CN105748547B - 一种从雪莲细胞培养物中提取分离活性组分的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从雪莲培养物中提取分离活性组分的方法。雪莲细胞培养物粉碎为粗粉，用乙醇水溶液超声波提取，过滤，提取1‑3次，每次20‑30分钟，合并滤液，减压浓缩，获得相对密度为1.10～1.20(60℃)的提取液，放冷至室温，加入乙醇和无机盐形成醇盐两相体系，萃取，抽取上层醇相，下层盐相再萃取一至二次，合并上层醇相，减压浓缩成稠膏，乙醇溶解、过滤，滤液减压干燥，即获得活性组分产物。本方法过程简单，条件温和，绿色环保，成本低，可有效提取分离雪莲培养物中活性组分。

Description

一种从雪莲细胞培养物中提取分离活性组分的方法

技术领域

本发明涉及一种从雪莲细胞培养物中提取分离活性组分的方法。

背景技术

雪莲为菊科(Compositae)凤毛菊属(Saussurea)多年生大型草本植物，具有补肾活血、强筋骨、营养神经、调节体液、温肾助阳、祛风胜湿、通经活血功能，用于风湿性关节炎、关节疼痛、肺寒咳嗽、风寒湿痹痛、小腹冷痛、月经不调等症的治疗。由于特殊的生长条件和大量的药材需求，野生雪莲资源遭到严重破坏，雪莲培养物是野生雪莲有效替代物质。雪莲培养物是选取雪莲离体组织，经脱分化形成的愈伤组织作为继代种子，给予一定条件进行继代培养而获得的团块状颗粒，或该颗粒经干燥粉碎得到的粉末，目前采用培养技术可以稳定生产获得公斤级雪莲培养物。现代药理研究证明雪莲培养物具有与野生雪莲类似的多种药理活性，包括镇痛、抗炎、抗风湿、抗氧化、抗疲劳等作用。急性和长期毒性实验证明雪莲细胞培养物与野生雪莲的毒性无显著性差异。国内和台湾地区已经批准雪莲作为新资源食品使用。

雪莲细胞培养物含有酚酸、苯丙素、黄酮等多种类型化学成分，其中1,5-二咖啡酰奎尼酸、绿原酸、紫丁香苷为雪莲细胞培养物中三种主要成分，达到细胞干重的0.5～2％。1,5-二咖啡酰奎尼酸是雪莲细胞培养物中一种高活性酚酸类物质，具有抗氧化、抗炎、抗肝损伤、抗病毒、提高免疫力等多种作用，该类物质在抗乙肝病毒和抗艾滋病病毒方面作用受到重点关注。紫丁香苷为苯丙素类化合物，具有抗炎镇痛降低血糖，抗抑郁，抗癌，降血脂，抗肝毒作用。通过选择外植体，筛选高产细胞、优化培养条件等方法，雪莲细胞培养物中活性成分含量得到不同程度提高，1,5-二咖啡酰奎尼酸和绿原酸含量提高2倍，紫丁香苷含量提高40倍。

赵德修采用雪莲细胞培养的方法生产活性成分紫丁香苷，用70％乙醇或正丁醇提取获得紫丁香苷活性部位(CN100404666)，并发展了一种提取细胞提取中多糖类成分的方法(CN1291030C)。没有针对1,5-二咖啡酰奎尼酸和绿原酸种活性成分分离工艺研究报道。雪莲细胞培养物中酚酸类活性成分化学性质不稳定，长时间高温提取分离过程易导致化学结构变化，活性功能降低，需要发展新方法用于雪莲细胞培养物活性成分的工业提取和分离。

天然产物经过适宜的提取分离过程，可去除无用物质，提高活性物质含量，实现降低服用量，提高治疗保健功能的目的。传统的植物药提取方法为水煎煮和溶剂回流提取法，提取时间长，能耗大，效率低，使用大量原料和溶剂，分离过程以柱层析为主，分离时间长，成本高，硅胶柱分离过程甚至使用二氯甲烷、甲醇等有毒有害有机溶剂。醇盐两相萃取体系是由亲水性醇、高价阴离子盐和水组成的溶液体系，通过调整醇盐浓度配比获得适宜的分配系数，可以有效获得活性组分，去除无效成分，实现绿色分离、降低成本的目的。

发明内容

本发明涉及一种从雪莲培养物中提取分离活性组分的方法。其特征在于雪莲细胞培养物粉碎为粗粉，用乙醇水溶液超声波提取，过滤，提取1-3次，每次20-30分钟，合并滤液，减压浓缩，获得相对密度为1.10～1.20(60℃)的提取液，放冷至室温，加入乙醇和无机盐形成醇盐两相体系，萃取，抽取上层醇相，下层盐相再萃取一至二次，合并上层醇相，减压浓缩成稠膏，乙醇溶解、过滤，滤液减压干燥，即获得活性组分产物。本方法具体步骤如下：

1)提取

将雪莲细胞培养物粉碎成粗粉，用体积浓度60～80％乙醇水溶液按照1g：10～20ml的比例超声波提取1-3次，每次20-30分钟，过滤，滤液合并，减压浓缩至相对密度(相对密度是我国药典(1部)中常用表示提取液浓缩情况的表示方法，为样品浓度与水比值，无单位。如需要，可使用绝对密度表示，即改为“密度为1.10-1.20g/ml”。)为1.10～1.20(60℃)，得提取液；

