusos válasz elérése érdekében. Ily módon a találmány szerinti szabályozószekvenciák működőképesen kapcsolva lehetnek antiszensz DNS-szekvenciákhoz, hogy csökkentsük vagy gátoljuk a natív fehérje expresszióját a növényi címerben, vagy hogy szabályozzuk a fejlődést a címerben vagy a virágban.
Az expressziós kazetta tartalmazhat a jelentőséggel bíró izolált nukleotidszekvencia 3'-végén növényekben működőképes transzkripciós és transzlációs terminációs régiót is. A terminációs régió lehet natív a találmány szerinti promoter-nukleotidszekvenciához viszonyítva, lehet natív a jelentőséggel bíró DNS-szekvenciához viszonyítva, vagy másik forrásból származhat.
Kényelmes terminációs régiók hozzáférhetők az A. tumefaciens Ti-plazmidjain, mint például az oktopinszintáz és nopalin-szintáz terminációs régiók [lásd: Guerineau és munkatársai, Mól. Gén. Génét. 262, 141-144. old. (1991); Proudfoot, Cell 64, 671-674. old. (1991); Sanfacon és munkatársai, Genes Dev. 5, 141-149. old. (1991); Mogen és munkatársai, Plánt Cell 2, 1261-1272. old. (1990); Munroe és munkatársai, Gene 91, 151-158. old. (1990); Ballas és munkatársai, Nucleic Acids Rés. 17, 7891-7903. old. (1989); és Joshi és munkatársai, Nucleic Acid Rés. 15, 9627-9639. old. (1987)].
Az expressziós kazetták ezenfelül tartalmazhatnak 5' vezetőszekvenciákat is. Az ilyen vezetőszekvenciák fokozhatják a transzlációt. Transzlációs vezetőszekvenciák ismertek a szakterületen, és például közé tartoznak az alábbiak: pikornavírus vezetőszekvenciák, például EMCV vezetőszekvencia [Encaphalomyocarditis 5’ nemkódoló régió; Elroy-Stein és munkatársai,
HU 226 090 Β1
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6126-6130. old. (1989)]; Potyvirus vezetőszekvenciák, például TEV ['Tobacco Etch Vírus'; Allison és munkatársai, (1986)]; MDMV (’Maize Dwarf Mosaic Vírus') vezetőszekvencia Virology 154, 9-20. old.; humán immunglobulin nehézlánc-kötő fehérje (BiP) [Macejak és munkatársai, Natúré 353, 90-94. old. (1991)]; a lucerna-mozaikvírus burokfehérje mRNS-ének (AMV RNA 4) a nem transziáit vezetőszekvenciája [Jobling és munkatársai, Natúré 325, 622-625. old. (1987)]; dohány-mozaikvírus (TMV) vezetőszekvenciája [Gallie és munkatársai, Molecular Biology of RNA, 237-256. old. (1989)]; és a kukorica sápkóros foltosság vírusa (MCMV) vezetőszekvenciája [Lömmel és munkatársai, Virology 81, 382-385. old. (1991)]. Lásd még Della-Cioppa és munkatársai, Plánt Physiology 84, 965-968. old. (1987). A kazetta tartalmazhat továbbá olyan szekvenciákat is, amelyek fokozzák az mRNS transzlációját és/vagy stabilitását, mint például az intronok.
Azokban az esetekben, amikor előnyös az izolált nukleotidszekvencia által expresszált termék egy adott sejtszervecskébe - különösen plasztiszba, amiloplasztiszba vagy az endoplazmatikus retikulumba történő irányítása vagy a sejt felszínére vagy extracelluláris térbe történő szekretálása, az expressziós kazetta tartalmazhat továbbá tranzitpeptidet kódoló szekvenciát is. Ilyen tranzitpeptidek jól ismertek a szakterületen, nem korlátozó példáik közé tartozik az acil-karrier-fehérje tranzitpeptidje, a RUBISCO kis alegysége, a növényi EPSP-szintáz és hasonlók.
