KR100385092B1 - 참당귀로부터 뿌리배양을 이용하여 항암활성 물질데커시놀 안젤레이트를 생산하기 위한 배양, 추출 및분석방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 참당귀(Angelica gigasNakai)로부터 뿌리배양을 이용하여 천연물 유래 항암활성 물질인 데커시놀 안젤레이트(decursinol angelate)를 생산하기 위한 배양, 추출 및 분석방법에 관한 것으로서, 구체적으로 식물조직배양 기술을 이용하여 참당귀 뿌리를 식물생장조절제와 유도물질(elicitor)이 포함된 플라스크상에서 무균적으로 대량 배양하는 방법, 상기 배양된 뿌리조직을 열수추출한 후 질소증발기를 사용하여 항암활성을 갖는 화학식 1로 표시되는 데커시놀 안젤레이트를 추출하는 방법 및 상기 추출물 내 데커시놀 안젤레이트를 렉스크롬 S5-100-ODS 역상 C-18 칼럼(reverse phase C-18 colunm)을 이용하여 330 nm 파장에서 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)로 분석하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 배양, 추출 및 분석방법은 기후, 토양 및 병충해 등의 자연환경에 영향을 받지 않으면서 차세대 항암활성 물질인 데커시놀 안젤레이트를 단시간안에 안정적으로 대량 생산하는 데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

참당귀로부터 뿌리배양을 이용하여 항암활성 물질 데커시놀 안젤레이트를 생산하기 위한 배양, 추출 및 분석방법{Method of culture, extraction and analysis for producing an anticancer agent decursinol angelate via a root culture of Angelica gigas Nakai}

본 발명은 참당귀(Angelica gigasNakai)로부터 뿌리배양을 이용하여 천연물 유래 항암활성 물질인 데커시놀 안젤레이트(decursinol angelate)를 생산하기 위한 배양, 추출 및 분석방법에 관한 것으로서, 구체적으로 식물조직배양 기술을 이용하여 참당귀 뿌리를 식물생장조절제와 유도물질(elicitor)이 포함된 플라스크상에서 무균적으로 대량 배양하는 방법, 상기 배양된 뿌리조직을 열수추출한 후 질소증발기를 사용하여 항암활성을 갖는 화학식 1로 표시되는 데커시놀 안젤레이트를 추출하는 방법 및 상기 추출물 내 데커시놀 안젤레이트를 렉스크롬 S5-100-ODS 역상 C-18 칼럼(reverse phase C-18 colunm)을 이용하여 330 nm 파장에서 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)로 분석하는 방법에 관한 것이다.

<화학식 1>

천연물로부터 유래된 약학적 조성물의 이용이 의약품 개발 분야에서 전 세계적으로 증가하고 있는 가운데, 한국을 비롯한 중국과 일본에서도 전통적으로 한의학에서 사용되고 있는 생약재로부터 항암활성 물질 등의 유용한 성분을 찾고자 하는 연구가 많이 이루어지고 있다. 이러한 연구는 수천년 동안 민간에서 경험적 처방과 임상실험을 통하여 다양한 생약재들의 효능과 안정성이 입증되었다는 사실로 미루어 화학합성에 의한 접근보다 기술적인 장점이 크다고 하겠다.

이러한 생약재 중 당귀는 우리나라의 강원도 고산지대에서 주로 생산되는 약용식물로서, 보혈강장 및 진통 작용을 목적으로 냉증, 빈혈, 혈행장애 및 정신증상 등의 부인과 질환에 주로 보혈청혈약으로 널리 사용되어 왔다. 당귀는 산형과(Umbelliferae)에 속하는 안젤리카(Angelica) 속 식물로서 한국에서는 주로 참당귀(Angelica gigasNakai)를 약용으로 사용하고 있다. 지금까지 알려져 있는 참당귀의 성분으로는 쿠마린 (coumarine)계 물질인 데커신(decursin), 데커시놀(decursinol), 노다케네틴(nodakenetin), 움벨리페론(umbelliferon), 노다케닌(nodakenin), 베타-시토스테롤(β-sitosterol) 등이 있다(Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol.,24, 624-629, 1996).

참당귀 추출물에 대한 다양한 약리학적 연구 결과, 참당귀의 에테르 추출물은 토끼의 적출장관 및 자궁에 대하여 흥분작용을 나타내며 혈압과 호흡을 항진시키는 작용이 있는 것으로 보고되었다. 또한, 단리된 데커신과 데커시놀은 토끼의 적출장관을 마비시키고 호흡억제와 혈압을 강하시키며, 개구리 적출심장에 대하여는 억제작용을, 그리고 생쥐에서는 자발작용을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 이 외에도, 신장독성 억제제 성분으로서 데커신을 포함하는 의약조성물이 대표적인 항암제인 시스플라틴(cisplatin)의 신장독성을 효과적으로 억제할 수 있으며, 당뇨병유발물질로 알려진 알록산(alloxan)에 의한 신장독성도 효과적으로 억제할 수 있음이 밝혀졌다(대한민국 특허 제 98-44339 호).

한편, 참당귀의 에탄올 추출물에는 주로 터페노이드(terpenoid) 계열의 쿠마린(coumarine)이 존재하는 것으로 알려져 있는데, 이들 중 데커신과 데커시놀 안젤레이트는 피라노쿠마린(pyranocoumarin)의 일종으로 C₁₉H₂₀O₅의 분자식으로 나타내지고 328의 분자량을 가지며 동일한 구조의 쿠마린 핵을 가지고 있다. 데커신과 데커시놀 안젤레이트는 서로 구조 이성질체로서 쿠마린 핵에 세네시오일산(senecioylic acid)이 에스터 결합(ester bond)에 의해 결합된 구조와 세네시오일산의 구조 이성질체인 안젤로산(angeloic acid)이 결합된 구조를 갖는다.

