CN1099463C

CN1099463C - 三七细胞生产人参皂甙和多糖的方法及反应器

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Publication number: CN1099463C
Application number: CN 00116350
Authority: CN
Inventors: 钟建江; 胡炜炜
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2000-06-06
Filing date: 2000-06-06
Publication date: 2003-01-22
Anticipated expiration: 2020-06-06
Also published as: CN1279291A

Abstract

本发明公开了一种三七细胞生产人参皂甙和多糖的方法及反应器。在鼓泡式或气升式反应器中采用分批培养或补料培养的方法对三七种子细胞进行培养，并设计了一种鼓泡式和升气式反应器，可以高效率同时生产人参皂甙和人参多糖，细胞的生产最高产率为1518mg/(l·d)，为工业化生产人参多糖、人参总皂甙和单体皂甙奠定了基础。

Description

三七细胞生产人参皂甙和多糖的方法及反应器

本发明属于生物工程与技术领域，涉及一种人参皂甙和多糖的生产方法，尤其涉及一种通过三七细胞在生物反应器中生产人参皂甙和多糖的生产方法及生物反应器。

三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)又称田七、三七参、人参三七等，为五加科人参属植物，主要分布于我国西南部的云南、广西等地。《本草纲目》中载有其药用功效，如活血化瘀、镇定止痛、止血补血和滋补强壮等功效。现代医学研究揭示了人参多糖和三萜类皂甙为其主要活性成分。人参多糖的生物活性有增强人体免疫、抗肿瘤、保肝和降血糖等；而三萜类人参皂甙并非单一成分，它们种类多，且各组分生物活性不一、有的甚至相反。例如，三七人参皂甙Rb1有抗溶血作用，而Ro具有溶血性质；Rb1、Rb2抑制中枢神经系统，而Rg1兴奋中枢神经；Rb1还有增强核糖核酸聚合酶的活性，而Rc则有抑制核糖核酸聚合酶的活性。Rd具有增强免疫功能，抑制癌细胞生长的作用，Rh1和Rh2具有促进癌细胞转化的作用。另外，我国第一个中药一类新药——Rg3参一胶囊中的主要成分Rg3具有抑制肿瘤生长、诱导肿瘤细胞调亡和抗肿瘤细胞转移的作用。在三七药用价值被广泛揭示的同时，三七的产量成为抑制三七应用的瓶颈，因为在自然界中野生的三七至今尚未找到。而同三七人工栽培相比，细胞培养法生产三七有效成份由于生产周期短、劳动力省以及受外部环境影响小等优点被认为是一种更有效的方法。并且，近年来的商业化人参产品已经覆盖许多国家，光人参属原材料的年销量已超过10亿美元，所以利用细胞培养法生产人参多糖和三萜类皂甙具有较大的市场潜力。

自1964年文献“罗士伟等.植物生理通讯，1964，(2)：26-38”第一次报道了人参组织培养研究后，在随后的十年时间里，出现了大量有关此方面的研究报道。1972年Yasuda首次报道了人参细胞的大规模悬浮培养，罐体积达到600升。在八十年代间，日本日东电工公司用2吨和20吨搅拌发酵罐进行了工业规模的人参细胞培养。所得人参细胞与人工种植人参具有相似的化学组成(如皂甙含量)，并且对动物具有相同的药理作用。1997年Ushiyama & Hibino报道了他们采用两步法生产技术，在20～25吨生物反应器中生产人参细胞，而且用细胞培养所得的细胞粉和抽提物被用于制成保健食品、饮料和化妆品。

但是，至今为止利用生物反应器生产人参皂甙和多糖的效率不高，日本日东电工公司用搅拌发酵罐进行人参细胞培养的产率达到了500～700mg/(l·d)(Furuya，1988；Ushiyama，1991)。在1997年Ushiyama & Hibino又报道了他们采用两步法生产技术在20～25吨生物反应器中生产人参细胞，在四星期内产量达到了20g DW/1，约714mg/(l·d)，为至今最好结果。而三七细胞的生物反应器培养未见报道，这就增加了工业化生产的成本。

因此，进一步开发研究通过生物反应器同时生产人参皂甙和多糖的技术，将具有十分重要的意义。

本发明的目的在于公开一种同时生产人参皂甙和多糖的方法和反应器，以克服现有技术的上述缺陷。

实现本发明目的技术方案包括如下步骤：

1.种子细胞的培养：种子细胞在普通Murashige-Skoog(MS)培养基中每隔10-15天传代一次，培养使用旋转式摇床，转速为60-200rpm，培养温度20-30℃，暗培养。所说的种子细胞为三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)细胞，是由多年生三七植株的根诱导而得，具体的培养方法可参阅“三七：生物学及其应用”1994年科学出版社。

