CN103305454A - 天山雪莲细胞培养生产紫丁香苷、绿原酸和1,5-二咖啡酰奎尼酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种通过天山雪莲细胞培养同时大规模生产和制备紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸三种活性成分的方法，包括摇瓶悬浮培养和生物反应器培养方式的应用以及培养细胞中三种成分的分离制备工艺。本发明为以上三种药用活性成分的生产提供了新方法，可为临床药用提供充足的资源；另外，在实现天山雪莲活性成分的无害、无污染及低成本规模化生产的同时又能对珍稀的野生植物资源起到保护的作用，有效缓解资源危机。

Description

天山雪莲细胞培养生产紫丁香苷、绿原酸和1,5-二咖啡酰奎尼酸的方法

技术领域

本发明涉及一种通过天山雪莲细胞培养生产药用活性成分紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸，并通过色谱技术分别制备三种活性成分的方法。 

背景技术

植物细胞具有全能性，一个植物细胞具有与亲本植物完全相同的遗传信息，不但具有发育成完整植株的能力，并且具有整株植物所具有的合成化合物的能力，通过植物细胞培养可以获得亲本植物的主要药用活性成分，这也就为药用活性成分的生产提供了新的途径。 

天山雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kir.)，又名新疆雪莲，大苞雪莲，系菊科凤毛菊属多年生草本植物，是一种极有开发和利用价值的民族药。雪莲在医药上应用已有数百年的历史，早在八世纪藏族古代药物文献《月王药珍》就有雪莲的记载，在清代，赵学敏所著的《本草纲目拾遗》一书中更把天山雪莲奉为雪莲药材的正品。现代药理研究表明，天山雪莲主要具有抗炎镇痛、抗癌、抗早孕、抗衰老、抗疲劳以及治疗糖尿病等多种药理作用。 

由于长期以来对雪莲的掠夺性采挖，加上自然环境中种子发芽率低，繁殖困难，生长缓慢，野生天山雪莲已处于濒危的境地，属国家二级濒危保护植物。野生天山雪莲资源已难以满足临床药用开发的需要，植物组织细胞培养等生物技术手段的发展可为解决这一问题提供切实可行的途径。 

据报道紫丁香苷具有抗炎镇痛^[2]、抗高血糖^[3]、抗抑郁^[4]及抗癌^[5]活性；绿原酸具有抗炎^[6]、抗高血糖^[7]和抗乙型肝炎病毒作用^[8]；1，5-二咖啡酰奎尼酸具有抗氧化^[9]治疗糖尿病^[10]和抗艾滋病^[11][12]作用，作为新型抗艾滋病药物已进入临床研究阶段。综上所述，紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸具有多种药用活性，具有重要应用价值，除绿原酸在菊科、忍冬科植物中分布较广、含量较高外，其他两种物质在植物中分布少、含量低，且同时生产三种物质的植物更是少见。紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸均为野生天山雪莲所具有的活性成分，但含 量低^[13]，利用天山雪莲细胞培养生产该三种成分具有良好的前景。 

植物细胞培养是获取活性目标产物(或中间体)的有效途径，如已报道的有通过水母雪莲(Saussurea medusa Maxim)细胞培养制备紫丁香苷^[14]、通过西藏雪莲细胞培养生产雪莲黄酮^[15]。但是现有技术中没有公开通过细胞培养同时制备生产紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸三种活性成分的方法。 

参考文献 

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发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种高效制备制备紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸三种活性成分的方法。 

为解决本发明的技术问题，本发明采用如下的技术方案：即天山雪莲细胞培养并同时大规模生产和制备紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸三种活性成分，包括细胞悬浮培养和生物反应器培养的应用，以及从培养细胞中高效分离制备三种成分，为最终实现通过天山雪莲细胞培养生产以上三种活性成分的工业化生产。 

为实现以上目的，本发明采用以下技术方案： 

1，采用来自天山雪莲的外植体诱导产生离体组织细胞，所用培养基为MS培养基； 

由来源于野生天山雪莲植株、再生苗或种子萌发后的无菌苗的组织器官为外植体诱导产生离体组织细胞，所用的培养基选自MS固体培养基，优选使用诱导培养基，所述的诱导培养基为附加植物激素NAA(α-Naphthalene acetic acid，α-萘乙酸)、6-BA(6-Benzyl aminopurine，6-苄基嘌呤)和2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)的MS固体培养基； 

