CN112675121A - 一种提取天山雪莲细胞功能活性物质的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提取天山雪莲细胞功能活性物质的方法及其应用，属于植物功能活性成分提取技术领域。本发明提取天山雪莲细胞功能活性物质的方法包括以下步骤：取新鲜的天山雪莲细胞，使用纯水清洗，真空抽干表面水分；洗净的天山雪莲细胞添加纯水，破壁处理，获得提取液；依次使用孔径不同的滤膜过滤提取液，获得滤过液，分装保存。本发明公开的提取方法操作简单，提取效率高，活性成分得率高，提高了工业生产效率。

Description

一种提取天山雪莲细胞功能活性物质的方法及其应用

技术领域

本发明涉及植物功能活性成分提取技术领域，具体涉及一种提取天山雪莲细胞功能活性物质的方法及其应用。

背景技术

天山雪莲是我国西部高寒地区民间常用的一味名贵中草药，为菊科凤毛菊属植物，雪莲主要生长在海拔4800-5800m的高山流石坡以及雪线附近的碎石间，主要分布在新疆天山、昆仑山、帕米尔高原及阿尔泰山一带。雪莲应用历史悠久，尤其作为药用，主要含有黄酮、倍半萜内酯、香豆素、有机酸、多糖等，具有抗氧化、抗风湿、镇痛、调节心血管系统、抗癌等生物活性。由于近些年的滥采滥挖，野生的天山雪莲数量大幅减少，其使用受到限制。

通过植物细胞培养技术培养的天山雪莲具有使用成本低，功效含量高的特点。本发明的雪莲细胞是由天山雪莲通过植物细胞培养技术得到的(具体培养方法详见ZL200510115902.0)，其颜色、形状与天山雪莲并不完全不同，而且雪莲培养物中黄酮、多糖、绿原酸、紫丁香甙的含量均远高于野生的天山雪莲，此外，雪莲细胞中还不含有天山雪莲中的秋水仙碱这一少量毒性成分。

现有技术中多采用有机溶剂进行功能活性成分的提取，提取完成后，部分有机溶剂难以除去，造成有机溶剂残留超标，并且天山雪莲的活性成分均为易氧化分解组分，蒸发有机溶剂过程也会导致天山雪莲的功能活性成分的部分失活或分解。开发一种能够有效保障天山雪莲细胞水提取物活性的方法成为当前急需解决的问题。

发明内容

为了解决背景技术中所述的技术问题，本发明公开了一种提取天山雪莲细胞功能活性物质的方法及其应用，具体技术方案如下：

一种提取天山雪莲细胞功能活性物质的方法，包括以下步骤：

(1)取新鲜的天山雪莲细胞，使用纯水清洗，真空抽干表面水分；

(2)洗净的天山雪莲细胞添加纯水，破壁处理，获得提取液；

(3)依次使用孔径不同的滤膜过滤步骤(2)得到的提取液，分装，于-5℃保存。

进一步的，步骤(1)中的清洗过程为清洗1次或多次，或者使用流水连续清洗。

进一步的，步骤(1)中的清洗过程中纯水使用量为天山雪莲细胞重量的1～5倍。

进一步的，步骤(2)中破壁方法为冷冻融化法、匀浆法或二者的组合。

进一步的，步骤(2)中天山雪莲细胞的重量和水的重量比为1:1-1:10。

进一步的，冷冻融化法的温度为-80～-20℃，反复冷冻融化1～10次。

进一步的，匀浆法的转速为1000～30000rpm，匀浆时间为0.1～10min/次，反复匀浆1～10次。

进一步的，破壁处理后再进行浸泡提取，浸泡温度范围-5～50℃，浸泡时间0.1～10天。

进一步的，破壁处理后再进行超声提取，超声功率为10W～100kW，超声频率，20KHz-100KHz,超声时间10～60min/次，反复重复1-10次。

进一步的，破壁处理后再进行微波提取，微波频率范围为300MHz～300GHz，微波处理时间1～30min，微波处理温度0～60℃。

进一步的，步骤(3)中最终使用孔径为0.45um的滤膜过滤；或者，通过高速离心方式去除沉淀，保留上清溶液，或者，采用孔径小于0.45um的过滤离心的方式去除杂质，最终获得澄清的细胞水提取物。

进一步的，步骤(3)中得到的提取液加入防腐剂进行保存，也可以使用旋蒸等方式去部分水分获得高浓度提取物。

本发明另一方面提供了由上述方法制备的天山雪莲细胞功能活性物质，所述天山雪莲细胞功能活性物质的组分包括黄酮、多肽、氨基酸、多糖、绿原酸、紫丁香苷、 1,5-二咖啡酰奎等物质。