2.三七细胞的生物反应器培养：三七细胞的生物反应器培养分为分批培养和补料培养。

A分批培养是在鼓泡式或气升式反应器中进行的。首先接种10-100g湿细胞入1-5L(工作体积)反应器中，培养采用文献“Zhang et al.，Enzyne and MicrobialTechnology.1997.21：59-63”报道的改进型MS培养基，20-30℃下暗培养，培养12-25天，采用常规的方法从培养液中分离细胞，培养过程中随着细胞量的增加而不断增加通气速率，通气速率的变化范围为0.0015-0.05m³空气/(m³培养基.s)。

B.补料培养则是在培养后期细胞的氧比消耗速率迅速下降之前添加培养液总重量的0.5-2％的蔗糖到反应器中，可进一步提高产量。

人参总皂甙的测定是采用文献“人参的分析II.人参皂甙的测定药学学报，1980.15(3)：175-180”报道的TLC-比色法；人参多糖的测定是采用文献“吉林红参与高丽红参中多糖的测定中药通报.1987.12(6)，40-41”报道的咔唑浓硫酸法；人参单体皂甙的测定采用文献“人参的分析IV.人参皂甙的高效液相色谱的测定.药学学报.1988.23(2)：137-141”报道的高压液相色谱法。

上述的培养过程是在鼓泡式或气升式反应器中完成的。

所说的气升式反应器包括壳体、导流筒和鼓泡器。

导流筒设置在壳体的中部，鼓泡器设置在壳体的底部。由于在高密度细胞条件下，如湿细胞大于200克/升，鼓泡器与导流筒之间不同的间距会改变反应器中的流动情况、混合情况和传氧情况，因此，在相同的操作条件下，鼓泡器与导流筒之间的间距将直接影响反应产物的组成，发明人根据试验结果进行了优化。以下将通过附图对其进行详细的说明。

图1为气升式反应器结构示意图。

图2为鼓泡式反应器结构示意图。

由图1可见，所说的气升式反应器包括壳体1、导流筒2和鼓泡器3，导流筒2设置在壳体1的中部，鼓泡器3设置在壳体1的底部，鼓泡器3与导流筒2之间的间距B与反应器高度H之间的比值为：B/H＝0.03-0.13；

由于传氧和混合的原因，当该比值取不同的数值时，在同一操作条件下，反应产物将获得不同的结果，具体结果见下表：

细胞产量皂甙产量多糖产量

B/H＝0.03-0.045 22.6克/升 1.83克/升 1.79克/升

B/H＝0.045-0.092 25.2克/升 1.87克/升 2.21克/升

B/H＝0.092-0.13 20.5克/升 1.76克/升 1.53克/升。

导流筒2的直径d和壳体1的直径D之间的比值为：

d/D＝0.4-0.8；

鼓泡器3采用1-200μm的孔径；

鼓泡器3与反应器底部之间的距离C与反应器高度H的比值为：

C/H＝0.0-0.05。

所说的气升式反应器是这样操作的：

将含有细胞的培养液置于壳体1中，通过鼓泡器3鼓入空气，培养液在导流筒2内向上流动，然后折返向下，在壳体1内不断地流动进行细胞的培养，空气由反应器上部的空气出口排出壳体1。

由图2可见，所说的鼓泡式反应器包括壳体4和鼓泡器5，鼓泡器5设置在反应器的底部，鼓泡器5采用1-200μm的孔径；鼓泡器5与反应器底部之间的距离C₁与反应器高度H₁的比值为：C₁/H₁＝0.0-0.05。

其操作方式与气升式反应器相仿。

本发明所说的方法其优点是十分明显的：

可以高效率同时生产人参皂甙和人参多糖，细胞的生产最高产率为1518mg/(l·d)，明显高于以往报道，并可以通过HPLC制备分得人参单体皂甙组分，这些产品都具有较高的药用价值，可广泛用于医药和食品保健等行业，为工业化生产人参多糖、人参总皂甙和单体皂甙奠定了基础。

实施例1

实验采用的细胞是由多年生三七植株的根诱导而得三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)细胞。

1.0L鼓泡式反应器，培养采用改进型MS培养基，另外添加2mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)，0.7mg/L 6-糠基氨基嘌呤(KT)及50g/L蔗糖。将真空过滤所得湿细胞50g接种到反应器中，起始通气速率为0.3vvm，而后随着细胞量的增加而逐渐调大通气速率，25℃暗培养15天，结束发酵，收获细胞并在40℃干燥，最终获得的细胞干重为21.0g/l，产率为1140mg/(l·d)。

