CN103961282B

CN103961282B - 一种基于浊点萃取法提取黑种草属植物种子中抗氧化成分的方法及应用

Info

Publication number: CN103961282B
Application number: CN201410203182.2A
Authority: CN
Inventors: 刘学; 韩王康; 曹光群; 杨成; 曹莹粲
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2014-05-14
Filing date: 2014-05-14
Publication date: 2016-09-14
Anticipated expiration: 2034-05-14
Also published as: CN103961282A

Abstract

本发明公开了一种基于浊点萃取法提取黑种草属植物种子中抗氧化成分的方法及应用，其中方法以脱脂后的黑种草属植物种子粉末为原料，加入表面活性剂溶液充分混合均匀，以超声波辅助提取，分离提取液和提取残渣，提取液中加入电解质调节离子强度，水浴加热到一定温度后恒温平衡，静置或离心后分相为表面活性剂的水溶液层和表面活性剂富集层。表面活性剂富集层可分别采用两种方式处理，一种方式直接除水后即得到具有抗氧化活性的表面活性剂混合物，可直接用于适宜类型的化妆品中；另一种方式采用大孔吸附树脂法分离回收表面活性剂，同时得到抗氧化活性粗提物。本发明方法工艺简单，不需使用有毒有害的有机溶剂，提取条件温和，产品抗氧化活性保留较好，有利于充分利用黑种草属种子资源以及开发天然抗氧化活性化妆品。

Description

一种基于浊点萃取法提取黑种草属植物种子中抗氧化成分的方法及应用

技术领域

本发明涉及一种天然活性成分的提取分离方法及其应用，具体涉及用于毛茛科黑种草属植物种子中抗氧化活性成分的提取方法及应用，属于化学技术领域。

背景技术

黑种草子为毛茛科植物腺毛黑种草(Nigella glandulifera Freyn)的干燥成熟种子，主要分布于我国新疆和云南，作为维吾尔族和傣族习用药材沿用数千年，并被收入《中华人民共和国药典》一部中，具有补肾健脑，通经，利尿等功效。现代药理研究表明，黑种草子在对肝肾的保护作用、抗氧化方面具有显著的效果。目前对黑种草子活性的药理研究大多以有机溶剂萃取法的粗提物为研究对象，如甲醇、乙醇或丙酮等溶剂粗提物，其中存在有机溶剂使用多、环境不友好、不利于工业化生产等缺点。另外，现在对于黑种草子的利用主要是提取其油脂用于食品和保健品等相关领域，残余的籽粕基本被当作垃圾处理，但经研究发现，其中仍含有较多的抗氧化、镇咳平喘、抗癌等活性成分。因此，研究一种简单、高效、经济、环保的方法从脱脂黑种草子中提取活性物质，将有利于扩大黑种草子的资源利用率以及开发新药源。

浊点萃取(Cloud point extraction，CPE)是近些年来发展起来的一种新型液-液萃取技术，它以表面活性剂的水溶液代替有机溶剂作为萃取剂，利用表面活性剂的增溶和浊点现象而实现高效提取。目前，CPE已较多的应用于金属离子、多环芳烃、大分子类物质的富集和分析领域，在天然植物活性成分提取方面的研究比较少。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有提取黑种草属植物种子中抗氧化成分的方法及其应用中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明的一个目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供了一种提取黑种草属植物种子中抗氧化性成分的方法，是基于超声波辅助－浊点萃取法，并以提取物的体外抗氧化能力为指标，优化了提取工艺。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种基于浊点萃取法提取黑种草属植物种子中抗氧化成分的方法，包括，提取步骤，按固液比g/mL为1:20～35，称取脱脂黑种草属植物种子粉碎物，加入浓度为10～40g/L的表面活性剂溶液，超声波辅助提取30～40分钟，过滤，得到固体滤渣和抗氧化活性成分提取液；浊点分相萃取步骤，向所述抗氧化活性成分提取液中加入氯盐，调节离子强度为0.5～1.5mol/L，再将提取液恒温平衡40～60分钟，静置或离心至分相清晰，分出水相和表面活性剂富集相；除水步骤，将所述表面活性剂富集相在≤50℃的条件下真空干燥除水，得到具有抗氧化活性的表面活性剂混合物。

作为本发明所述方法的一种优选方案，其中：在所述提取步骤前，还包括，原料预处理步骤，将黑种草属植物种子粉碎，粉碎粒度为能通过0.5mm孔径的筛网，以石油醚脱脂两次，药渣挥干溶剂得到脱脂黑种草属植物种子粉碎物。

作为本发明所述方法的一种优选方案，其中：所述表面活性剂为非离子表面活性剂，包括聚氧乙烯甘油醚单硬脂酸酯、聚氧乙烯甲基葡萄糖苷硬脂酸、Triton X-110、Triton X-114中的一种或几种。

