CN103320329B - 一种罗布麻栅锈菌的扩繁方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种罗布麻栅锈菌的扩繁方法，通过离体叶片接种前消毒、离体叶片培养、离体叶片接菌、活体接菌前处理、接种、保湿、初次扩繁、二次扩繁、大量扩繁、制作孢子悬浮液、接种扩繁步骤完成。本发明能够批量提供罗布麻栅锈菌，以满足实验对菌源的需要，进而为罗布麻栅锈菌防治提供理论依据，保证种植罗布麻的高产和可持续性和罗布麻种植产业的健康发展。
Description
技术领域
本发明属于植物病理学范畴，涉及罗布麻重要病害锈病接种和扩繁技术，特别严重是一种罗布麻栅锈菌的扩繁方法。
背景技术
“罗布麻”一词是我国著名的农业经济学家董正钧先生，于50年代在新疆罗布泊发现其纤维的使用价值并命名。他所指的罗布麻是相当于原苏联林奈所创Apocynum属的所有职务的总称。属夹竹桃科，是多年生宿根草本植物，其叶子可以制茶、制药、纤维是高档服装的原料。罗布麻还是荒漠化治理的先锋植物，具有极强的抗逆性，是美化荒漠、防风固沙、涵养水源、改善局域环境最好的生态植物和功效显著的保健植物。在我国有3种，即罗布麻Apocynum venetum L；罗布白麻Poacynum hendersonii(Hook.f)Wodson；罗布紫麻Poacynum pictum(Schrenk)Baill。罗布麻每年生长一季，其根保留为次年萌发新株。同时，罗布麻根系发达，具有耐旱、耐盐碱、繁殖力强等特殊的生态习性，是荒漠化、盐碱化土地防风固沙、改良土壤的优势资源植物。在我国西部荒漠化、盐碱化地区生态治理中具有重要意义。
目前，罗布麻大量生长地区主要有青海达木盆地、甘肃，新疆等地区，上述地区土壤和气候条件严酷，野生罗布麻几近枯竭。近年来，挽救野生罗布麻、大面积人工栽培罗布麻进行荒漠化治理成为一个新的趋势，仅新疆戈宝红麻公司在阿勒泰地区栽培的罗布麻面积达到近5万亩。
罗布麻规模化种植主要病害是罗布麻栅锈菌引起的叶锈病，也称罗布麻锈病，通过研究发现，叶锈病可降低罗布麻产量，亦可影响罗布麻生理生化、医药保健功能及生态功能。
随着罗布麻的大规模种植，罗布麻锈病有大规模、大面积的爆发的趋势，而且发病速度快，扩散范围广，严重威胁罗布麻的生长，已经成为罗布麻种植中的首要病害和主要限制因子，是罗布麻资源保护以及种植生产过程中亟待解决的问题之一。
在近年的实际种植中，特别是在新疆阿勒泰种植区，罗布麻锈病一般在5月初就开始发生，7月中旬达到高峰，发病率高达100%，危害可持续到罗布麻生长季结束，造成叶片脱落、品质降低，茎秆枯死。
罗布麻规模化发展势在必行，但目前对罗布麻病害的研究几乎没有，从其他作物病害的研究发现，病害平均导致作物减产35%以上。
目前国内外关于罗布麻叶锈病（罗布麻栅锈菌）发生的时空规律、病原与寄主互作机理、病害诊断预测及防治、抗病机制等相关研究尚未开展。
探究解决上述科学问题需要野外调查和室内实验相结合，为了保证实验顺利有效开展，需要即时足量的提供菌源，即罗布麻栅锈菌，对罗布麻的种植业的健康发展胡着十分重要的意义。
但罗布麻病原标本多分布在西北内陆人烟稀少地区，交通不方便，采集保存难度大。罗布麻栅锈菌在常温下（20～35℃）存活时间只有7～10天，而且随着时间增加活性显著下降。同时，罗布麻栅锈菌的室内接种和扩繁对温度、湿度、光照强度和周期要求苛刻，接种扩繁难度大。要摸清栅锈病发病和防治，需要在室内和田间相结合，因此室内病原菌接种和扩繁技术亟需解决。