Az expressziós kazetta előállításához a különféle DNS-fragmenseket manipulálhatjuk oly módon, hogy a DNS-szekvenciákat a megfelelő irányítottságban - és adott esetben megfelelő olvasási fázisban - tartalmazzák. Ebből a célból adaptereket vagy kapcsolómolekulákat alkalmazhatunk a DNS-fragmensek összekapcsolására, vagy más manipulációt alkalmazhatunk kényelmes restrikciós helyek, a felesleges DNS eltávolítása, restrikciós helyek eltávolítása és hasonlók biztosítására. Erre a célra in vitro mutagenezis, láncindítóhelyreállítás, restrikciós emésztés, anneálás, újraszubsztitúció, mint például tranzíció és transzverzió alkalmazható.
Amint a leírásban kifejtjük, a találmány tárgyát olyan vektorok képezik, amelyek képesek jelentőséggel bíró gének expresszáltatására a szabályozóelemek szabályozása alatt. Általában a vektoroknak működniük kell növényi sejtekben. Esetenként előnyösek lehetnek olyan vektorok, amelyek működőképesek E. coliban (például fehérje termelése ellenanyagok termeltetéséhez, DNS-szekvencia-elemzés, inszertek előállítása, nagy mennyiségű nukleinsav előállítása). E. coliban történő klónozásra és expresszáltatásra szolgáló vektorokat és eljárásokat ismertetnek Sambrook és munkatársai (mint fent).
A találmány szerinti szabályozószekvenciákat egy expressziós kazettában izolált nukleotidszekvenciához működőképesen kapcsolva tartalmazó transzformációs vektor tartalmazhat legalább egy további nukleotidszekvenciát is, amely az organizmusba együtt transzformálandó gént kódol. Más megoldásképpen a további szekvenciá(ka)t egy másik transzformációs vektoron biztosíthatjuk.
A növényekben működőképes vektorok Agrobacteriumbó\ származó bináris plazmidok lehetnek. Ilyen vektorok képesek növényi sejtek transzformálására. Ezek a vektorok olyan bal oldali és jobb oldali határolószekvenciákat tartalmaznak, amelyek szükségesek a gazda (növény) kromoszómájába történő integrációhoz. Ezen határolószekvenciák között minimálisan megtalálható az expresszálandó gén a találmány szerinti szabályozóelemek szabályozása alatt. Egy megvalósítási mód szerint szelektálható markert és jelzőgént is alkalmazunk. A megfelelő mennyiségű vektor előállításának megkönnyítése érdekében E. coliban való replikációt lehetővé tevő bakteriális origót is alkalmazhatunk.
Jelzőgéneket is alkalmazhatunk a transzformációs vektorokon. Az alkalmas jelzőgének ismertek a szakterületen, és az alábbi irodalmi helyeken találhatók meg: Jefferson és munkatársai, „Plánt Molecular Biology Manual, 1-33. old., szerk.: Gelvin és munkatársai, kiad.: Kluwer Academic Publishers (1991); DeWet és munkatársai, Mól. Cell. Bioi. 7, 725-737. old. (1987); Goff és munkatársai, EMBO J. 9, 2517-2522. old. (1990); Kain és munkatársai, BioTechniques 19, 650-655. old. (1995); és Chiu és munkatársai, Current Biology 6, 325-330. old. (1996).
A transzformációs vektorokon alkalmazhatunk a transzformált sejtek vagy szövetek szelekciójára szolgáló szelektálható markereket is. Ezek közé olyan gének tartoznak, amelyek antibiotikumrezisztenciát vagy herbicidrezisztenciát okoznak. A megfelelő szelektálható markerek nem korlátozó példái közé tartoznak az alábbi rezisztenciákat kódoló gének: kloramfenikol [Herrera Estrella és munkatársai, EMBO J. 2, 987-992. old. (1983)]; metotrexát [Herrera Estrella és munkatársai, Natúré 303, 209-213. old. (1983); Meijer és munkatársai, Plánt Mól. Bioi. 16, 807-820. old. (1991)]; higromicin [Waldron és munkatársai, Plánt Mól. Bioi. 5, 103-108. old. (1985); Zhijian és munkatársai, Plánt Science 108, 219-227. old. (1995)]; sztreptomicin [Jones és munkatársai, Mól. Gén. Génét. 210, 86-91. old. (1987)]; spektinomicin [Bretagne-Sagnard és munkatársai, Transgenic Rés. 5, 131-137. old. (1996)]; bleomicin [Hille és munkatársai, Plánt Mól. Bioi. 7, 171-176. old. (1990)]; szulfonamid [Guerineau és munkatársai, Plánt Mól. Bioi. 15,127-136. old. (1990)]; bromoxinil [Stalker és munkatársai, Science 242, 419-423. old. (1988)]; glifozát [Shaw és munkatársai, Science 233, 478-481. old. (1986)]; foszfinotricin [DeBlock és munkatársai, EMBO J. 6, 2513-2518. old. (1987)].