이들 중 상기 화학식 1로 표시되는 데커시놀 안젤레이트(decursinol angelate)는 러시아에서 세셀리 그란디비타튬(Seseli grandivitattum)의 추출액으로부터 최초로 분리된 피라노쿠마린 계열의 천연물 성분(Khim. Prir. Soedin. 5, 640, 1977)으로서, 국내에서는 지금까지 한국산 참당귀(Angelica gigasNakai)로부터 추출한 바가 알려져 있으나(Korean J. Pharmacogn.,21, 64-68, 1990), 그밖의 다른 식물이나 배양세포로부터 추출한 바는 없는 것으로 알려져 있다. 데커시놀 안젤레이트가 폐암 및 간암세포 등 다양한 암세포주에 대하여 항암활성을 가지고 있음이 밝혀지면서 이를 유효성분으로 포함하는 함암제의 개발 가능성이 제시되었다(대한민국 특허 제 96-30421 호).

전술한 바와 같이, 최근 들어 데커신과 데커시놀 안젤레이트가 in vitro 항암활성을 나타내어 다양한 암세포주에 대하여 세포독성을 가질 뿐 아니라 단백질 키나아제 C(protein kinase C, 이하 "PKC"라고 약칭함)의 효소활성을 증진시키는 작용이 밝혀져 항암물질로서 이들의 이용가능성이 대두되고 있다. PKC는 세포내 신호전달 과정과 발암유발 과정에서 중요한 역할을 하는 효소로서, 적어도 10개의 동위효소(isoenzyme)들이 알려져 있으며 조직에 따라 특이적으로 발현되어 항암제의 주요한 타겟(target)으로 여겨지고 있다. 초기 항암제 개발의 주요 관심대상은 PKC의 효소활성을 억제하는 PKC 저해제(PKC inhibitor)의 개발에 집중되어 왔으며, 이러한 연구의 결과로서 현재까지 많은 PKC 저해제가 개발되어 항암제로서 사용되고 있다.

예를 들면, 스타우로스포린(staurosporine)은 ATP 결합부위에 결합하여 PKC의 효소활성을 효과적으로 저해하지만, 이들은 작용기작이 비특이적이며 인체에 강한 독성을 나타내는 부작용을 유발하는 단점을 갖는다. 유방암에 특효약으로서 개발되고 있는 타목시펜(tamoxifen) 역시 PKC 저해제로서 항암활성을 나타내지만 타목시펜의 작용기전에 대해서는 아직까지 정확하게 알려져 있지 않다. 현재 항암제로 널리 사용되고 있는 독소루비신(doxorubicin)은 PKC 저해제로서의 활성은 약하지만 철분자와 결합하여 독소루비신3-Fe(Ⅲ) 복합체([doxorubicin]3-Fe(Ⅲ) complex) 형태가 되면 강한 PKC 저해제로서 디아실글리세롤(diacylglycerol)과 경쟁적으로 PKC에 결합하여 우수한 항암활성 효과를 나타낸다.

PKC 저해제는 이 외에도 다수 알려져 있지만 지나치게 독성이 강하고 비특이적인 점 때문에 항암제로서의 사용에 약간의 문제점을 가지고 있다. 대부분의 PKC 활성제는 발암유발 과정의 초기에 작용하는 발암물질로 알려져 있는데, 대표적인 물질로서 포볼 에스터(phorbol esters), 터페노이드 화합물(terpenoid compounds) 및 합성 DAGs 등이 있다. 하지만, 기존에 발암물질로 알려진 PKC 활성제 중 브라이오스타틴(bryostatins) 및 프로스트라틴(prostratin)은 오히려 항암활성을 나타내는 것으로 확인되었으며 특히, 브라이오스타틴은 강력한 항암활성을 갖는 반면 부작용이 적어 새로운 항암제로의 개발이 기대되고 있다. 이와 같이 탁월한 항암효과를 나타내는 브라이오스타틴과 데커신 및 데커시놀 안젤레이트는 상당한 유사성을 나타낸다. 또한, 데커신이 포볼 에스터와 길항적으로 작용함으로써 두 종류의 PKC 활성제인 데커신과 포볼 에스터가 서로 다른 생리활성을 나타내고 있음이 밝혀지면서 데커신과 데커시놀 안젤레이트가 포볼 에스터와 같이 PKC 활성제로서 발암물질로 작용하는 것이 아니고 브라이오스타틴과 같이 PKC 억제제로서 항암물질로 작용하는 것으로 밝혀졌다.

한편, 식물체로부터 생산되는 유용한 이차대사산물을 얻기 위해 탈분화된 캘러스나 미분화된 현탁세포를 이용하는 배양방법이 사용되어 왔다. 하지만, 탈분화된 캘러나 미분화된 현탁세포를 이용하는 배양방법은 일반적으로 식물 분화와 관련되어 생산되는 이차대사산물의 경우에는 종종 필요성분의 함량이 낮고 생산성이 불안정하여 매우 제한적인 단점을 갖는다. 특히, 기관 특이적으로 생산되는 물질의경우에는 식물의 분화와 물질의 생산이 연관되어 있을 수 있는데, 이런 경우에는 탈분화된 캘러스나 현탁세포의 배양으로는 분화와 관련된 특정 효소가 발현되지 않기 때문에 목적하는 이차대사산물이 생산되지 않는 문제점이 있다. 따라서, 식물체로부터 이차대사산물의 보다 안정적인 생산을 위해서는 뿌리와 같은 조직배양이나 기관배양(organ culture)이 유리할 수 있다.

이러한 문제점들을 극복하기 위하여 최근에는 감염에 의한 모상근(hairy root)의 배양방법에 대해 관심이 모아지고 있다. 모상근을 이용한 현재까지의 연구에서는 모상근 유도시 토양세균을 식물체에 감염시켜 형질전환을 일으키도록 하여 모상근을 유도하였는데(일본특허공보 제 소63-254982, 일본특허공보 제 평3-285,690호, 일본특허공보 제 평4-341194호), 형질전환에 의해 모상근을 유도시킬 경우 형질전환을 위해 감염시킨 균을 제거하기 위해서 반코마이신(vancomycin), 카베니실린(carbenicillin) 및 테트라싸이클린(tetracycline) 등과 같은 항생제를 사용해야 하고, 균을 제거하는데 많은 시간이 필요하며 균을 사멸시킨 후에 다시 배지를 바꾸어 주어야 하는 등의 번거로운 과정을 거쳐야 하는 단점이 있다. 또한, 외래 유전자인 Ri 플라스미드(Ri plasmid)가 식물체 염색체에 무작위로 혼입되어 식물체 유전자의 발현(gene expression)이 달라지기 때문에 이러한 식물체로부터 추출한 추출물의 안전성에 대한 검토가 있어야 할 것으로 사료된다.