本发明还提供了天山雪莲细胞功能活性物质在制备功能食品和化妆品中的应用。

进一步的，化妆品为面霜、眼霜、乳液、精华液、护肤水、面膜或洗面乳。

本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：

1.本发明采用破壁和超滤相结合的方法提取天山雪莲细胞，两者的结合保证了提取的充分性，又能够获得合适粒径的提取物，其相比普通的提取方法，操作简单，提取效率高，活性成分得率高，提高了工业生产效率。

2.本发明所述的提取方法可有效保障天山雪莲细胞水提取物的活性，提取物具有吸收紫外线、抗辐射、抗炎镇痛以及抗衰老等功能。

3.本发明所述的提取方法获得的天山雪莲功能成分不仅可用于保健食品和药品方面，还可以作为美容美妆产品的添加成分。

4.本发明还对功能活性成分主要成分的含量进行了分析，为后续进一步的利用提供了参考依据。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本发明的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本发明的保护范围。

天山雪莲细胞水提取物的理化性质和含量分析：

1.天山雪莲细胞水提取物DPPH自由基清除率的测定：

将提取物稀释100，50，33，25，20倍与对照品维生素C分别稀释成浓度为 10μg/mL，20μg/mL，30μg/mL，40μg/mL，50μg/mL的梯度稀释液。

取各浓度150μL样品和150μL浓度为60mg/L的DPPH溶液(无水乙醇稀释)置于96孔板中，混合均匀，30℃避光保存，30min后使用酶标仪测量519nm下吸光度值。维生素C为阳性对照，DPPH自由基清除率公式如下：

式中，A空白为150μL纯净水和150μL DPPH溶液的吸光度，A样品为150μL 样品和150μL DPPH溶液的吸光度；IC₅₀为DPPH自由基清除率达到50％时样品的浓度。

2.天山雪莲细胞水提取物ABTS自由基清除率的测定：

(1)将天山雪莲细胞水提取物稀释100，50，33，25，20倍与对照品维生素C分别稀释成浓度为10μg/mL，20μg/mL，30μg/mL，40μg/mL，50μg/mL的梯度稀释液。

(2)将7mmol/L的ABTS溶液和140mmol/L的高硫酸钾溶液以62.5：1的比例混合，室温避光静置过夜，形成ABTS储备液，使用前用无水乙醇稀释成5mmol/L的 ABTS工作液。

(3)取0.15mL上述天山雪莲细胞水提取物稀释液样品与2.85mL ABTS工作液混合，30℃下静置8min，以纯净水为空白在734nm下测定吸光度。

ABTS自由基清除率公式如下：

式中，A空白为0.15mL纯净水和2.85mL ABTS工作液的吸光度，A样品为0.15mL 样品和2.85mL ABTS工作液的吸光度。IC₅₀为ABTS自由基清除率达到50％时样品的浓度。

3.天山雪莲细胞水提取物总黄酮含量测定：

对照品溶液的制备：精密称取在120℃干燥至恒重的芦丁对照品10mg，置50mL 容量瓶中，加甲醇适量，水浴加热使溶解，放冷，加甲醇至刻度，摇匀。即得(每 mL中含无水芦丁0.2mg的对照品溶液)；

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL，分别置25mL容量瓶中，各加水至6mL，加5％亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置6min，加10％硝酸铝1mL，摇匀，放置6min，加氢氧化钠试液10mL，再加水至刻度，摇匀，放置15min，以未添加芦丁的相应试剂为空白，在500nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；

含量测定：取提取液1g，加甲醇定容到50ml容量瓶中摇匀。精密量取5mL，置25mL容量瓶中，然后按照标准曲线制备所述的方法进行，测定500nm处吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含总黄酮的重量(mg)，计算，即得。

4.天山雪莲细胞水提取物含量测定：

精密称取天山雪莲细胞水提取物2ml置于具塞试管中，用20％甲醇50mL超声提取10min，用甲醇补足失重，15000r/min离心20min，取上清过0.45μm滤膜过滤，通过HPLC同时测定紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸的含量，使用的色谱柱为C₁₈色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；