因此，一种能够保证罗布麻栅锈菌高效扩繁，满足实验对菌源的需要的罗布麻栅锈菌的扩繁方法就应运而生。
发明内容
本发明目的在于提供一种适于在室内研究罗布麻锈病生物学、流行学的接种、扩繁方法，以保证罗布麻栅锈菌高效扩繁，满足实验对菌源的需要，进而为罗布麻栅锈菌防治提供理论依据，保证罗布麻种植的高产、可持续性和罗布麻种植产业的健康发展。
本发明的目的是通过以下步骤实现的：
（1）离体叶片接种前消毒：用浓度为70～75%的酒精浸泡滤纸（直径9cm）2分钟后晾干，铺在培养皿中，采摘罗布麻活体叶片，用浓度为0.3～0.5%的次氯酸钠溶液消毒3～5分钟，再用无菌水冲洗3～5次作为离体叶片。
（2）离体叶片培养：将冲洗好的离体叶片平铺在滤纸表面，用滴管向滤纸滴上无菌水，至有水膜产生为止。
（3）离体叶片接种：采集新鲜自然发病的罗布麻锈病病叶，铺在标本纸或卫生纸压紧带回室内，用接种针蘸取少量凡士林，挑取病叶夏孢子堆中的夏孢子，涂抹在离体叶片上，一个叶片涂抹8～12次，然后放在培养皿中并密封皿口，在20～28℃下，光暗交替环境培养6～14天得带孢离体叶片，之后将带孢的离体叶片夹在吸水纸中保存在0～5℃环境中，所述的光暗交替为每10～14小时光暗交替一次。
（4）活体接种前处理：用喷壶均匀的向罗布麻叶片背部喷无菌水，至有水滴产生为止，破坏叶片表面的角质层。
（5）二次接种：将带孢离体叶片与罗布麻健康叶片触擦，一片带孢离体叶片触擦一片健康的叶片；一次接种至少触擦20～50个叶片。
（6）保湿：将二次接种后的罗布麻叶放在保湿玻璃罩内，用保鲜膜封口，保湿48～60小时，期间每10～14小时光暗交替变换一次，光照强度在10000～12000LUX。
（7）初次扩繁：取二次接种成功的病叶，按照步骤（5）所描述接种方法，按一个病叶触擦2～4个健康叶片，继续触擦健康叶片背部，然后在保湿玻璃罩内封口保湿48～60小时。
（8）二次扩繁：用手指蘸无菌水直接搓压初次扩繁叶片上的夏孢子堆，并向初次扩繁叶片和健康叶片各部位涂抹，使孢子均匀分布，继续保湿48～60小时。
（9）菌种收集：将二次扩繁后的罗布麻叶片平放并略微向下倾斜15～20°，然后用手背轻拍病叶或茎干，使孢子抖落在平铺的硫酸纸上，最后将孢子收集入塑料离心管或类似容器中，保存在-18～-22℃环境中。
（10）制作孢子悬浮液：按500 ml无菌水加入0.5～1.5g的新鲜夏孢子的比例，同时加入0.05～0.1ml吐温-20作为展布剂，震荡均匀后得孢子悬浮液。
（11）大量扩繁：取罗布麻健康叶片并轻轻摩擦叶片，破坏叶片角质层，然后用无菌水冲洗叶片，将配置好的孢子悬浮液喷洒在叶片背面至有水滴出现为止，最后将植株放入容器中，封口处保留10～15个昆虫针大小的小洞，容器内温度保持在20～28℃，空气相对湿度在85～95%之间，接种的罗布麻栅锈菌叶片开始大量产生夏孢子，当叶片被孢子对覆盖面积超过50%以上时，扩繁即完成。
本发明能够批量提供罗布麻栅锈菌，以满足实验对菌源的需要，进而为罗布麻栅锈菌防治提供理论依据，保证种植罗布麻的高产和可持续性和罗布麻种植产业的健康发展。
具体实施方式
实施例1：
（1）离体叶片接种前消毒：用浓度为70%的酒精浸泡滤纸（直径9cm）2分钟后晾干，铺在培养皿中，采摘罗布麻活体叶片，用浓度为0.3%的次氯酸钠溶液消毒3分钟，再用无菌水冲洗3次作为离体叶片。
（2）离体叶片培养：将冲洗好的离体叶片平铺在滤纸表面，用滴管向滤纸滴上无菌水，至有水膜产生为止。