优选的外植体所述的选自叶片、子叶、根、茎、胚轴、胚芽； 

优选的α-萘乙酸的浓度范围是0.1～10.0mg·L^-1、6-苄基嘌呤的浓度范围是0.1～10.0mg·L^-1、2，4-二氯苯氧乙酸的浓度范围是0.1～10.0mg·L^-1。 

2，离体组织细胞在同样组成的培养基中继代培养，经筛选得到高产紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸三种目标成分的天山雪莲组织细胞系； 

继代培养选用生长状态较好的疏松、浅黄色组织细胞为种子，培养过程无需光照，常温下培养，结合次生代谢成分分析筛选培养1年以上，得到高产紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸的天山雪莲细胞系。 

3，高产紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸的天山雪莲细胞悬浮体系的建立 

将筛选得到的高产紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸的天山雪莲细胞系转入液体培养基中进行摇瓶悬浮培养，具体为：以培养瓶为培养容器，采用摇床旋转振荡培养，接种量为1～20g细胞干重每升培养基，黑暗条件下进行悬浮培养。每7d～15d继代1次，3～4代后建立起稳定、高产的天山雪莲悬浮细胞培养体系。 

4，天山雪莲细胞悬浮体系的代谢调控以大量生产活性成分紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸 

为进一步提高天山雪莲组织细胞悬浮体系生产紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸的能力以达到规模化生产的要求，采用了黑暗培养、提高培养基碳源浓度、添加苯丙素类物质合成前体L-苯丙氨酸(L-phenylalanine)和添加诱导子茉莉酸甲酯(methyl jasmonate)的策略。 

具体为采用MS液体培养基，并附加如下物质 

0.1～10.0mg·L^-1NAA，优选0.5～2.0mg·L^-1； 

0.1～10.0mg·L^-16-BA，优选0.5～2.0mg·L^-1； 

0.1～10.0mg·L^-12，4-D，优选0.5～2.0mg·L^-1； 

20～2000mg·L^-1L-苯丙氨酸，优选200～1000mg·L^-1； 

1％～20％蔗糖，优选2％～10％； 

在培养过程中添加10～500mg·L^-1茉莉酸甲酯，优选30～500mg·L^-1。 

5，生物反应器用于天山雪莲细胞培养及紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸的生产 

为适应规模化放大生产的要求，在采用摇瓶悬浮培养的同时采用气升或搅拌动力生物反应器对天山雪莲细胞进行培养。培养基组成同悬浮培养所用培养基； 

0.1～10.0mg·L^-1NAA，优选0.5～2.0mg·L^-1； 

0.1～10.0mg·L^-16-BA，优选0.5～2.0mg·L^-1； 

0.1～10.0mg·L^-12，4-D，优选0.5～2.0mg·L^-1； 

20～2000mg·L^-1L-苯丙氨酸，优选200～1000mg·L^-1； 

1％～20％蔗糖，优选2％～10％； 

在培养过程中添加10～500mg·L^-1茉莉酸甲酯，优选30～500mg·L^-1。 

反应器工作体积40％～80％，优选50％～70％； 

接种量1～20g·L^-1，优选3～10g·L^-1； 

通气量50～1000mL·min^-1，优选100～500mL·min^-1； 

转速0～200rpm，优选50～150rpm， 

并添加二甲基硅类消泡剂0～10mL·L^-1，优选2～5mL·L^-1。 

6，天山雪莲培养细胞中紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸的提取及分离纯化 

绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸为多羟基酚酸类物质，并且在自然界中多伴同多种异构体或类似物存在，分离纯化难度较大，文献报道多在酸性溶剂中进行分离纯化，过程繁琐；虽然紫丁香苷色谱表现较佳，但在反相分离填料中很难与绿原酸分离。 

本发明的发明人经反复摸索，灵活运用多种色谱手段，确定了从天山雪莲培养细胞中简便高效制备紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸的方法。 

具体为：干燥培养细胞经20～80％的醇溶液提取，减压回收溶剂，加适量水分散，采用大孔树脂吸附，乙醇梯度洗脱，可以得到富集不同物质的多个流份。富含紫丁香苷和绿原酸的流份，采用硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇系统洗脱，分别得到活性成分紫丁香苷和绿原酸，经以上步骤得到的两种成分纯度均可达80％以上，再经制备型反向高效液相色谱纯化可使纯度达98％以上；富含1，5-二咖啡酰奎尼酸 的大孔树脂洗脱流份，采用硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇系统洗脱，得到纯度达80％以上的1，5-二咖啡酰奎尼酸，再经Sephadex LH-20凝胶柱纯化，甲醇洗脱，可得到纯度达98％以上的1，5-二咖啡酰奎尼酸。 