流动相A为0.2％磷酸缓冲盐溶液(含50mmo/L KH₂PO₄)，流动相B为乙腈，梯度洗脱，梯度条件：0min(V_A∶V_B＝92∶8)～20min(V_A∶V_B＝90∶10)～50min (V_A∶V_B＝70∶30)～60min(V_A∶V_B＝50∶50)；流速1.0mL/min；柱温30℃；检测波长265nm；进样量20μl。

实施例1

A、取新鲜的天山雪莲细胞，使用5倍量的纯水洗涤雪莲细胞2次；

B、雪莲细胞冲洗干净后，放入烧杯中加入1倍量纯水，用均质器进行匀浆，匀浆法的转速为18000rpm，匀浆时间为2min/次，反复匀浆3次：

C、匀浆后的雪莲细胞水，依次使用10μm，2μm，0.45μm的滤膜进行过滤，最终全部通过0.45um滤膜，即得到天山雪莲细胞水提取物，分装，-5℃保存。

经测定，提取物中含总黄酮0.12％，绿原酸0.011％，紫丁香苷0.001％，1,5-二咖啡酰奎宁酸0.013％，DPPH自由基清除实验的IC₅₀＝10.2μl/mL，ABTS自由基清除实验的IC₅₀＝20.3μL/mL。

实施例2

A、取新鲜的天山雪莲细胞，使用3倍量的纯水洗涤雪莲细胞4次；

B、雪莲细胞冲洗干净后，加入2倍量的纯水，放到-20℃冰箱中冷冻，待雪莲完全冻住后，解冻，反复三次；

C、解冻后的雪莲细胞，依次使用10μm，2μm，0.45μm的滤膜进行过滤，最终全部通过0.45um滤膜，即得到天山雪莲细胞水提取物，分装，-5℃保存。

经测定，提取物中含总黄酮0.06％，绿原酸0.006％，紫丁香苷0.001％，1,5-二咖啡酰奎宁酸0.007％，DPPH自由基清除实验的IC₅₀＝24.2μl/mL，ABTS自由基清除实验的IC₅₀＝38.3μL/mL。

实施例3

A、取新鲜的天山雪莲细胞，使用5倍量的纯水洗涤雪莲细胞2次；

B、雪莲细胞冲洗干净后，加入2倍量的纯水，放到-20℃冰箱中冷冻，待雪莲完全冻住后，解冻，反复三次；

C、解冻后的雪莲细胞，放入超声提取仪器中，超声功率为150W，超声频率40kHz，超声提取30min后，依次使用10μm，2μm，0.45μm的滤膜进行过滤，最终全部通过 0.45um滤膜，即得到天山雪莲细胞水提取物，分装，-5℃保存。

经测定，提取物中含总黄酮0.08％，绿原酸0.005％，紫丁香苷0.0005％，1,5-二咖啡酰奎宁酸0.007％，DPPH自由基清除实验的IC₅₀＝35.2μl/mL，ABTS自由基清除实验的IC₅₀＝50.2μL/mL。

实施例4

A、取新鲜的天山雪莲细胞，使用5倍量的纯水洗涤雪莲细胞2次；

B、雪莲细胞冲洗干净后，加入1倍量的纯水，放到-80℃冰箱中冷冻，待雪莲完全冻住后，解冻，反复三次；

C、解冻后的雪莲细胞，放入微波提取设备进行提取，微波频率范围为2450MHz，提取温度小于40℃，时间10min；

D、提取完成后依次使用10μm，2μm，0.45μm的滤膜进行过滤，最终全部通过 0.45um滤膜，即得到天山雪莲细胞水提取物，分装，-5℃保存。

经测定，提取物中含总黄酮0.18％，绿原酸0.014％，紫丁香苷0.001％，1,5-二咖啡酰奎宁酸0.017％，DPPH自由基清除实验的IC₅₀＝8.2μl/mL，ABTS自由基清除实验的IC₅₀＝12.3μL/mL。

实施例5

A、取新鲜的天山雪莲细胞，使用1倍量的纯水洗涤雪莲细胞4次；

B、雪莲细胞冲洗干净后，加入1倍量的纯水，放到-20℃冰箱中冷冻，待雪莲完全冻住后，解冻，反复三次；

C、解冻后的雪莲细胞，用均质器进行匀浆，匀浆法的转速为10000rpm，匀浆时间为10min/次，反复匀浆5次，匀浆后的雪莲细胞水，依次使用10μm，5μm，1μm， 0.45μm滤膜进行过滤，最终全部通过0.45um滤膜，即得到天山雪莲细胞水提取物，分装，-5℃保存。