A transzgenikus események felismerésében hasznos, de egyébként a végtermékben nem szükséges egyéb gének nem korlátozó példái közé tartoznak az alábbiak: GUS (β-glukoronidáz) [Jefferson, Plánt Mól. Bioi. Rep. 5, 387. old. (1987)]; GFP (zöld fluoreszcens fehérje) [Chalfie és munkatársai, Science 263, 802. old. (1994)]; luciferáz [Teeri és munkatársai, EMBO J.
HU 226 090 Β1
8, 343. old. (1989)]; és az antomicintermelést kódoló kukoricagének [Ludwig és munkatársai, Science 247, 449. old. (1990)].
A találmány szerinti szabályozószekvenciákat jelentőséggel bíró izolált nukleotidszekvenciákhoz működőképesen kapcsolva tartalmazó transzformációs vektort alkalmazhatjuk bármilyen növény transzformálására. Ily módon genetikailag módosított növényeket, növényi sejteket, növényi szövetet, magot és hasonlókat állíthatunk elő. A transzformációs protokollok változhatnak a transzformációra kiválasztott növény vagy növényi sejt típusától függően, azazhogy az egyszikű vagy kétszikű. Növényi sejtek transzformálására alkalmas eljárások közé tartoznak az alábbiak: mikroinjekció [Crossway és munkatársai, Biotechniques 4, 320-334. old. (1986)]; elektroporáció [Riggs és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 5602-5606. old. (1986)]; Agroőacferíum-közvetített transzformáció [lásd például az 5 563 055 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (Townsend és munkatársai)]; közvetlen génátvitel [Paszkowski és munkatársai, EMBO J 3, 2717-2722. old. (1984)]; és ballisztikus részecskegyorsítás [lásd például a 4 945 050 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (Sanford és munkatársai); Tömés és munkatársai, „Plánt Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods”, szerk.: Gamborg és Phillips, kiad.: SpringerVerlag, Berlin (1995); és McCabe és munkatársai, Biotechnology 6, 923-926. old. (1988)]. Lásd még Weissinger és munkatársai, Annual Rév. Génét. 22, 421-477. old. (1988); Sanford és munkatársai, Particulate Science and Technology 5, 27-37. old. (1987) (hagyma); Christou és munkatársai, Plánt Physiol. 87, 671-674. old. (1988) (szója); McCabe és munkatársai, Bio/Technology 6, 923-926. old. (1988) (szója); Datta és munkatársai, Biotechnology 8, 736-740. old. (1990) (rizs); Klein és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 4305-4309. old. (1988) (kukorica); Klein és munkatársai, Biotechnology 6, 559-563. old. (1988) (kukorica); Klein és munkatársai, Plánt Physiol. 91, 440-444. old. (1988) (kukorica); Fromm és munkatársai, Biotechnology 8, 833-839. old. (1990); HooydaasVan Slogteren és munkatársai, Natúré (London) 311, 763-764. old. (1984); Bytebier és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 5345-5349. old. (1987) (Liliaceae); De Wet és munkatársai, „The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, 197-209. old., szerk.: Chapman, G. P. és munkatársai, kiad.: Longman, New York (1985) (pollen); Kaeppler és munkatársai, Plánt Cell Reports 9, 415-418. old. (1990); és Kaeppler és munkatársai, Theor. Appl. Génét. 84, 560-566. old. (1992) (címerközvetített transzformáció); D'Halluin és munkatársai, Plánt Cell 4, 1495-1505. old. (1992) (elektroporáció); Li és munkatársai, Plánt Cell Reports 12, 250-255. old. (1993) és Christou és munkatársai, Annals of Botany 75, 407-413. old. (1995) (rizs); Osjoda és munkatársai, Natúré Biotechnology 14, 745-750. old. (1996) (kukorica Agrobacterium tumefaciens útján); amelyek kitanítása hivatkozás útján a kitanítás részét képezi.