有益技术效果 

本发明与已有技术相比较有以下显著创新点及优点： 

(1)虽有利用水母雪莲细胞生产紫丁香苷的报道，但利用天山雪莲细胞同时生产紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸的研究尚未见报道，具创新性。 

(2)通过植物细胞培养的方法生产高附加值的药用活性成分紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸，相对化学合成缩短了合成和分离的工艺流程，利用生物体内酶反应的特异性避免了合成过程中多种异构体等副产物的生成，后续制备方便。 

(3)从细胞系的筛选到活性成分的生产采用了生长环境控制和代谢调控的技术手段，所得天山雪莲细胞系稳定、生长周期短、分散性好、紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸生产能力强，质量稳定可控，同时采用了摇瓶悬浮培养和反应器培养两种培养技术，可适应不同条件下的规模化生产。 

(4)通过植物细胞培养的方法生产药用活性成分，不占用耕地，不受地理位置和季节等的限制，不受病虫害的影响，不破坏生态环境，资源可持续利用。另外，避免了野生资源的大量采挖，可以对珍贵的野生天山雪莲资源起到保护的作用，有效缓解资源危机，同时满足临床用药的需求。 

(5)本发明为紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸三种药用活性成分的生产提供了新方法，可为临床药用提供充足的资源。 

(6)本发明的方法实现了制备天山雪莲活性成分的无害、无污染、低成本、规模化。 

术语和简称 

NAA：α-萘乙酸； 

6-BA：6-苄基嘌呤； 

2，4-D：4-二氯苯氧乙酸 

附图说明

图1由无菌苗的叶片或胚轴诱导得到离体组织细胞 

图2高产紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸的天山雪莲愈伤培养细胞系 

图3高产紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸的天山雪莲悬浮培养细胞系 

图4紫丁香苷(syringin)、绿原酸(chlorogenic acid)和1，5-二咖啡酰奎尼酸(1，5-dicaffeoylquinic acid)的HPLC色谱图和UV吸收光谱图 

图5天山雪莲悬浮培养细胞、愈伤组织以及天山雪莲药材中紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸含量的对比(A：悬浮培养细胞；B：愈伤组织；C：药材；D：标准品) 

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面的实施例仅用来进一步说明本发明，但并不意味着对本发明的任何限制。 

除另有说明，本文所使用的科技术语与本发明所属领域技术人员通常理解的含义相同。本文提供所述在本申请的申请日之前公开的发表物仅为了更好描述本发明，不应理解为承认其在先发明而使本发明不具优先资格。实施本发明也可采用类似或等效于本文所述内容的任何方法和材料，本文描述了具体的实施方式和优选的方法和材料，不旨在对本发明进行限制，本发明范围仅受所附权利要求书的限制。 

实施例1，高产紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸的天山雪莲细胞系的筛选 

由来源于野生天山雪莲植株、再生苗或种子萌发后的无菌苗的组织器官为外植体，优选种子萌发后的无菌苗叶片或胚轴，诱导产生离体组织细胞，诱导培养基为附加0.1～2.0mg·L^-1NAA、0.1～2.0mg·L^-16-BA和0.1～2.0mg·L^-12，4-D的激素组合，并在同样组成的培养基中继代培养以筛选高产细胞系。继代培养选用生长状态较好的疏松、浅黄色组织细胞为种子，培养全程在黑暗下进行，每10d继代1次，结合次生代谢成分分析筛选培养1年以上，得到高产紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸的天山雪莲细胞系，该细胞系现保存于中国医学科学院药 物研究所卫生部天然药物生物合成重点实验室，编号为IMM-SI-2011。 

筛选培养基的配制：采用MS培养基(组成见表1)附加0.1～2.0mg·L^-1NAA、0.1～2.0mg·L^-16-BA、0.1～2.0mg·L^-12，4-D、3％蔗糖和0.5％琼脂，用1mol·L^-1的NaOH或HCl调pH值为5.6～6.0，边搅拌边加热至琼脂完全溶化，然后分装于250mL培养瓶中，每瓶培养基装量为50mL，在121℃，0.15MP高压灭菌15min，经放置待琼脂固化并冷却至室温后制成固体培养基。 