이러한 문제점을 극복하기 위하여 식물조직배양방법이 개발되었다. 식물조직배양이란 식물체로부터 분리하여 유도한 조직이나 세포를 무균상태에서 적당한 환경과 배양조건을 맞추어 주어 배양하는 것을 이르는데, 식물세포는 식물체에 비하여 생장속도가 빠르고 지리적, 기후적 제약을 받지 않으며 인위적 환경조절이 가능하기 때문에 식물조직배양은 최적의 배양조건에서 이루어지는 대사조절을 통하여 유용한 이차대사산물의 생산을 촉진시키기 위하여 사용되어 왔다(Plant Cell Tiss. Org. Cult.,24, 139-158, 1991). 최근에는 식물조직배양방법에 의해 고려인삼의 뿌리를 생산하여 이로부터 인삼 추출물 및 유효 약효성분인 사포닌을 생산하는 방법이 개발되어 밭에서 재배한 인삼으로부터 인삼 추출물 및 사포닌을 추출하는 종래의 기술이 가지고 있던 문제점들을 해결하고, 다량의 인삼 추출물 및 사포닌을 단기간에 얻을 수 있는 방법이 보고되었다(대한민국 특허 제 97-047810 호).

이에 본 발명자들은 데커신 및 데커시놀 안젤레이트의 대부분이 참당귀의 뿌리부분에서 기관 특이적으로 생산되는 사실에 착안하여 무균적으로 배양된 참당귀 소식물체로부터 얻은 뿌리절편을 플라스크 안에서 무균배양하여 이의 추출물로부터 데커시놀 안젤레이트가 생산됨을 확인하였으며, 참당귀 뿌리배양으로부터 데커시놀 안젤레이트를 효과적으로 생산하기 위한 최적의 배양, 추출 및 분석방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 참당귀로부터 항암활성을 갖는 데커시놀 안젤레이트를 효과적으로 생산하기 위한 배양, 추출 및 분석방법을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 참당귀 뿌리배양시 시간에 따른 생장변화를 나타낸 것이고,

a : 건조중량(dry weight)

b : 생체중량(fresh weight)

도 2는 본 발명의 참당귀 뿌리배양으로부터 얻은 뿌리조직을 초음파 분쇄기를 이용하여 파쇄한 후 다양한 용매를 사용하여 데커시놀 안젤레이트의 추출효율을 비교한 것이고,

도 3은 본 발명의 참당귀 뿌리배양으로부터 얻은 뿌리조직을 50℃ 가열조건에서 다양한 용매를 사용하여 데커시놀 안젤레이트의 추출효율을 비교한 것이고,

도 4는 데커신 및 데커시놀 안젤레이트 혼합 표준물질을 렉스크롬 S5-100-ODS(Rexchrom S5-100-ODS) 역상 C-18 컬럼이 장착된 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, 이하 "HPLC"로 약칭함)로 분석한 분리 크로마토그램을 나타낸 것이고,

도 5는 분광광도계를 이용하여 데커신 표준물질의 자외선 파장을 분석한 것이고,

도 6은 분리 크로마토그램에서 데커시놀 안젤레이트 표준물질의 농도변화와 피크 면적과의 관계를 그래프로 나타낸 것이고,

도 7은 합성된 데커신과 참당귀 뿌리배양의 추출물로부터 분리·정제한 데커신 및 데커시놀 안젤레이트 혼합물의 분리 크로마토그램을 비교한 것이고,

a : 합성된 데커신

b : 참당귀 추출물로부터 분리·정제된 데커신 및 데커시놀 안젤레이트 혼합물

도 8은 본 발명의 참당귀 뿌리배양으로부터 얻은 추출물의 분리 크로마토그램을 나타낸 것이고,

도 9는 본 발명의 참당귀 뿌리배양에서 저농도의 메틸자스모네이트가 데커시놀 안젤레이트 생산 촉진에 미치는 영향을 나타낸 것이고,

도 10은 본 발명의 참당귀 뿌리배양에서 고농도의 메틸자스모네이트가 데커시놀 안젤레이트 생산 촉진에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물조직배양 기술을 이용하여 참당귀 뿌리배양으로부터 항암활성 물질인 데커시놀 안젤레이트를 생산하는 배양방법을 제공한다.

예로부터 생약제로 이용되어 온 참당귀는 뿌리부분이 한약재로 사용되고 있으며 항암활성 물질인 데커신류 역시 뿌리부분에서 대부분이 생산되는 것으로 알려져 있다. 이러한 데커신류의 생산을 위한 기존의 식물세포배양은 몇가지 단점을 가지고 있는데, 배양시간이 경과함에 따라 생산성이 현저하게 저하될 뿐 아니라 데커신류와 같이 기관특이적으로 생산되는 물질의 경우에는 식물세포배양으로는 분화와 관련된 특정한 효소가 발현되지 않기 때문에 데커신류가 생산되지 않을 수 있으며, 실제적으로 아직까지 식물세포배양을 통해 데커신류를 생산한 보고는 없었다.

이에 본 발명자들은 식물조직배양 기술을 이용하여 참당귀의 뿌리배양으로부터 식물세포배양시 생산되지 않는 데커신류를 보다 안정적으로 생산할 수 있는 배양방법을 개발하였다.

본 발명자들은 무균적으로 배양된 참당귀 소식물체로부터 얻은 뿌리절편을 액체배지에 접종하여 증식을 유도하였고, 계속적인 계대배양을 통하여 배양의 안정성을 확인하였다(도 1참조). 또한, 본 발명자들은 뿌리배양의 경우 현탁세포배양에 비해 초기 생장속도가 느린 점을 감안하여 이들의 뿌리생장을 촉진시킬 수 있는 식물생장조절제를 조사하였다. 그 결과, 첨가된 식물생장조절제 중 IBA가 가장 우수한 뿌리생장 촉진효과를 나타내었으며, 카제인이 첨가된 경우에는 NAA가 현저하게 증가된 뿌리생장 촉진효과를 나타냄을 확인하였다(표 1참조).