A transzformált sejteket hagyományos módszerek alkalmazásával növényekké nevelhetjük [lásd például McCormick és munkatársai, Plánt Cell Reports 5, 81-84. old. (1986)]. Ezeket a növényeket azután felnevelhetjük és megtermékenyíthetjük ugyanazzal a transzformált törzzsel vagy különböző törzsekkel. Azután azonosíthatjuk a kívánt fenotípusos tulajdonságot éretlen címerben (korai virágzásban) preferáltan expresszáló kapott hibridet. Két vagy több generációt felnevelhetünk, hogy biztosítsuk azt, hogy a kívánt fenotípusos tulajdonság éretlen címerben (korai virágzásban) preferált expressziója stabilan fennmarad és öröklődik.
Az alábbiak példákban a találmányt részletesebben is bemutatjuk, azonban az oltalmi kört nem kívánjuk a bemutatott megvalósítási módokra korlátozni.
Szabadalmi példák
A találmány szerinti szabályozórégiókat izoláltuk kukoricanövényekből és megklónoztuk. A géneket éretlen címerben (korai virágzatban) preferált szabályozórégiókként szelektáltuk ki a megfelelő géntermékek térbeli expressziója alapján. Az izolálásuk módszerét az alábbiakban ismertetjük.
1. példa: Promoterszekvenciák izolálása genomséta eljárás alkalmazásával Genomiális DNS izolálása
A kukorica AP-1-szerű génjeinek kódolószekvenciájától leolvasással ellentétes irányban található genomiális DNS-t izoláltuk a Universal GenomeWalker Kit reagenskészlet (CLONTECH, Palo Alto, CA) alkalmazásával.
Northern-blot
RNS-t izoláltunk négyhetes magoncok hajtásából a TriZol eljárás (Invitrogen, Carlsbad, CA) alkalmazásával. 15 pg össz-DNS-t elválasztottunk 1% agarózMOPS-formaldehid géleken, és Hybond-N+ membránra (Amersham) blottoltuk azokat. DNS-próbákat jelöltünk meg RediPrimell reagenskészlet (Amersham) alkalmazásával, és hibridizáltuk a membránhoz ExpressHyb (CLONTECH, Palo Alto, CA) pufferben 65 °C-on éjszakán keresztül. A membránokat kétszer megmostuk 2*SSC, 0,1% SDS pufferben szobahőmérsékleten, és kétszer 0,1*SSC, 0,1% SDS pufferben 50 °C-on. A membránokat autoradiografáltuk a hibridizációs szignálok megjelenítésére.
Eredmények
Kukorica AP-1 -szerű génjének az expressziójának a Northern-elemzése vad típusú növényben (W22), W22 növényben, amelybe a teozint 1L kromoszóma van beépítve (T1L), W22 növényben, amelybe a teozint 1L és 3L kromoszóma van beépítve (T1L3L), Tb1/tb1-mum3 heterozigóta (hét) és tb1-mum3 homozigóta (tb1). Mindegyik W22 hátterű.
2. példa
Előállítottunk egy plazmidot, amely tartalmazza a találmány szerinti AP-1-szerű promotert, és azt bemutatjuk a 2. azonosító számú szekvencián.
Claims (16)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Izolált szabályozóelem, amely képes transzkripció irányítására éretlen címerben (korai virágzatban) preferált módon, amely szabályozóelem az alábbi nukleotidszekvenciák bármelyikét tartalmazza:a) az 1. azonosító számú szekvencia vagy a 2. azonosító számú szekvencia 331-2527. bázisai szerinti nukleotidszekvencia;b) az 1. azonosító számú szekvenciához vagy a 2. azonosító számú szekvencia 331-2527. bázisaihoz erősen sztríngens körülmények között hibridizáló szekvencia;c) az 1. azonosító számú szekvenciával vagy a 2. azonosító számú szekvencia 331-2527. bázisaival legalább 65% szekvenciaazonosságú szekvencia, ahol a szekvenciaazonosság GAP (version 10) elemzéssel van meghatározva az alapértelmezett paraméterek alkalmazásával; ésd) az 1. vagy 2. azonosító számú szekvenciák legalább 100 nukleotidját tartalmazó szekvencia.