作为本发明所述方法的一种优选方案，其中：所述恒温平衡其温度为30～50℃。

本发明的另一个目的是提供另一种提取黑种草属植物种子中抗氧化性成分的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种基于浊点萃取法提取黑种草属植物种子中抗氧化成分的方法，包括，提取步骤，按固液比g/mL为1:20～35，称取脱脂黑种草属植物种子粉碎物，加入浓度为10～40g/L的表面活性剂溶液，超声波辅助提取30～40分钟，过滤，得到固体滤渣和抗氧化活性成分提取液；浊点分相萃取步骤，向所述抗氧化活性成分提取液中加入氯盐，调节离子强度为0.5～1.5mol/L，再将提取液恒温平衡40～60分钟，静置或离心至分相清晰，分出水相和表面活性剂富集相；洗脱步骤，将所述表面活性剂富集相以体积比为1:1～5的水溶解稀释，通过预处理好的AB-8大孔吸附树脂层析柱，以3～5倍柱体积的水洗脱得流分并经回收溶剂干燥，得到黑种草种子粗蛋白；以3～5倍柱体积的乙醇溶液洗脱得流分并经回收溶剂干燥，得到抗氧化活性成分粗提物。

作为本发明所述方法的一种优选方案，其中：所述洗脱步骤中，在得到所述抗氧化活性成分粗提物后，还包括，以3～5倍柱体积的95％乙醇得流分并经回收溶剂干燥，回收表面活性剂。

作为本发明所述方法的一种优选方案，其中：所述洗脱步骤中，以3～5倍柱体积的乙醇溶液洗脱得流分并经回收溶剂干燥，得到抗氧化活性成分粗提物，其中，洗脱流分的乙醇浓度为40～70％。

本发明的再一个目的是提供一种根据上述方法提取黑种草属植物种子中抗氧化成分在化妆品领域的应用。

本发明方法工艺简单，不需使用有毒有害的有机溶剂，提取条件温和，产品抗氧化活性保留较好，有利于充分利用黑种草属种子资源以及开发天然抗氧化活性化妆品。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

实施例1

本实施例中，基于浊点萃取法提取黑种草属植物种子中抗氧化成分的方法，包括提取步骤、浊点分相萃取步骤以及除水步骤，具体为：

步骤一：提取步骤

按固液比g/mL为1:20，称取脱脂黑种草属植物种子粉碎物，加入浓度为10g/L的表面活性剂聚氧乙烯甘油醚单硬脂酸酯溶液，超声波辅助提取30分钟，过滤，得到固体滤渣和抗氧化活性成分提取液。

步骤二：浊点分相萃取步骤

向提取步骤中得到的抗氧化活性成分提取液中加入氯化钠，调节离子强度为0.5～1.5mol/L，再将提取液置于恒温水浴中，恒温平衡40分钟，静置或离心至分相清晰，分出水相和表面活性剂富集相。

步骤三：除水步骤

将表面活性剂富集相直接在50℃真空干燥除水，得到具有抗氧化活性的表面活性剂混合物。

当然，在实际操作中，还可以包括原料预处理步骤，该原料预处理步骤可以设置在提取步骤之前，即：

称取100g当年采收的黑种草属植物种子，用万能粉碎机粉碎，使通过0.5mm孔径的标准筛网，以石油醚脱脂两次，药渣挥干溶剂，备用。

实施例2

本实施例中，基于浊点萃取法提取黑种草属植物种子中抗氧化成分的方法，包括提取步骤、浊点分相萃取步骤以及洗脱步骤，具体为：

步骤一：提取步骤

按固液比g/mL为1:35，称取脱脂黑种草属植物种子粉碎物，加入浓度为40g/L的表面活性剂Triton X-114溶液，超声波辅助提取40分钟，过滤，得到固体滤渣和抗氧化活性成分提取液。

步骤二：浊点分相萃取步骤

向提取步骤中得到的抗氧化活性成分提取液中加入氯化钠，调节离子强度为0.5～1.5mol/L，再将提取液置于恒温水浴中，恒温平衡60分钟，静置或离心至分相清晰，分出水相和表面活性剂富集相。

步骤三：洗脱步骤

将所述表面活性剂富集相以体积比为1:1的水溶解稀释，通过预处理好的AB-8大孔吸附树脂层析柱，以3倍柱体积的水洗脱得流分并经回收溶剂干燥，得到黑种草种子粗蛋白；以3倍柱体积的乙醇溶液洗脱得流分并经回收溶剂干燥，得到抗氧化活性成分粗提物。