经测定，提取物中含总黄酮0.14％，绿原酸0.014％，紫丁香苷0.001％，1,5-二咖啡酰奎宁酸0.016％，DPPH自由基清除实验的IC₅₀＝10.2μl/mL，ABTS自由基清除实验的IC₅₀＝22.3μL/mL。

实施例6

A、取新鲜的天山雪莲细胞，使用1.5倍量的纯水洗涤雪莲细胞4次；

B、雪莲细胞冲洗干净后，加入1倍量的纯水，放到-80℃冰箱中冷冻，待雪莲完全冻住后，解冻，反复三次；

C、解冻后的雪莲细胞，用均质器进行匀浆，匀浆法的转速为15000rpm，匀浆时间为5min/次，反复匀浆2次，匀浆后的雪莲细胞水，依次使用10μm，1μm，0.45μm 滤膜进行过滤，最终全部通过0.45um滤膜，即得到天山雪莲细胞水，分装，-5℃保存。

经测定，提取物中含总黄酮0.23％，绿原酸0.018％，紫丁香苷0.002％，1,5-二咖啡酰奎宁酸0.022％，DPPH自由基清除实验的IC₅₀＝7.6μl/mL，ABTS自由基清除实验的IC₅₀＝14.7μL/mL。

实施例7

A、取新鲜的天山雪莲细胞，使用1倍量的纯水洗涤雪莲细胞5次；

B、雪莲细胞冲洗干净后，加入1倍量的纯水，放到-80℃冰箱中冷冻，待雪莲完全冻住后，解冻，反复5次；

C、解冻后的雪莲细胞，解冻后的雪莲细胞放入微波提取设备进行提取，微波频率范围为2450MHz，提取温度小于40℃，时间10min，

D、提取完成后的雪莲细胞水，依次使用10μm，5μm，1μm，0.45μm滤膜进行过滤，最终全部通过0.45um滤膜，即得到天山雪莲细胞水，分装，-5℃保存。

经测定，提取物中含总黄酮0.25％，绿原酸0.020％，紫丁香苷0.002％，1,5-二咖啡酰奎宁酸0.025％，DPPH自由基清除实验的IC₅₀＝5.3μl/mL，ABTS自由基清除实验的IC₅₀＝11.5μL/mL。

实施例8

A、取新鲜的天山雪莲细胞，使用1倍量的纯水洗涤雪莲细胞5次；

B、雪莲细胞冲洗干净后，加入2倍量的纯水，放到-80℃冰箱中冷冻，待雪莲完全冻住后，解冻，反复2次；

C、解冻后的雪莲细胞，用均质器进行匀浆，匀浆法的转速为18000rpm，匀浆时间为3min/次，反复匀浆4次，匀浆后的雪莲细胞水，依次使用10μm，1μm，0.45μm 的滤膜进行过滤，最终全部通过0.45um滤膜，即得到天山雪莲细胞水，分装，-5℃保存。

经测定，提取物中含总黄酮0.06％，绿原酸0.004％，紫丁香苷0.001％，1,5-二咖啡酰奎宁酸0.005％，DPPH自由基清除实验的IC₅₀＝40.4μl/mL，ABTS自由基清除实验的IC₅₀＝70.6μL/mL。

实施例9

A、取新鲜的天山雪莲细胞，使用3倍量的纯水洗涤雪莲细胞4次；

B、雪莲细胞冲洗干净后，加入2倍量的纯水，放到-20℃冰箱中冷冻，待雪莲完全冻住后，解冻，反复三次；

C、解冻后的雪莲细胞，使用4000r/min速度离心20min，去除沉淀，上清通过0.45um滤膜过滤，即得到天山雪莲细胞水提取物，分装，-5℃保存。

经测定，提取物中含总黄酮0.06％，绿原酸0.006％，紫丁香苷0.001％，1,5-二咖啡酰奎宁酸0.006％，DPPH自由基清除实验的IC₅₀＝26.1μl/mL，ABTS自由基清除实验的IC₅₀＝40.3μL/mL。

实施例10

A、取新鲜的天山雪莲细胞，使用3倍量的纯水洗涤雪莲细胞4次；

B、雪莲细胞冲洗干净后，加入2倍量的纯水，放到-20℃冰箱中冷冻，待雪莲完全冻住后，解冻，反复三次；

C、解冻后的雪莲细胞，使用4000r/min速度离心20min，去沉淀，上清再次使用10000r/min的离心机离心，去沉淀，保留上清，即得到天山雪莲细胞水提取物，分装， -5℃保存。