- 2. Expressziós kazetta, amely egy további nukleotidszekvenciához működőképesen kapcsolt 1. igénypont szerinti szabályozóelemet tartalmaz.
- 3. A 2. igénypont szerinti expressziós kazetta, amelyben a további szekvencia gén.
- 4. A 2. igénypont szerinti expressziós kazetta, amelyben a további nukleotidszekvencia célzott gén elleni antiszensz szekvencia.
- 5. A 2. vagy 3. igénypont szerinti expressziós kazetta, amelyben a további nukleotidszekvencia zsírsavszintézisben szerepet játszó génterméket vagy javított aminosavtartalmú génterméket kódol.
- 6. Transzformációs vektor, amely 2-5. igénypontok bármelyike szerinti expressziós kazettát tartalmaz.
- 7. Növény, amely 2-5. igénypontok bármelyike szerinti expressziós kazettát tartalmaz.
- 8. A 7. igénypont szerinti növény, amely egyszikű.
- 9. A 8. igénypont szerinti növény, amely kukorica, búza, rizs, árpa, cirok vagy rozs.
- 10. A 7-9. igénypontok bármelyike szerinti növény magja, amely 2-5. igénypontok bármelyike szerinti expressziós kazettát tartalmaz.
- 11. Eljárás nukleotidszekvencia szelektív expresszáltatására növény éretlen címerében, azzal jellemezve, hogy növényi sejtet 6. igénypont szerinti transzformációs vektorral transzformálunk.
- 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan szabályozóelemet alkalmazunk, amely képes a további nukleotidszekvencia tranziens expressziójának iniciálására kalluszszövetben.
- 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy továbbá stabilan transzformált növényt regenerálunk a transzformált növényi sejtből; ahol a további nukleotidszekvencia expressziója megváltoztatja a növény éretlen címerének a fenotípusát.
- 14. Növényi sejt, amely 2-5. igénypontok bármelyike szerinti expressziós kazettát tartalmaz.
- 15. A 14. igénypont szerinti növényi sejt, amelyben a növényi sejt egyszikű növényből származik.
- 16. A 15. igénypont szerinti növényi sejt, amely kukoricából, búzából, rizsből, árpából, cirokból vagy rozsból származik.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US36406502P | 2002-03-13 | 2002-03-13 | |
| PCT/US2003/007861 WO2003078590A2 (en) | 2002-03-13 | 2003-03-13 | Early inflorescence-preferred regulatory elements and uses thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP0600155A2 HUP0600155A2 (en) | 2006-05-29 |
| HU226090B1 true HU226090B1 (en) | 2008-04-28 |
Family
ID=28041866
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0600155A HU226090B1 (en) | 2002-03-13 | 2003-03-13 | Early inflorescence-preferred regulatory elements and uses thereof |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20040025206A1 (hu) |
| EP (1) | EP1490496B1 (hu) |
| AT (1) | ATE452980T1 (hu) |
| AU (1) | AU2003218155B2 (hu) |
| CA (1) | CA2478969C (hu) |
| DE (1) | DE60330653D1 (hu) |
| ES (1) | ES2336550T3 (hu) |
| HU (1) | HU226090B1 (hu) |
| MX (1) | MXPA04008897A (hu) |
| NZ (1) | NZ535289A (hu) |
| WO (1) | WO2003078590A2 (hu) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BRPI0411874A (pt) | 2003-06-23 | 2006-08-08 | Pionner Hi Bred International | potencial de staygreen controlado em plantas por gene simples obtido por engenharia genética |
| MX2010005565A (es) | 2007-11-20 | 2010-06-11 | Pioneer Hi Bred Int | Genes de señalizacion de etileno en maiz y su modulacion para mejor tolerancia al estres en plantas. |
| US8431775B2 (en) | 2008-12-04 | 2013-04-30 | Pioneer Hi Bred International Inc | Methods and compositions for enhanced yield by targeted expression of knotted1 |