在洗脱步骤后，可以包括回收步骤，以3～5倍柱体积的95％乙醇得流分并经回收溶剂干燥，回收表面活性剂。

以实施例1和实施例2为提取工艺的实验设计，发现影响提取效率的主要因素有：表面活性剂浓度、固液比、离子强度和平衡时间。

因此，在表面活性剂浓度(以下简称表活浓度)为10～40g/L、固液比g/mL为1:20～35、离子强度0.5～1.5mol/L，以及平衡时间40～60分钟内，以DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基的清除率为指标，采用单因素实验法考察各因素对提取物抗氧化性能的影响，在此基础上采用L₉(3⁴)正交设计进行选择实验，筛选最佳提取工艺条件。

准确配置浓度为0.125mmol/L的DPPH标准溶液，按添加反应液，用力摇匀，并将在室温黑暗处静置60min后，以无水乙醇为参比，在517nm处测定吸光值，测出A₁、A₂和A₀所表示样品的吸光值，自由基清除率(Y)按下式计算：

Y＝[1-(A₁-A₂)/A₀]×100％

CPE的正交实验结果：

L₉(3⁴)正交实验结果及极差分析

如上表结果所示，以清除DPPH自由基能力为正交实验的优化指标进行极差分析，发现在实验范围内，表活浓度对清除DPPH自由基能力影响最大，其次是平衡时间的影响，再次是离子强度的影响，最后影响因素是固液比。根据正交分析的各因素中最大的k值所对应的水平，可以初步得出最优组合为A3B3C1D2，即平衡时间50min，液固比35:1，离子强度0.513mol·L^-1，表活浓度40g·L^-1，其所得活性物质有良好的抗氧化性，证明此方法可以有效的获得黑种草子脱脂物(DF-NG)中活性物质。在此条件下得到提取物抗氧化成分13.9g。表面活性剂可进一步通过柱层析或超滤法进行回收利用。另外，亦可将提取物直接开发为具有抗氧化活性的表面活性剂，用于化妆品或药品领域。

不难看出，本发明以抗氧化性能为指标，优化以CPE提取黑种草子中抗氧化活性成分的提取工艺，其操作步骤简单，应用范围广，不使用挥发性有机溶剂，表面活性剂可回收，活性成分在提取过程中不易变性，经济，安全，且具有易于放大，对环境友好的特点。在提取过程中，如果选择水为主要提取溶剂，同时利用CPE的特性，将有利于开发更具生物活性的产品，将其成功应用于天然产物活性成分提取是可以预期的。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种基于浊点萃取法提取黑种草子中抗氧化成分的方法，其特征在于：包括，

提取步骤，按固液比g/mL为1:20～35，称取脱脂黑种草子粉碎物，加入浓度为10～40g/L的表面活性剂溶液，超声波辅助提取30～40分钟，过滤，得到固体滤渣和抗氧化活性成分提取液；

浊点分相萃取步骤，向所述抗氧化活性成分提取液中加入氯盐，调节离子强度为0.5～1.5mol/L，再将提取液恒温平衡40～60分钟，静置或离心至分相清晰，分出水相和表面活性剂富集相；

除水步骤，将所述表面活性剂富集相在≤50℃的条件下真空干燥除水，得到具有抗氧化活性的表面活性剂混合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述提取步骤前，还包括，

原料预处理步骤，将黑种草子粉碎，粉碎粒度为能通过0.5mm孔径的筛网，以石油醚脱脂两次，药渣挥干溶剂得到脱脂黑种草子粉碎物。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述表面活性剂为聚氧乙烯甘油醚单硬脂酸酯、聚氧乙烯甲基葡萄糖苷硬脂酸、Triton X-110、Triton X-114中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述恒温平衡其温度为30～50℃。

5.一种基于浊点萃取法提取黑种草子中抗氧化成分的方法，其特征在于：包括，

洗脱步骤，将所述表面活性剂富集相以体积比为1:1～5的水溶解稀释，通过预处理好的AB-8大孔吸附树脂层析柱，以3～5倍柱体积的水洗脱得流分并经回收溶剂干燥，得到黑种草种子粗蛋白；以3～5倍柱体积的乙醇溶液洗脱得流分并经回收溶剂干燥，得到抗氧化活性成分粗提物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述洗脱步骤中，在得到所述抗氧化活性成分粗提物后，还包括，

以3～5倍柱体积的95％乙醇得流分并经回收溶剂干燥，回收表面活性剂。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：在所述提取步骤前，还包括，

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述洗脱步骤中，以3～5倍柱体积的乙醇溶液洗脱得流分并经回收溶剂干燥，得到抗氧化活性成分粗提物，其中，洗脱流分的乙醇浓度为40～70％。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述表面活性剂为聚氧乙烯甘油醚单硬脂酸酯、聚氧乙烯甲基葡萄糖苷硬脂酸、Triton X-110、Triton X-114中的一种或几种。