表1MS培养基组成 

实施例2，高产紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸的天山雪莲细胞悬浮体系的建立 

将筛选得到的高产紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸的天山雪莲细胞系转入液体培养基中进行摇瓶悬浮培养，以500mL培养瓶为培养容器，采用摇床旋转振荡培养，摇床转速为80～140r·min^-1，接种量为5～10g细胞干重每升培养基，黑暗条件下进行悬浮培养。每8d～10d继代1次，3～4代后建立起稳定的高产紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸的天山雪莲悬浮细胞培养体系，该悬浮体系细胞呈颗粒性，分散性好，生长迅速，每升培养基生物量可达到25g～30g细胞干重。 

悬浮培养培养基的配制：采用MS培养基附加0.1～2.0mg·L^-1NAA、0.1～2.0mg·L^-16-BA和0.1～2.0mg·L^-12，4-D的激素组合，并附加3％～8％蔗糖，用1mol·L^-1的NaOH或HCl调pH值为5.6～6.0，然后分装于500mL培养瓶中，每瓶培养基装量为125mL，在121℃，0.1～0.15MPa高压灭菌15min，经放置冷却至室温后制成液体培养基。 

实施例3，天山雪莲细胞悬浮体系用于大量生产紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖 啡酰奎尼酸 

通过在培养初期添加苯丙素类物质合成前体L-苯丙氨酸，以及在培养过程中添加诱导子茉莉酸甲酯的方法来提高天山雪莲细胞生产紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸的能力。 

生产培养基的配制及培养方法：活性成分的生产采用附加0.1～2.0mg·L^-1NAA、0.1～2.0mg·L^-16-BA和0.1～2.0mg·L^-12，4-D的激素组合，并附加3％～8％蔗糖，在培养的第4d～8d添加10～100mg·L^-1茉莉酸甲酯，培养第12d～14d收获，每升培养基生物量可达21g～26g，经HPLC分析紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸产量分别达到500～700mg·L^-1、300～400mg·L^-1和700～900mg·L^-1。 

实施例4，反应器培养用于天山雪莲细胞生产紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸 

采用气升-搅拌混合动力反应器对天山雪莲悬浮细胞进行培养生产紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸。 

反应器培养生产培养基及培养方法：采用附加附加0.1～2.0mg·L^-1NAA、0.1～2.0mg·L^-16-BA和0.1～2.0mg·L^-12，4-D的激素组合，并附加3％～8％蔗糖，在培养的第4d～8d添加10～100mg·L^-1茉莉酸甲酯，反应器工作体积50～60％，接种量5～10g·L^-1，通气量200～600mL·min^-1、转速50～100rpm，并添加二甲基硅类消泡剂0.2～4.0mL·L^-1，培养第10d～12d收获。每升产细胞干重可达19g～21g，紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸产量分别可达80～100mg·L^-1、200～250mg·L^-1和250～350mg·L^-1。 

实施例5，培养细胞中紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸的提取、分离制备方法 

减压抽滤分离获取培养细胞，55℃烘干至恒重，干燥细胞培养物经甲醇水溶液提取，优选2倍量50～80％的甲醇超声提取3～5次，每次1h，减压回收溶剂，加适量水分散，采用大孔树脂吸附，乙醇梯度洗脱，各流份用HPLC分析；合并主要含紫丁香苷和绿原酸的流份，采用1.5～2倍量硅胶拌样，4倍量硅胶装柱，减压柱色谱分离，氯仿-甲醇系统洗脱，合并氯仿∶甲醇＝10∶1～8∶1部分流份，减 压回收溶剂，得活性成分紫丁香苷，合并氯仿∶甲醇＝5∶1～2∶1部分流份，减压回收溶剂，得活性成分绿原酸，经以上步骤得到的两种成分纯度均可达80％以上，如再经制备型反向高效液相色谱纯化可使纯度达98％以上；主要含1，5-二咖啡酰奎尼酸的大孔树脂洗脱流份采用1.5～2倍量硅胶拌样，4倍量硅胶装柱，减压柱色谱分离，氯仿-甲醇系统洗脱，合并氯仿∶甲醇＝5∶1～2∶1部分流份，减压回收溶剂，得到纯度达80％以上的1，5-二咖啡酰奎尼酸，再经Sephadex LH-20凝胶柱纯化，甲醇洗脱，可得到纯度达98％以上的1，5-二咖啡酰奎尼酸。 