| WO2016000237A1 (en) | 2014-07-03 | 2016-01-07 | Pioneer Overseas Corporation | Plants having enhanced tolerance to insect pests and related constructs and methods involving insect tolerance genes |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6002069A (en) * | 1996-06-05 | 1999-12-14 | The Regents Of The University Of California | Seed plants exhibiting inducible early reproductive development and methods of making same |
| US6025483A (en) * | 1996-06-05 | 2000-02-15 | The Regents Of The University Of California | Maize and cauliflower apetalai gene products and nucleic acid molecules encoding same |
| ATE309362T1 (de) * | 1998-08-20 | 2005-11-15 | Pioneer Hi Bred Int | Samen-bevorzugende promotoren |
| AU1211600A (en) * | 1998-10-16 | 2000-05-08 | Regents Of The University Of California, The | Methods of suppressing flowering in transgenic plants |
-
2003
- 2003-03-13 US US10/387,937 patent/US20040025206A1/en not_active Abandoned
- 2003-03-13 ES ES03714146T patent/ES2336550T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-03-13 WO PCT/US2003/007861 patent/WO2003078590A2/en not_active Application Discontinuation
- 2003-03-13 AU AU2003218155A patent/AU2003218155B2/en not_active Ceased
- 2003-03-13 CA CA002478969A patent/CA2478969C/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-03-13 HU HU0600155A patent/HU226090B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2003-03-13 NZ NZ535289A patent/NZ535289A/xx not_active IP Right Cessation
- 2003-03-13 MX MXPA04008897A patent/MXPA04008897A/es active IP Right Grant
- 2003-03-13 EP EP03714146A patent/EP1490496B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-03-13 AT AT03714146T patent/ATE452980T1/de not_active IP Right Cessation
- 2003-03-13 DE DE60330653T patent/DE60330653D1/de not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2478969A1 (en) | 2003-09-25 |
| MXPA04008897A (es) | 2004-11-26 |
| EP1490496B1 (en) | 2009-12-23 |
| WO2003078590A3 (en) | 2004-08-12 |
| ES2336550T3 (es) | 2010-04-14 |
| CA2478969C (en) | 2010-03-02 |
| HUP0600155A2 (en) | 2006-05-29 |
| WO2003078590A2 (en) | 2003-09-25 |
| EP1490496A4 (en) | 2005-12-21 |
| NZ535289A (en) | 2006-03-31 |
| US20040025206A1 (en) | 2004-02-05 |
| AU2003218155B2 (en) | 2008-02-21 |
| EP1490496A2 (en) | 2004-12-29 |
| DE60330653D1 (de) | 2010-02-04 |
| AU2003218155A1 (en) | 2003-09-29 |
| ATE452980T1 (de) | 2010-01-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2429697C (en) | Seed-preferred regulatory elements and uses thereof | |
| US6403862B1 (en) | Seed-preferred promoter from maize | |
| US6407315B1 (en) | Seed-preferred promoter from barley | |
| US20130227742A1 (en) | Ubiquitin regulatory elements | |
| US20060272058A1 (en) | Seed preferred regulatory elements | |
| US7211712B2 (en) | Seed-preferred regulatory elements | |
| US7700836B2 (en) | Seed-preferred regulatory elements | |
| US6921815B2 (en) | Cytokinin Oxidase Promoter from Maize | |
| US6452069B1 (en) | SF3 promoter and methods of use | |
| US8044263B2 (en) | Cytokinin oxidase promoter from maize | |
| US20100037347A1 (en) | Seed-Preferred Regulatory Elements | |
| EP1490496B1 (en) | Early inflorescence-preferred regulatory elements and uses thereof | |
| US7560612B2 (en) | Early-inflorescence-preferred regulatory elements and uses thereof | |
| AU2003218155A2 (en) | Early inflorescence-preferred regulatory elements and uses thereof | |
| US20110016580A1 (en) | Cell Division and Proliferation Preferred Regulatory Elements and Uses Thereof | |
| JP2004534535A (ja) | 新規の植物プロモーター | |
| CA2389759A1 (en) | Seed-preferred promoter from barley |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |