CN1141385C - 培养基中添加茉莉酮酸类化合物的三七细胞培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种在培养基中添加茉莉酮(酸)类化合物的三七细胞培养方法。通过在培养基中添加茉莉酮(酸)类化合物，不但促进了总皂甙的合成，更重要的是改变了各单体皂甙之间的比例，成功实现了对单体皂甙合成的调控，为定向单体皂甙的大规模商业生产奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种三七细胞培养方法，特别涉及一种在培养基中添加了能够调控人参皂甙成分的物质的培养方法。
背景技术
三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)又称田七、三七参、人参三七等，为五加科人参属植物，主要分布于我国西南部的云南、广西等地。《本草纲目》中载有其药用功效，如活血化瘀、镇定止痛、止血补血和滋补强壮等功效，现代医学研究揭示了三萜类人参皂甙是其主要生物活性成分之一。人参皂甙并非单一成分，它们种类多，根据其甙元的不同可分为达玛烷型四环三萜皂甙和齐墩果烷型五环三萜皂甙(如Ro)。已经证明达玛烷型四环三萜皂甙比齐墩果烷型五环三萜皂甙具有更强的生物活性，它们又分为Rb组(甙元为原人参二醇，如Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rh2、Rg3等)和Rg组(甙元为原人参三醇，如Rg1、Rg2、Rg1、Re等)人参皂甙。各人参皂甙单体的生物活性不一、有的甚至相反(郑光植和杨崇仁，1994)。例如，人参皂甙Rb1有抗溶血作用，而Ro具有溶血性质；Rb1、Rb2抑制中枢神经系统，而Rg1兴奋中枢神经(郑光植和杨崇仁，1994)；Rb1还有增强核糖核酸聚合酶的活性，而Rc则有抑制核糖核酸聚合酶的活性(王宪楷，1988)。Rd具有增强免疫功能，抑制癌细胞生长的作用，Rh1和Rh2具有促进癌细胞转化的作用。另外，我国第一个中药一类新药——Rg3参一胶囊中的主要成分Rg3具有抑制肿瘤生长、诱导肿瘤细胞调亡和抗肿瘤细胞转移的作用。
细胞培养法生产人参皂甙有效成份，由于生产周期短、劳动力省以及受外部环境影响小等优点被认为是一种更有效的方法。Zheng，G.Z.，Wang，S.L.，Gan，F.Y.Studies on cell technology of secondary metabolites from Panax notoginseng.In：Proceedings of China-Japan Symposium on Plant Biotechnology.Shanghai，China.1988，p26-30等报道了人参寡糖素对三七细胞的皂甙含量有促进作用，文献Furuya，Y.，Yoshikawa，T.，Orihara，Y.，Oda，H.Studies of the culture conditions forPanax ginseng cells in jar fermentors.J.Nat.Prod.1984，47：70-75报道了溶菌酶能促进人参细胞培养物中皂甙的生物合成，但这些工作多侧重提高总皂甙的含量。并且，近年来的商业化人参产品已经覆盖许多国家，光人参属原材料的年销量已超过10亿美元(Wu和Zhong，1999)，所以利用细胞培养法生产人参皂甙具有较大的市场潜力。由于不同人参皂甙组分的生理活性的差别大，使得总人参皂甙(各单体人参皂甙的混合物)较难显示良好专一的生物活性。并且，如上述，各单体人参皂甙的分子结构非常相似、理化性质也相近，故难以简单把它们分离开来；即使能分离获得，由此也会大大增加生产成本，实用化生产较为困难。因此，对细胞培养过程中各单体皂甙的积累进行调控对于其商业应用具有重要价值。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一种通过在三七细胞发酵培养基中添加茉莉酮酸类化合物来调节人参皂甙有效成份的三七细胞培养的方法，在人参单体皂甙组分比例同时增加人参总皂甙含量的技术，以克服现有技术存在的无法调控人参皂甙有效成份的缺陷，为工业化经济生产人参皂甙各单体组份奠定基础。