分析测定方法：

取100mg干细胞，加入5ml水饱和正丁醇5ml，冷浸过夜。将冻存后的细胞-正丁醇溶液超声波处理30min，离心后取上清夜2ml，真空干燥(40℃)至正丁醇完全挥干。用1ml甲醇溶解挥干后的剩余物，溶液用于TLC点样。层析用的是硅胶薄板，层析液为氯仿-甲醇-水(75∶60∶l0)的溶液，点样量为20μl。将层析后的皂甙斑点刮入试管，加入0.2ml5％香甲醛-冰醋酸，0.8ml高氯酸，在60℃反应15min，待反应液冷却后加入5ml冰醋酸终止反应。将反应液振荡后离心，取上清液比色，测定并计算得到人参皂甙含量为8.0mg/100mg DW，产量为1.69g/L，产率为96mg/(l·d)。干细胞100mg，加入5ml 0.SM浓硫酸，沸腾水解1小时，然后用咔唑-浓硫酸法测定人参多糖为10.2mg/100mg DW，产量为2.14g/L，产率为119mg/(l·d)。

实施例2

分批培养条件同实例1，采用的是1.0L气升式反应器。到第15天放罐，收获得细胞干重为24.1g/l，产率为1347mg/(l·d)。人参皂甙产量为1.74g/l(含量为7.2mg/100mg)，产率为99mg/(l·d)；人参多糖为2.62g/l(含量为10.9mg/100mg)，产率为151mg/(l·d)。

实施例3

1.0L气升式反应器，培养采用改进型MS培养基，另外添加2mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)，0.7mg/L 6-糠基氨基嘌呤(KT)及50g/L蔗糖。将真空过滤所得湿细胞50g接种到反应器中，培养到第13天，细胞的氧比消耗速率开始出现迅速下降之前，添加10g/l的蔗糖继续培养，到第17天放罐，收获得细胞干重为29.7g/l，产率为1518mg/(l·d)。人参皂甙产量为2.06g/l(含量为6.9mg/100mg)，产率为106mg/(l·d)；人参多糖为3.03g/l(含量为10.2mg/100mg)，产率为158mg/(l·d)。

如果培养到第15天，细胞的氧比消耗速率已经迅速下降后，再添加10g/L的蔗糖，到第17天，可收获细胞干重稍低，为26.7g/L，产率为1347mg g/(l·d)。人参皂甙和人参多糖的产量和产率也稍低，人参皂甙产量为1.75g/l(含量为6.6mg/100mg)，产率为88mg/(l·d)；人参多糖为2.48g/l(含量为9.3mg/100mg)，产率为125mg/(l·d)。

实施例4

2.0L气升式反应器，培养采用改进型MS培养基，另外添加2mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)，0.7mg/L 6-糠基氨基嘌呤(KT)及50g/L蔗糖。将真空过滤所得湿细胞100g接种到反应器中，培养到第15天放罐后收获细胞，取100mg干细胞，加入5ml水饱和正丁醇5ml，冷浸过夜。将冻存后的细胞-正丁醇溶液超声波处理30min，离心后取上清夜2ml，真空干燥(40℃)至正丁醇完全挥干。用1ml水溶解剩余物后过大孔树脂柱。洗脱液(70％乙醇溶液)挥干后用乙腈溶液溶解，溶液用高压液相色谱法分析，测得单体皂甙含量为：Rb2 0.35％；Rc0.64％；Re 1.25％；Rg1 0.38％。如果在第15天补糖10g/L，第18天放罐后收获细胞，测定得到的单体皂甙的含量则为：Rc 1.24％；Re 0.80％；Rg 10.15％。

Claims

1.一种气升式反应器，包括壳体(1)、导流筒(2)和鼓泡器(3)，导流筒(2)设置在壳体(1)的中部，鼓泡器(3)设置在壳体(1)的底部，其特征在于，鼓泡器(3)与导流筒(2)之间的间距(B)与反应器高度(H)的比值为：(B)/(H)＝0.03-0.13。

2.如权利要求1所述的反应器，其特征在于，导流筒(2)的直径(d)和壳体(1)的直径(D)之间的比值为：(d)/(D)＝0.4-0.8。

3如权利要求1所述的反应器，其特征在于，鼓泡器(3)采用1-200μm的孔径。

4.如权利要求1所述的反应器，其特征在于，鼓泡器(3)与反应器底部之间的距离(C)与反应器高度(H)的比值为：(C)/(H)＝0.0-0.05。

5.一种通过三七细胞培养生产人参皂甙和多糖的方法，其特征在于，该方法依次包括如下步骤：

(1)种子细胞的培养：种子细胞在普通Murashige-Skoog(MS)培养基中培养，培养温度为20-30℃，暗培养；所说的种子细胞为三七(Panaxnotoginseng)细胞；

(2)三七细胞的生物反应器培养：首先接种10-100g湿细胞入工作体积为1-5L的权利要求1所述的反应器中，培养采用改进型MS培养基，20-30℃下暗培养，培养12-25天，通气速率为0.0015-0.05m³空气/m³培养基s，然后从培养液中分离细胞；

6.如权利要求5所述方法，其特征在于，在培养后期细胞的氧比消耗速率迅速下降之前添加培养液总重量的0.5-2％的蔗糖到反应器中。