이로부터 본 발명자들은 장기간 지속적이며 안정적으로 참당귀의 뿌리조직을 배양할 수 있는 본 발명의 참당귀 뿌리배양방법이 참당귀로부터 데커시놀 안젤레이트를 효과적으로 생산하는 데 매우 유용함을 확인하였다.

또한, 본 발명은 뿌리배양된 참당귀 뿌리조직으로부터 데커시놀 안젤레이트를 효과적으로 추출하기 위한 최적의 추출방법을 제공한다.

기존에 사용되고 있는 데커신류의 추출방법은 현탁세포배양된 세포이거나 생당귀 혹은 건조한 당귀 한약재로부터 추출하는 방법이기 때문에 본 발명의 뿌리배양된 참당귀 뿌리조직으로부터 데커신류를 추출하기 위해서는 다른 추출방법이 요구된다. 따라서, 본 발명자들은 뿌리배양된 참당귀 뿌리조직으로부터 데커시놀 안젤레이트를 효과적으로 추출할 수 있는 추출방법을 개발하기 위하여, 열수추출 후 질소증발기를 이용한 추출방법과 싹슬렛 추출기를 이용한 연속방법을 비교하였으며 데커시놀 안젤레이트의 추출시 사용되는 적절한 유기용매의 종류와 조성을 조사하여 최적의 방법을 확립하였다.

구체적으로, 본 발명의 열수추출방법은

1) 뿌리배양된 참당귀 뿌리조직 시료에 에탄올(ethanol)을 첨가하여 가열조건에서 추출하는 단계;

2) 상기 추출액으로부터 에탄올 성분을 증발시키는 단계;

3) 증발되고 남은 추출액에 동량의 클로로포름(chloroform)을 첨가하여 데커신류를 유기용매층으로 추출하는 단계; 및

4) 유기용매층으로부터 클로로포름을 증발시켜 잔사(residue)를 얻는 단계로 구성된다.

상기의 열수추출방법으로 초기 뿌리배양된 참당귀 뿌리조직을 추출하여 얻은 잔사를 HPLC로 분석한 결과, 데커신은 거의 검출되지 않고 데커시놀 안젤레이트만이 검출됨을 확인하였다.

상기의 열수추출방법을 이용하여 추출효율을 상대적으로 비교하기 위하여 수행한 싹슬렛 추출기(soxhlet extractor)를 이용한 추출방법은 추출시마다 큰 오차를 나타내었으며 적은 양의 시료를 분석하기에는 적합하지 않았다.

또한, 뿌리배양된 뿌리조직 시료로부터 데커시놀 안젤레이트를 추출하기 위해 가장 적절한 용매와 추출 조건을 결정하기 위하여 다양한 용매를 사용하여 추출효율을 비교한 결과, 70% 에탄올을 용매로 사용하여 열수추출방법으로 추출할 때 가장 높은 추출효율을 나타냄을 확인하였다(도 2및도 3참조).

아울러, 본 발명은 참당귀 뿌리배양 추출물로부터 HPLC를 이용하여 데커시놀 안젤레이트를 정량적으로 분석할 수 있는 분석방법을 제공한다.

전술한 바와 같이, 참당귀 식물체의 뿌리에서 생산되는 두 물질인 데커신 및 데커시놀 안젤레이트는 구조 이성질체로서 추출물로부터 따로 분리하기가 어려우며, 본 발명의 참당귀 뿌리배양으로부터 단일물질로 생산되는 데커시놀 안젤레이트와는 다른 양상을 나타내므로 기존에 사용되는 분석방법으로는 뿌리배양으로부터 생산된 데커시놀 안젤레이트의 정확한 정량분석이 불가능하다.

이에 본 발명자들은 뿌리배양한 참당귀 뿌리조직으로부터 생산된 데커시놀 안젤레이트의 정확한 정량분석을 위하여 HPLC 분석시 적당한 분석용 컬럼 및 최적의 자외선(UV) 파장을 선정함으로써 분석조건을 확립하였다.

우선, 본 발명자들은 데커신과 데커시놀 안젤레이트가 혼합되어 있는 표준물질을 역상(reverse phase) C-18 컬럼을 이용하여 HPLC 분석을 수행하여 두 개의 피크를 검출하였으며, 앞쪽에 분리된 피크(체류시간 20.58분)가 데커신이고 뒤쪽에 분리된 피크(체류시간 21.55분)가 데커시놀 안젤레이트로서 두 피크의 면적(area) 비가 3.18 : 2임을 확인하였다(도 4참조). 이러한 결과는 기존에 다른 분석방법에 의해 보고된 결과와 거의 유사한 것으로서 상기 C-18 컬럼을 이용한 HPLC 분석방법이 참당귀 뿌리배양으로부터 생산된 데커시놀 안젤레이트를 분석하는데 유용함을 알 수 있다.

또한, 본 발명자들은 역상컬럼을 이용한 HPLC 분석시 데커시놀 안젤레이트의 최적 파장을 찾기 위하여, 분광광도계(spectrophothmeter)로 데커신 표준물질의 자외선(UV) 파장을 분석하여 기존의 분석방법에서 사용된 254 nm 파장보다 330 nm 파장에서 가장 높은 O.D 값을 나타냄을 확인하고 330 nm를 HPLC 분석시 최적 파장으로 결정하였다(도 5참조).

이에 본 발명자들은 역상 C-18 컬럼을 이용하여 330 nm 파장에서 측정하는 HPLC 분석방법을 이용하여 데커신 및 데커시놀 안젤레이트의 혼합 표준물질을 농도에 따라 비례적으로 정량분석함으로써 상기와 같은 조건의 HPLC 분석방법이 참당귀 뿌리배양 추출물로부터 데커시놀 안젤레에트를 분석하는 데 유용함을 확인하였다(도 6, 도 7및도 8참조).