本发明的方法包括在文献“Plant Physiol 15，(1962)473～479”报道的Murashige-Skoog(MS)培养基中添加茉莉酮酸类化合物，然后对三七(Panaxnotoginseng(Burk.)F. H.Chen)种子细胞进行培养。
每隔10～15天传代一次，培养使用旋转式摇床，转速为50-200rpm，培养温度20-30℃，暗培养。
所说的三七细胞是由三七种子经消毒后诱发出无菌三七植株，从无菌三七植株剪取0.5-1厘米长的胚根，在添加有0-20mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)，0-10mg/L 6-糠基氨基嘌呤(KT)及10-30g/L蔗糖的MS琼脂培养基中于20-30℃下暗培养，2-4周后长出愈伤组织。选择较旺盛生长的愈伤组织接种到装有50ml新鲜培养基的250ml三角摇瓶中，培养基为添加2mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)、0.7mg/L 6-糠基氨基嘌呤(KT)及30g/L蔗糖的MS液体培养基。
所说的茉莉酮酸类化合物为具有式(1)茉莉酮酸类、(2)二氢茉莉酮酸类、(3)cucurbates或(4)茉莉酮所示结构的化合物及其所有立体异构体和混合物。
式(1)、(2)和(3)中的R是H、卤素、CnH2n+1、CnH2n-1、CnH2nOH或CnH2(n-1)OH中的一种，其中：1≤n≤10。
特别优选的是式(1)或(2)所示的化合物；
最优选的是式(1)或(2)所示的化合物的R＝H或CH3。
培养基中茉莉酮酸类化合物的浓度为0.01～1000μM，特别优选的为0.1～500μM。
人参单体皂甙的测定是通过高压液相色谱法(Ren and Chen，1999)。
采用上述方法所获得的人参皂甙的有效成份，采用上述方法进行测试，结果表明：本发明的方法可实现对三七细胞培养生产人参皂甙的单体皂甙合成的调控。实验所用三七细胞在普通的对照培养基中生长，可检测的单体皂甙有Rg1、Re和Rb1，其各含量没有明显差别。通过茉莉酮酸类化合物特别是甲基茉莉酮酸酯(结构(1)，其中R＝CH3)的添加，单体皂甙的含量比例发生了显著的变化，Rb组人参皂甙、尤其是Rb1的含量相对于其它单体有显著增加，并且检测到了Rd。如实例2条件D所示，在第15天，与对照相比，添加200μM甲基茉莉酮酸酯后，皂甙含量和比例发生了明显变化，Rb1比对照提高了约8倍，Rg1和Re比对照高1倍左右，并且Rb与Rg组皂甙的含量比例比对照提高了3倍多。这表明在培养基中添加茉莉酮酸类化合物，可以调节三七细胞合成单体皂甙组份的多样性。本发明通过在三七细胞培养基中添加茉莉酮酸类诱导物，不但提高了皂甙的含量，更重要的是改变了单体皂甙的比例，为工业化生产单体皂甙奠定了基础。
具体实施方式
实施例1
实验采用的是由多年生三七植株的根诱导而得三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)细胞。对照培养采用MS培养基，另外添加2mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)，0.7mg/L 6-糠基氨基嘌呤(KT)及30g/L蔗糖。单体皂甙的调控采用对照培养基同时添加二氢甲基茉莉酮酸酯(具有(2)式的结构，其中R＝CH3)。将真空过滤所得湿细胞2g接种到装有50ml新鲜培养基的250ml三角摇瓶中，25℃暗培养，细胞在40℃干燥后称重。另外，干细胞按照Ren和Chen(Ren and Chen，1999)的方法萃取处理后高效液相色谱分析单体皂甙的含量。结果见下表(培养12天)。二氢甲基茉莉 干重 皂甙含量(mg/100mg干重)
Rb∶Rg酮酸酯添加量 (g/L) Rg1 Re Rb1 Total
0 6.86±0.48 0.31±0.02 0.28±0.01 0.39±0.01 0.98±0.04 0.67±0.04