2)醇盐两相萃取

向提取液中加入乙醇和无机盐至雪莲提取液，搅拌均匀，静置分层，抽取上层醇相，下层盐相添加用无机盐水溶液预先饱和处理的新鲜乙醇(乙醇与无机盐水溶液混合后分层，两层都含有乙醇、水、无机盐，但上下层各物质浓度不同而形成分层。新鲜乙醇需要经过预饱和达到需要组成，避免下层组成变化导致不分层或萃取率不高)，再萃取一至二次，合并上层醇相，减压浓缩成稠膏，得含有无机盐的活性部位；

3)脱盐

将上述含盐活性部位用纯乙醇溶解，过滤，滤液减压干燥、即得活性组分产物。

醇盐双水相萃取过程中使用的盐为无机盐，包括硫酸铵、硫酸钠、碳酸钠、碳酸钾、磷酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾中的一种或二种以上。

醇盐双水相萃取过程中乙醇体积浓度控制在20～50％间，盐质量浓度控制在10～30％间。

采用本发明与传统方法相比具有以下优点：

1)本方法中提取过程可以高效低成本提取雪莲细胞培养物活性物质。雪莲细胞培养物经粉碎和超声波提取过程，可以在低温条件下有效提高提取效率，缩短提取时间，减少能耗。

2)本方法中分离过程可绿色低成本获得活性组分。萃取分离较柱层析过程具有成本低，处理量大，放大简单的特点。醇盐两相萃取不使用乙酸乙酯等有机溶剂，仅使用乙醇，无机盐，水作为溶剂，对环境友好，产物绿色环保。

附图说明

图1为实施例1种雪莲活性组分化学分析图。1：紫丁香苷，2：绿原酸，3：二咖啡酰奎尼酸。

图2为实施例1雪莲活性组分抗氧化分析图。A：DPPH实验；B：ABTS实验。

具体实施方式

现结合实施例和附图对本发明做进一步详细说明，实施例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

实施例1

100g雪莲细胞培养物粉碎成粗粉，用1000ml 60％乙醇水溶液超声提取两次，每次30分钟，滤过，滤液合并，减压浓缩，获得480ml相对密度1.10(60℃)的提取液，放冷，加入120ml乙醇和180g硫酸铵，搅拌均匀，静置分层，抽取上层醇相，下层盐相添加30％硫酸铵水溶液(g/ml)预饱和的新鲜乙醇，再萃取一次。合并上层醇相，减压浓缩成稠膏，得含盐活性部位。含盐活性部位用纯乙醇溶解，过滤，滤液减压干燥、即得4.8g活性组分产物。通过HPLC检测组分中1,5-二咖啡酰奎尼酸、绿原酸、紫丁香苷含量分别为14％、1.2％和2.1％，抗氧化实验显示组分具有很强抗氧化作用，其中DPPH半数清除值为29.6ug/mL，ABTS半数清除值为3.9ug/mL。

实施例2

100g雪莲细胞培养物粉碎成粗粉，用1500ml 80％乙醇水溶液超声提取两次，每次20分钟，滤过，滤液合并，减压浓缩，获得300ml相对密度1.20(60℃)的提取液，放冷，加入300ml乙醇和60g无机盐，搅拌均匀，静置分层，抽取上层醇相，下层盐相添加10％硫酸钠水溶液(g/ml)预饱和的新鲜乙醇，再萃取一次。合并上层醇相，减压浓缩成稠膏，得含盐活性部位。含盐活性部位用纯乙醇溶解，过滤，滤液减压干燥、即得4.5g活性组分产物。

实施例3

1000g雪莲细胞培养物粉碎成粗粉，用20000ml 60％乙醇水溶液超声提取两次，每次20分钟，滤过，滤液合并，减压浓缩，获得3000ml相对密度1.20(60℃)的提取液，放冷，加入3000ml乙醇和600g无机盐，搅拌均匀，静置分层，抽取上层醇相，下层盐相添加10％硫酸钠水溶液(g/ml)预饱和的新鲜乙醇，再萃取两次。合并上层醇相，减压浓缩成稠膏，得含盐活性部位。含盐活性部位用纯乙醇溶解，过滤，滤液减压干燥、即得55g活性组分产物。

实施例4

1000g雪莲细胞培养物粉碎成粗粉，用15000ml 70％乙醇水溶液超声提取两次，每次20分钟，滤过，滤液合并，减压浓缩，获得4000ml相对密度1.15(60℃)的提取液，放冷，加入4000ml乙醇和1200g无机盐，搅拌均匀，静置分层，抽取上层醇相，下层盐相添加15％硫酸钠水溶液(g/ml)预饱和的新鲜乙醇，再萃取两次。合并上层醇相，减压浓缩成稠膏，得含盐活性部位。含盐活性部位用纯乙醇溶解，过滤，滤液减压干燥、即得66g活性组分产物。

Claims (1)

1.一种从雪莲细胞培养物中提取分离活性组分的方法，其特征在于：

具体步骤如下：

1）提取

将雪莲细胞培养物粉碎成粗粉，用体积浓度60~80%乙醇水溶液按照1g：10~20 ml的比例超声波提取1-3次，每次20-30分钟，过滤，滤液合并，减压浓缩至在60℃时相对密度为1.10~1.20，得提取液；

2）醇盐两相萃取

向提取液中加入乙醇和无机盐至雪莲提取液，搅拌均匀，静置分层，抽取上层醇相，下层盐相添加用无机盐水溶液预先饱和处理的新鲜乙醇，再萃取一至二次，合并上层醇相，减压浓缩成稠膏，得含有无机盐的活性部位；醇盐双水相萃取过程中使用的盐为无机盐，其为硫酸铵或硫酸钠；醇盐双水相萃取过程中乙醇体积浓度控制在20~50%间，盐质量浓度控制在10~30%间；

3）脱盐

将上述含盐活性部位用纯乙醇溶解，过滤，滤液减压干燥、即得。