마지막으로, 본 발명자들은 참당귀 뿌리배양시 식물의 신호전달 기작에 관여하는 유도물질인 메틸자스모네이트를 첨가하여 데커시놀 안젤레이트의 생산성이 증가함을 확인하였다.

식물세포배양에서는 이차대사산물의 생산을 촉진하기 위하여 첨가되는 다양한 생명성 유도물질(biotic elicitor) 또는 비생명성 유도물질(abiotic elicitor)이 알려져 있으며, 상기 유도물질들은 여러가지 파이토알렉신(phytoalexin)들의 생성을 자극하여 이차대사산물의 생산을 유도한다. 배양시 적절한 유도물질의 첨가는 이차대사산물의 생성을 수 배에서 수십 배까지 증가시키며, 특히 식물의 방어 기작과 관련된 이차대사산물의 합성을 더욱 촉진시킨다. 데커신류는 쿠마린 계열의 물질로서 페닐알라닌(phenylalanine)으로부터 페닐알라닌 암모니아 라이에이즈(phenylalanine ammonia lyase ; PAL)에 의해서 합성이 진행되므로 상기 유도물질에 의해 데커신류의 생성을 쉽게 촉진할 수 있을 것으로 예상된다.

이에, 본 발명자들은 데커신류의 생산을 촉진시킬 수 있는 유도물질로서 최근에 식물의 신호전달(siganl transduction) 기작에 관여하고 유도물질의 일종으로 인식되고 있는 메틸자스모네이트(methyl jasmonate)를 선택하여 이의 유도효과를 조사한 결과, 메틸자스모네이트를 50 μM 농도로 첨가하였을 때 뿌리배양으로부터생산되는 데커시놀 안젤레이트의 양이 최대 2배 이상 증가함을 확인하였다(도 9및도 10참조).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 참당귀 뿌리배양의 최적화

<1-1> 참당귀 뿌리배양

한국약초에서 구입한 참당귀 씨앗을 70% 에탄올 용액과 4% NaOCl 용액으로 살균한 뒤 멸균 증류수로 세척한 후 SH 반고체(agar) 배지에서 발아를 유도하였다. 반고체배지에서 배양한 당귀 소식물체(plantlet)의 뿌리 조직을 상기와 동일한 SH 액체배지(30 g/L sucrose, pH 5.8)에 옮긴 후 원심회전 진탕배양기에서 120 rpm, 24 ℃, 암조건으로 계대배양을 유도하였다.

<1-2> 참당귀 뿌리배양시 생장률 증대를 위한 생장조절제의 선택

뿌리배양의 경우 현탁세포배양에 비해 초기 생장속도가 느리기 때문에 초기 생장률의 증대를 도모하기 위하여, 배지 내 다양한 식물생장조절제를 첨가하여 뿌리생장에 미치는 영향을 조사하였다.

구체적으로, 참당귀 뿌리배양의 생장증대를 위해 가장 적절한 옥신(auxin)을선택하기 위하여 SH 배지에 2,4-D(2,4-디클로로페녹시 아세틱에시드, 2,4-dichlorophenoxy acetic acid), NAA(1-나프탈렌아세틱에시드, 1-naphtalene acetic acid), IBA(3-인돌뷰트릭에시드, 3-indolebutyric acid) 및 IAA(인돌아세틱에시드, indole acetic acid)를 첨가한 후 생체중량(fresh weight)으로 1.2 g/flask의 뿌리절편을 접종하였다. 이를 2주간 배양한 후 각각의 생체중량을 측정하여 식물생장조절제가 첨가되지 않은 대조군과 비교하여 하기 표 1에 나타내었다.

<표 1> 식물생장조절제의 뿌리생장에 미치는 영향

	SH 배지	SH 배지 + 카제인 (0.6g/L)
옥신	-	2,4-D	NAA	IBA	IAA	-	2,4-D	NAA	IBA	IAA
FW (g/L)	5.62	5.78	10.67	18.50	9.24	5.29	9.33	18.72	18.54	6.10

증식이 유도된 뿌리조직을 외형상으로 관찰한 결과, 2,4-D는 뿌리조직의 길이생장을 촉진하였고, NAA 및 IBA는 부정근의 생장을 유발하였으며, IAA는 어떠한 특징을 나타내었다. 상기 표 1에 나타난 바와 같이, 2,4-D가 첨가된 배지에서는 생장 조절제를 첨가하지 않은 대조구와 비교하여 생체중량이 거의 증가하지 않아 2,4-D가 뿌리생장에 별다른 영향을 미치지 않았으며, NAA 및 IAA가 첨가된 배지에서는 대조군에 비하여 2배 정도 생체중량이 증가하였다. 반면, IBA가 첨가된 배지에서는 대조군에 비하여 3.5배 이상 생체중량이 증가되었으며, 생체중량으로 18.50 g/L는 건조중량(dry weight)으로 2.13 g/L 에 해당하는 양으로 초기 접종양이 1.2 g/flask 인 것을 고려할 때 2배 이상 뿌리생장이 촉진되었음을 알 수 있다.

한편, 아미노산 복합체로서 식물세포배양을 유도한다고 알려진 카제인을 배지에 함께 첨가하여 생장조절제와의 뿌리생장 유도효과를 비교한 결과, 표 1에 나타난 바와 같이 생장촉진 활성이 낮았던 2,4-D 및 NAA는 카제인의 첨가로 인해 뿌리생장이 2배 정도 증가한 결과를 나타내었으나, IAA는 카제인의 첨가로 인해 오히려 뿌리생장이 감소하는 결과를 나타내었다.

따라서, 본 발명자들은 참당귀 뿌리배양시 초기 뿌리생장을 촉진하기 위해 유용한 생장조절제로서 IBA가 가장 효과적임을 확인하였다.

<1-3> 참당귀 뿌리배양시 시간에 따른 뿌리생장 변화 측정

상기 실시예를 통하여 참당귀의 뿌리배양시 생장촉진을 위한 가장 효과적인 식물생장조절제가 IBA임을 확인하고 이를 SH 배지에 첨가한 후 배양시간에 따른 뿌리생장 변화를 조사하였다.