Claims (11)

1.一种制备紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)采用来自天山雪莲的外植体诱导产生离体组织细胞，所用培养基为MS培养基；

(2)离体组织细胞在同样组成的培养基中继代培养，经筛选得到高产紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸三种目标成分的天山雪莲组织细胞系；

(3)将步骤2筛选得到的天山雪莲组织细胞系转入液体培养基中进行摇瓶悬浮培养，建立悬浮培养细胞系；

(4)采用次生代谢调控的技术策略提高天山雪莲细胞悬浮培养体系生产三种目标成分的能力；

(5)摇瓶培养或生物反应器培养方式用于天山雪莲细胞培养及三种目标成分的生产；

(6)培养细胞经溶剂提取，结合多种色谱分离技术简便高效地制备紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸三种物质。

2.权利要求1的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的天山雪莲的外植体选自野生天山雪莲植株、再生苗或种子萌发后的无菌苗的外植体；所述的MS培养基中附加植物激素α-萘乙酸、6-苄基嘌呤和2，4-二氯苯氧乙酸的。

3.权利要求2的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的外植体所述的选自叶片、子叶、根、茎、胚轴、胚芽；所述的α-萘乙酸的浓度范围是0.1～10.0mg·L^-1、6-苄基嘌呤的浓度范围是0.1～10.0mg·L^-1、2，4-二氯苯氧乙酸的浓度范围是0.1～10.0mg·L^-1。

4.权利要求1的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的继代培养选用生长状态较好的疏松、浅黄色组织细胞为种子，黑暗条件下继代培养；所述的筛选方式为结合紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸含量分析，筛选稳定、高产的天山雪莲细胞系。

5.权利要求1的方法，其特征在于，步骤(3)以高产紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸的天山雪莲细胞系为种子，以细胞呈颗粒性、分散性好、生长迅速、生物量高和/或目标成分产量高为标准，筛选并建立稳定高产的细胞悬浮培养体系。

6.权利要求1的方法，其特征在于，步骤(3)采用摇床旋转振荡培养，接种量为1～20g细胞干重每升培养基，黑暗条件下进行悬浮培养，每7d～15d继代1次。

7.权利要求1的方法，其特征在于，步骤(4)采用环境控制、优化碳源、添加前体物质和添加诱导子的技术策略提高天山雪莲细胞生产三种目标成分的能力。

8.权利要求7的方法，其特征在于，所述的碳源是蔗糖、所述的前体物质选自L-苯丙氨酸、所述的诱导子选自茉莉酸甲酯。

所述的蔗糖的浓度是1％～20％，所述的L-苯丙氨酸的浓度是20～2000mg·L^-1；所述茉莉酸甲酯的浓度是10～500mg·L^-1。

9.权利要求1的方法，其特征在于，

步骤(5)应用摇瓶培养时培养基为附加0.1～10.0mg·L^-1α-萘乙酸、0.1～10.0mg·L^-16-苄基嘌呤、0.1～10.0mg·L^-12，4-二氯苯氧乙酸；

步骤(5)应用的生物反应器为气升或搅拌动力的反应器，反应器的工作参数为：用附加0.1～10.0mg·L^-1α-萘乙酸、0.1～10.0mg·L^-16-苄基嘌呤、0.1～10.0mg·L^-12，4-二氯苯氧乙酸、20～2000mg·L^-1L-苯丙氨酸和1％～20％蔗糖的MS液体培养基，在培养过程中添加10mg·L^-1～500mg·L^-1茉莉酸甲酯，反应器工作体积40％～80％，接种量1～20g·L^-1，通气量50～1000mL·min^-1、转速0～200rpm，并添加二甲基硅类消泡剂0～10mL·L^-1，培养在黑暗下进行。

10.权利要求1的方法，其特征在于，步骤(6)采用20～80％的醇溶液为提取溶剂，浸膏加适量水分散，采用大孔树脂吸附、硅胶柱色谱分离，高效率地分别得到较高纯度的紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸组份。

11.权利要求1的方法，其特征在于，步骤(6)培养细胞成分经大孔树脂吸附富集后，根据3种目标成分的理化性质差异，运用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、制备型高效液相色谱多种色谱手段，制备高纯度紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸。

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