5μM 6.89±0.47 0.31±0.01 0.27±0.02 0.39±0.01 0.96±0.03 0.67±0.05
20μM 7.14±0.05 0.37±0.02 0.34±0.01 0.43±0.03 1.14±0.06 0.67±0.01
100μM 6.54±0.33 0.51±0.01 0.42±0.01 0.74±0.08 1.66±0.07 0.79±0.09表中：Rb∶Rg＝Rb1/(Rg1+Re)；Rd未检测到。
从上述结果可知，与对照(不添加二氢甲基茉莉酮酸酯)相比，添加100μM甲基茉莉酮酸酯后，皂甙含量获得较大提高，各单体的比例也发生了一定程度的改变。Rb1比对照提高了近1倍，Rg1和Re也比对照高50-70％左右，Rb与Rg组皂甙的含量比例比对照提高了10％多。这表明在培养基中添加该化合物，可以调节三七细胞的皂甙生物合成及其组份的多样性。
实施例2
单体皂甙的调控采用对照培养基同时补加甲基茉莉酮酸酯(具有(1)式的结构，其中R＝CH3)，其它条件同实例1。结果见下表(培养15天)。甲基茉莉酮 皂甙含量(mg/100mg DW)
干重(g/L) Rb∶Rg酸酯添加量 Rg1 Re Rb1 Rd
0 7.97±0.01 0.32±0.02 0.43±0.03 0.37±0.02 0 0.49±0.0620μM 7.93±0.10 0.83±0.15 0.78±0.12 1.67±0.23 0.12±0.01 1.12±0.04100μM 7.71±0.27 0.86±0.04 0.79±0.02 2.53±0.12 0.17±0.02 1.64±0.03200μM 8.14±0.01 0.82±0.00 0.80±0.01 3.15±0.08 0.20±0.01 2.06±0.07500μM 8.09±0.44 0.46±0.05 0.45±0.05 2.03±0.17 0.10±0.01 2.49±0.06表中：Rb∶Rg＝(Rb1+Rd)/(Rg1+Re)。
从上述结果可知，与对照(不添加甲基茉莉酮酸酯)相比，添加200μM甲基茉莉酮酸酯后，皂甙含量大幅度得到提高，且各单体的比例也发生了明显变化，Rb1比对照提高了约8倍，Rg1和Re比对照高1倍左右，并且Rb与Rg组皂甙的含量比例比对照提高了3倍多。这表明在培养基中添加茉莉酮酸类化合物，可以有效调节三七培养细胞合成单体皂甙组份的多样性。
Claims (6)
1.一种培养基中添加茉莉酮酸类化合物的三七细胞培养方法，其特征在于，该方法包括在Murashige-Skoog培养基中添加茉莉酮酸类化合物，然后对三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)种子细胞进行培养；
所说的茉莉酮酸类化合物为具有(1)茉莉酮酸类(2)二氢茉莉酮酸类、(3)cucurbates或(4)茉莉酮所示结构的化合物及其所有立体异构体或混合物：
式(1)、(2)和(3)中的R是H、卤素、CnH2n+1、CnH2n-1、CnH2nOH或CnH2(n-1)OH中的一种，其中：1≤n≤10。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所说的茉莉酮酸类化合物为式(1)或(2)所示的化合物。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所说的茉莉酮酸类化合物为式(1)或(2)所示的化合物，其中，R＝H或CH3。
4.如权利要求1～4任一所述的方法，其特征在于，培养基中茉莉酮酸类化合物的浓度为0.01～1000μM。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，培养基中茉莉酮酸类化合物的浓度为0.1～500μM。
6.茉莉酮酸类化合物在三七细胞培养中的应用，所述化合物为具有如下结构式之一的化合物：
式(1)、(2)和(3)中的R是H、卤素、CnH2n+1、CnH2n-1、CnH2nOH或CnH2(n-1)OH中的一种，其中：1≤n≤10。
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