그 결과, 배양시작 2주 후에는 건조중량으로 거의 7 g/L에 이르는 생장이 가능하였는데, 이러한 결과는 초기에 접종된 건조중량이 1 g/L 이하인 것을 고려한다면 캘러스나 현탁세포 배양시보다 우수한 생장촉진 결과이다(도 1). 따라서, 본 발명자들은 장기간 지속적이며 안정적으로 뿌리조직을 배양할 수 있는 본 발명의 참당귀 뿌리배양방법이 참당귀로부터 데커시놀 안젤레이트를 효과적으로 생산하는 데 매우 유용함을 확인하였다.

<실시예 2> 뿌리배양된 조직으로부터 데커시놀 안젤레이트의 추출

<2-1> 열수추출방법

상기 실시예 1의 뿌리배양방법에 의해 증식된 뿌리조직으로부터 데커신류를 추출하는 방법은 현탁세포 배양액, 캘러스, 생당귀 또는 건조상태의 당귀 한약재로부터 추출하는 기존의 방법과는 달라야 한다. 이에 본 발명자들은 뿌리배양으로부터 얻은 뿌리조직에서 효과적으로 데커신류를 추출할 수 있는 추출방법을 개발하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1과 같이 뿌리배양된 참당귀 뿌리조직 시료를 건조시켜 막자사발로 곱게 빻은 후 70% 에탄올(ethanol)을 첨가하였다. 이를 추출용기에 넣은 후 항온조를 사용하여 50℃ 온도를 유지하는 가열조건에서 추출하였다. 이때, 추출용기는 추출과정 중 유기용매의 손실을 방지하기 위하여 밀봉이 가능한 플라스크(flask)를 사용하였다. 이로부터 일정량의 추출액을 취한 후 질소증발농축기(OA-SYS Heating system, Organomation Associates,Inc.)를 사용하여 추출액으로부터 에탄올 성분을 증발시켰다. 증발되고 남은 추출액에 동량의 클로로포름(chloroform)을 첨가하여 혼합함으로써 데커신류를 유기용매 층으로 이동시켰다. 이를 일정시간 동안 방치하여 완전하게 층을 분리시킨 후 일정량의 유기용매 층을 취하여 질소증발기를 사용하여 클로로포름을 증발시켰다. 유기용매가 증발되고 남은 잔사(residue)를 HPLC용 메탄올(methanol, Fisher Scientific)에 용해시킨 후 막 여과기(membrane filter, CE Minisart RC 4,0.45 ㎛, sartorious)로 여과(filtration)하여 HPLC 분석에 사용하였다.

초기 시험추출 결과 뿌리배양된 참당귀 뿌리조직으로부터 얻은 추출물에서는데커신은 거의 검출되지 않고 주로 데커시놀 안젤레이트가 검출되었으며, 이로부터 본 발명자들은 데커시놀 안젤레이트를 추출과정 최적화를 위한 대상으로 하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

상기 열수추출방법과 추출효율을 상대적으로 비교하기 위하여 싹슬렛 추출기(soxhlet extractor, 수도구마가와 싹슬렛, OMG)를사용하여 뿌리배양된 뿌리조직 시료로부터 데커신류를 추출하였으나 추출시마다 큰 오차를 나타내었으며 적은 양의 시료를 분석하기에는 적합하지 않았다.

<2-2> 추출 용매 및 조건의 최적화

뿌리배양된 참당귀 뿌리조직 시료로부터 데커시놀 안젤레이트를 추출하기 위해 가장 적절한 용매와 추출 조건을 결정하고자 본 발명자들은 다양한 용매를 사용하여 열수추출한 후 추출효율을 비교하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1과 같이 뿌리배양된 참당귀 뿌리조직을 건조시켜 막자사발로 곱게 빻은 시료에 100% 에탄올, 메탄올, 클로로포름 및 70% 에탄올을 유기용매로 사용하여 상기 <2-1>과 같이 50℃ 가열 조건에서 5시간 동안 열수추출을 수행하였고, 이와 추출효율을 비교하기 위하여 상온에서 초음파 분쇄기로 뿌리조직을 파쇄한 후 상기 용매들로 추출하였다.

그 결과, 50℃ 가열조건에서 열수추출하거나 초음파 파쇄기를 이용하여 추출한 두 경우 모두에서 70% 에탄올을 용매로 사용하는 경우의 추출효율이 다른 용매들에 비하여 높게 나타났으며, 50℃ 가열조건에서 에탄올을 이용하여 열수추출하는방법(추출효율 약 1.0 ㎎ 데커시놀 안젤레이트/g DCW)이 초음파 파쇄기를 이용하여 에탄올로 추출하는 방법(추출효율 약 0.7 ㎎ 데커시놀 안젤레이트/g DCW) 보다 우수한 추출효율을 나타내었다(도 2및도 3).

추출시간에 따라 추출효율이 변화하는지 확인하기 위하여, 70% 에탄올을 사용하여 50℃ 가열조건에서 1, 3 및 5 시간 동안 열수추출한 후 분석한 결과 추출시간에 따른 추출효율은 큰 변화를 나타내지 않았기 때문에 이후 모든 추출과정은 1시간 동안 수행하기로 결정하였다.

<실시예 3> 참당귀 뿌리배양으로부터 생산된 데커시놀 안젤레이트의 정량분석

<3-1> 역상 고성능 액체 크로마토그래피 분석

참당귀 뿌리배양으로부터 생산되는 데커시놀 안젤레이트를 효과적으로 분석하기 위해서는 데커시놀 안젤레이트의 구조 이성질체로 알려진 데커신과의 분리가 중요하다. 이에 본 발명자들은 상기 두 물질을 효과적으로 분리하기 위하여, 데커신과 데커시놀 안젤레이트가 혼합되어 있는 표준물질(고려대학교 김익환 교수로부터 제공받음)을 역상(reverse phase) C-18 컬럼인 렉스크롬 S5-100-ODS 컬럼(Rexchrome S5-100-ODS column, Regis Technology Inc.)이 장착된 HPLC(OROM Vintage 2000LC, OROM사)를 이용하여 분석하였다.