经测定，提取物中含总黄酮0.06％，绿原酸0.006％，紫丁香苷0.001％，1,5-二咖啡酰奎宁酸0.006％，DPPH自由基清除实验的IC₅₀＝28.1μl/mL，ABTS自由基清除实验的IC₅₀＝42.3μL/mL。

实施例11

A、取新鲜的天山雪莲细胞，使用3倍量的纯水洗涤雪莲细胞5次；

B、雪莲细胞冲洗干净后，加入2倍量的纯水，放到-20℃冰箱中冷冻，待雪莲完全冻住后，解冻，反复三次；

C、解冻后的雪莲细胞，使用4000r/min速度离心20min，去除沉淀，上清再次使用0.2um过滤膜，4000g离心过滤60min，保留滤液，即为到天山雪莲细胞水提取物，分装，-5℃保存。

经测定，提取物中含总黄酮0.07％，绿原酸0.007％，紫丁香苷0.001％，1,5-二咖啡酰奎宁酸0.007％，DPPH自由基清除实验的IC₅₀＝23.3μl/mL，ABTS自由基清除实验的IC₅₀＝34.5μL/mL。

实施例12

A、取新鲜的天山雪莲细胞，使用3倍量的纯水洗涤雪莲细胞5次；

B、雪莲细胞冲洗干净后，加入2倍量的纯水，放到-20℃冰箱中冷冻，待雪莲完全冻住后，解冻，反复三次；

C、解冻后的雪莲细胞，使用4000r/min速度离心20min，去沉淀，上清再次使用0.1um过滤膜，4000g离心60min，去沉淀，保留上清，即得到天山雪莲细胞水提取物，分装，-5℃保存。

经测定，提取物中含总黄酮0.06％，绿原酸0.006％，紫丁香苷0.001％，1,5-二咖啡酰奎宁酸0.006％，DPPH自由基清除实验的IC₅₀＝26.7μl/mL，ABTS自由基清除实验的IC₅₀＝35.3μL/mL。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种提取天山雪莲细胞功能活性物质的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取天山雪莲细胞，使用纯水清洗；

(2)将步骤(1)洗净的天山雪莲细胞中添加纯水，破壁处理，获得提取液；

(3)依次使用孔径不同的滤膜过滤步骤(2)得到的提取液获得滤过液，或者，通过离心的方式获得上清液，分装后保存。

2.如权利要求1所述的提取天山雪莲细胞功能活性物质的方法，其特征在于，步骤(1)中的清洗过程为清洗1次或多次，或者使用流水连续清洗；步骤(1)中的清洗过程中纯水使用量为天山雪莲细胞重量的1～5倍；步骤(2)中破壁处理方法为冷冻融化法、匀浆法或二者的组合；步骤(2)中天山雪莲细胞的重量和水的重量比为1:1～1:10。

3.如权利要求2所述的提取天山雪莲细胞功能活性物质的方法，其特征在于，所述冷冻融化法的温度为-80～-20℃，反复冷冻融化1～10次；所述匀浆法的转速为1000～30000rpm，匀浆时间为0.1～10min/次，反复匀浆1～10次。

4.如权利要求3所述的提取天山雪莲细胞功能活性物质的方法，其特征在于，所述破壁处理后再进行浸泡提取，浸泡温度范围-5～50℃，浸泡时间0.1～10天。

5.如权利要求3所述的提取天山雪莲细胞功能活性物质的方法，其特征在于，破壁处理后再进行超声提取，超声功率为10W～100kW，超声频率20KHz-100KHz,超声时间10～60min/次，反复重复1-10次。

6.如权利要求3所述的提取天山雪莲细胞功能活性物质的方法，其特征在于，破壁处理后再进行微波提取，微波频率范围为300MHz～300GHz，微波处理时间1～30min，微波处理温度0～60℃。

7.如权利要求1-6任一项所述的提取天山雪莲细胞功能活性物质的方法，其特征在于，步骤(3)中，最终使用孔径为0.45um的滤膜过滤；或者，通过高速离心方式去除沉淀，保留上清溶液；或者，采用孔径小于0.45um的过滤离心的方式去除杂质，最终获得澄清的细胞水提取物。

8.天山雪莲细胞功能活性物质，其特征在于，由权利要求1～7任一项所述的方法制得。

9.如权利要求8所述的天山雪莲细胞功能活性物质在制备功能食品和化妆品中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述化妆品为面霜、眼霜、乳液、精华液、护肤水、面膜或洗面乳。