도 4에 나타난 바와 같이 HPLC 분석파장을 280 nm로 하여 측정한 결과, 혼합 표준물질은 2개의 피크(peak)로 분리되었는데, 앞쪽에 분리된 피크가 데커신이며 뒤쪽에 분리된 피크가 데커시놀 안젤레이트로서 상기 두 개 피크의체류시간(retention time)은 각각 20.58 및 21.55 분이었으며 면적(area) 비는 3.18 : 2 로 계산되었다. 이러한 결과는 일반적으로 참당귀에서 데커신 : 데커시놀 안젤레이트의 생산비가 3 : 2인 점을 감안할 때 기존에 다른 분석방법에 의해 보고된 결과들과 거의 유사한 결과임을 알 수 있다.

<3-2> 분광광도계 분석

상기 실시예 <3-1>에서와 같이 역상 C-18 칼럼이 장착된 HPLC를 이용하여 데커신 및 데커시놀 안젤레이트가 두 개 피크로 분리하는 방법은 기존에 알려진 방법과는 전혀 다른 분석방법으로서, 본 발명자들은 역상 C-18 컬럼을 이용한 분석 조건을 좀더 최적화하기 위하여 분광광도계(spectrophotometer, GENESYS 5, spectornic)를 이용하여 데커신 표준물질의 자외선 파장을 분석하였다.

그 결과, 330 nm에서 가장 높은 O.D 값을 나타내고 230 nm 이하에서 비교적 높은 O.D 값을 나타내었다(도 5). 이러한 결과는 기존에 데커신류의 분석을 위해 254 nm라는 막연한 파장을 사용한 분석방법과는 상이한 결과로서도 3에서 보면 254 nm에서 오히려 가장 낮은 O.D 값을 나타냄을 알 수 있다.

<3-3> HPLC 분석을 위한 최적파장 결정

역상 C-18 칼럼이 장착된 HPLC를 이용하는 본 발명의 분석방법의 최적파장을 결정하기 위하여, 상기 실시예 <3-2>의 분광광도계 분석을 통하여 가장 높은 O.D 값을 나타낸 330 nm와 그외 다른 파장 225 nm, 280 nm 및 기존에 사용된 254 nm의자외선 파장에서 데커신 및 데커시놀 안젤레이트가 혼합되어 있는 표준물질을 HPLC로 분석하였다.

자외선 파장을 225, 254, 280 및 330 nm로 변화하면서 HPLC로 분석한 결과, 분광광도계 분석과 동일하게 254 nm에서는 낮은 감도를 나타내었고, 225 nm와 330 nm에서 높은 감도를 나타내어 추후 데커시놀 안젤레이트의 HPLC 분석에 사용할 자외선 파장으로 330 nm가 적당함을 확인하였다. 여기서 주목할 점은 225, 254, 280 및 330 nm에서 각각의 HPLC 분석 결과, 앞쪽으로 분리되는 피크와 뒤쪽으로 분리되는 데커신 : 데커시놀 안젤레이트 피크간의 면적 비가 상기 파장의 변화에 따라 각각 2.27 : 1, 1.85 : 1, 1.59 : 1 및 1.56 : 1로 줄어든다는 사실이다. 이러한 결과는 데커신 및 데커시놀 안젤레이트 각각이 서로 다른 광학 특성을 가지고 있다는 증거이며, 이들의 정확한 분석을 위해서는 각각의 표준물질이 있어야 함을 의미한다.

<3-4> 최적화 조건을 이용한 데커신 및 데커시놀 안젤레이트 표준물질의 HPLC 분석

상기의 실시예로부터 렉스크롬 S5-100-ODS 역상 C-18 칼럼이 장착된 HPLC에 50% 아세토니트릴(acetonitrile)과 50% 3차 증류수의 혼합용액을 이동상으로 주입하면서 330 nm 파장에서 측정하는 방법이 데커시놀 안젤레이트를 분석하는 최적의 방법임을 확인하였다. 이에 본 발명자들은 상기와 같은 조건의 분석방법이 시료의 농도에 따른 비례적인 정량분석을 가능하게 하는지 조사하기 위하여 각각 10, 20,50 및 100 mg/L 농도로 제조된 데커신 및 데커시놀 안젤레이트의 혼합 표준물질을 상기의 HPLC 분석조건으로 분석하였다.

그 결과, 상기 표준물질의 농도가 증가함에 따라 앞쪽으로 분리되는 데커신 및 뒤쪽으로 분리되는 데커시놀 안젤레이트의 피크 모두 거의 정확하게 비례적으로 증가하는 직선의 결과를 나타내었다. 따라서, 본 발명의 렉스크롬 S5-100-ODS 역상 C-18 칼럼을 이용하여 330 nm 파장에서 측정하는 HPLC 분석방법이 데커시놀 안젤레이트의 정확한 정량분석을 가능하게 함을 확인하였다(도 6).

<3-5> 참당귀로부터 추출한 데커신 및 데커시놀 안젤레이트 표준물질과 합성 데커신의 분리 크로마토그램 비교

상기 실시예에서 HPLC에 의해 분리된 데커신 및 데커시놀 안젤레이트 혼합 표준물질의 분리 크로마토그램을 생명공학연구소에서 유기합성에 의해 얻어진 데커신의 분리 크로마토그램과 비교하였다.

도 7에 나타난 바와 같이 두 분리 크로마토그램을 비교한 결과, 앞쪽으로 분리되는 피크가 데커신이고 뒤쪽으로 분리되는 피크가 데커시놀 안젤레이트임을 확인하였다. 하지만, 합성 데커신의 경우 데커신 피크 앞쪽(약 18분대)에서 다른 잔여 피크가 나타났는데, 이는 합성 후 정제과정에서 순수하게 정제되지 못한 때문으로 생각된다. 따라서, 참당귀의 뿌리배양에 의해 증식된 뿌리조직의 추출물을 HPLC로 분석한도 8의 결과를 비교해 볼 때, 참당귀의 뿌리배양에 의해서는 주로 데커시놀 안젤레이트가 생산되고 소량의 데커신이 함께 생산되는 것을 확인하였다.

<실시예 4> 메틸자스모네이트 첨가에 의한 데커시놀 안젤레이트의 생산유도(elicitation)

본 발명자들은 데커시놀 안젤레이트의 생산성을 증가시키기 위하여, 식물의 신호전달(siganl transduction) 기작에 관여하는 물질로서 유도물질(elicitor)의 일종으로 인식되고 있는 메틸자스모네이트(methyl jasmonate)를 참당귀 뿌리배양시 첨가하여 이의 생산성 증대효과를 조사하였다.

구체적으로, SH 기본배지에 NAA 1 mg/L, 카제인 600 mg/L, 설탕(sucrose) 30 g/L를 첨가하여 제조한 배지 40 ㎖을 100 ㎖ 플라스크에 넣은 후 계대배양한지 10일 경과한 뿌리조직을 플라스크 당 0.4 g 생체중량으로 접종하여 25℃, 100 rpm 조건에서 배양하였다.

메틸자스모네이트는 배양시작 6일째에 플라스크에 첨가하였는데, 이는 상기 플라스크에 접종된 뿌리조직이 새 배지에 충분히 적응할 수 있는 시간을 주고 뿌리조직의 생장이 활발히 이루어지는 지수 증식기에 적용하기 위한 것이다. 메틸자스모네이트의 농도에 따라 참당귀 뿌리배양에서의 데커시놀 안젤레이트 생산에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 저농도(5, 10, 20, 30 및 50 μM) 및 고농도(50, 100, 200 μM)로 나누어 메틸자스모네이트를 첨가한 후 시간별로 채취한 뿌리조직을 상기 실시예 2의 열수추출방법에 의하여 추출한 후 상기 실시예 3의 HPLC 분석방법으로 데커시놀 안젤레이트의 생산량을 정량하였다.

도 9및도 10에 나타난 바와 같이, 메틸자스모네이트를 50 μM 농도로 첨가한 경우에 배양된 뿌리로부터 생산되는 데커시놀 안젤레이트의 생산량이 시간 및 메틸자스모네이트의 첨가농도에 따라 가장 많이 증가하는 양상을 나타내었다. 메틸자스모네이트 첨가 후 초반에는 데커시놀 안젤레이트의 생산량이 큰 차이를 나타내지 않았으나 점차 증가하여 배양 18일째(메틸자스모네이트 첨가 후 12일째)에는 대조구에 비해 데커시놀 안젤레이트의 생산량이 훨씬 증가되었다. 메틸자스모네이트를 첨가하지 않은 대조구의 경우에는 데커시놀 안젤레이트의 최대 생산량이 14일째에 4 ㎎/L이었으나, 50 μM의 메틸자스모네이트가 첨가된 경우에는 최대 생산량이 18일째에 9 ㎎/L까지 증가되어 두 배 이상의 생산량이 증가하는 효과를 나타내었다.

하지만, 메틸자스모네이트가 고농도(100 및 200 μM)로 첨가된 경우에는 오히려 50 μM 첨가된 경우보다 데커시놀 안젤레이트의 생산량이 현저하게 감소하였는데, 이러한 결과는 고농도의 메틸자스모네이트의 첨가로 인하여 뿌리조직의 생장 자체가 저해받기 때문인 것으로 판단되었다.

따라서, 본 발명자들은 참당귀 뿌리배양으로부터 최대의 데커시놀 안젤레이트를 생산하기 위한 최적의 메틸자스모네이트 농도를 50 μM로 결정하였다.

본 발명의 배양, 추출 및 분석방법은 식물조직배양 기술을 이용하여 참당귀 뿌리를 식물생장조절제와 유도물질이 첨가된 플라스크상에서 무균적으로 대량 배양하고, 상기 배양된 뿌리조직을 열수추출한 후 질소증발기를 사용하여 항암활성을갖는 데커시놀 안젤레이트를 추출하며, 이로부터 데커시놀 안젤레이트를 렉스크롬 S5-100-ODS 역상 C-18 컬럼을 이용하여 330 nm 파장에서 HPLC로 정량하는 방법을 제공함으로써, 기후, 토양 및 병충해 등의 자연환경에 영향을 받지 않으면서 차세대 항암활성 물질인 데커시놀 안젤레이트를 단시간안에 안정적으로 대량 생산하는 데 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (9)

1. 식물생장조절제인 IBA(3-인돌뷰트릭에시드, 3-indolebutyric acid) 또는 NAA(1-나프탈렌아세틱에시드, 1-naphtalene acetic acid)와 유도물질(elicitor)인 메틸자스모네이트(methyl jasmonate)를 포함하는 뿌리배양을 이용하여 참당귀(Angelica gigasNakai)로부터 항암활성 물질 데커시놀 안젤레이트(decursinol angelate)를 생산하기 위한 배양방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 1) 뿌리배양된 참당귀 뿌리조직 시료에 에탄올(ethanol)을 첨가하여 가열조건에서 추출하는 단계;

   2) 상기 추출액으로부터 에탄올 성분을 증발시키는 단계;

   3) 증발되고 남은 추출액에 동량의 클로로포름(chloroform)을 첨가하여 데커신류를 유기용매층으로 추출하는 단계; 및

   4) 유기용매층으로부터 클로로포름을 증발시켜 잔사(residue)를 얻는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는, 뿌리배양에 의하여 생산된 참당귀 뿌리조직으로부터 데커시놀 안젤레이트를 추출하기 위한 추출방법.
5. 삭제
6. 제 4항에 있어서, 단계 1의 가열조건은 온도를 50℃로 유지하는 것을 특징으로 하는 추출방법.
7. 뿌리배양에 의하여 생산된 참당귀 뿌리조직으로부터 추출한 데커시놀 안젤레이트를 역상 C-18 칼럼(reverse phase C-18 column)을 이용하여 정량하는 것을 특징으로 하는 크로마토그래피(chromatography) 분석방법.
8. 삭제
9. 제 7항에 있어서, 크로마토그래피 분석파장은 330 nm인 것을 특징으로 하는 분석방법.