（3）离体叶片接种：采集新鲜自然发病的罗布麻锈病病叶，铺在标本纸或卫生纸压紧带回室内，用接种针蘸取少量凡士林，挑取病叶夏孢子堆中的夏孢子，涂抹在离体叶片上，一个叶片涂抹10次，然后在培养皿皿口均匀涂抹一层凡士林，盖好并压紧培养皿盖，在20～28℃，光暗交替环境下培养6～14天得带孢离体叶片，之后将带孢的离体叶片夹在吸水纸中保存在0～5℃环境中，所述的光暗交替为每12小时交替一次，光照强度在10000LUX。
（4）活体接种前处理：用喷壶均匀的向罗布麻叶片背部喷无菌水，至有水滴产生为止，同时用沾有无菌水的手指搓压叶片，或用手指蘸取少量的石英砂搓擦叶片，破坏叶片表面的角质层。
（5）二次接种：将带孢离体叶片与罗布麻健康叶片触擦，一片带孢离体叶片触擦一片健康的叶片；一次接种至少触擦20个叶片。
（6）保湿：将二次接种后的罗布麻叶放在保湿玻璃罩内，用保鲜膜封口，保湿48小时，期间每12小时光暗交替变换一次，光照强度在10000～12000LUX。
接种7～12天开始产孢，10天后产孢量最大，但是接种率较低，病叶率为5%～10%，孢子堆数量较少，一般有1～5个。
（7）初次扩繁：取二次接种成功的病叶，按照步骤（5）所描述接种方法，按一个病叶触擦3个健康叶片，继续触擦健康叶片背部，然后在保湿玻璃罩内封口保湿60小时。一次扩繁后接种率较高，为90%～100%，但是孢子堆数量少。
（8）二次扩繁：待接种10天后，即用手指蘸无菌水直接搓压初次扩繁叶片上的夏孢子堆，并向初次扩繁叶片和健康叶片各部位涂抹，使孢子均匀分布，继续保湿60小时。二次扩繁能够增大产孢量。根据实验要求进行3次扩繁后保持发病20天。
（9）菌种收集：将二次扩繁后的罗布麻叶片平放并略微向下倾斜15°，然后用手背轻拍病叶或茎干，使孢子抖落在平铺的硫酸纸上，最后折叠，并用手指轻弹，让孢子沿折叠槽收集入塑料离心管或类似容器中，保存在-20℃的冰箱中。
（10）制作孢子悬浮液：按500 ml无菌水加入1g的新鲜夏孢子的比例，同时加入0.1ml吐温-20作为展布剂，震荡均匀后得孢子悬浮液。
（11）大量扩繁：取罗布麻健康叶片并用食指蘸取少量石英砂，用拇指和食指轻轻摩擦叶片，破坏叶片角质层，然后在喷壶中装入无菌水，冲洗叶片。在喷壶中装入配置好的孢子悬浮液，往叶片背面喷洒至有水滴出现为止。最后将植株放入圆盘，底盘装入自来水，罩上有机玻璃罩后用保鲜膜封口，再用昆虫针在封口扎若干个小洞。保证罩内温度在25℃，空气相对湿度在90%。接种罗布麻栅锈菌叶片大量产生夏孢子，当叶片被孢子对覆盖面积超过50%以上，扩繁完成。
实施例2：
（1）离体叶片接种前消毒：用浓度为75%的酒精浸泡滤纸（直径9cm）2分钟后晾干，铺在培养皿中，采摘罗布麻活体叶片，用浓度为0.5%的次氯酸钠溶液消毒5分钟，再用无菌水冲洗4次作为离体叶片。
（2）离体叶片培养：将冲洗好的离体叶片平铺在滤纸表面，用滴管向滤纸滴上无菌水，至有水膜产生为止。
（3）离体叶片接种：采集新鲜自然发病的罗布麻锈病病叶，铺在标本纸或卫生纸压紧带回室内，用接种针蘸取少量凡士林，挑取病叶夏孢子堆中的夏孢子，涂抹在离体叶片上，一个叶片涂抹12次，然后在培养皿皿口均匀涂抹一层凡士林，盖好并压紧培养皿盖，在28℃，光暗交替环境下培养10天得带孢离体叶片，之后将带孢的离体叶片夹在吸水纸中保存在0℃环境中，所述的光暗交替为每14小时交替一次，光照强度在12000LUX。
（4）活体接菌前处理：用喷壶均匀的向罗布麻叶片背部喷无菌水，至有水滴产生为止，同时用沾有无菌水的手指搓压叶片，或用手指蘸取少量的石英砂搓擦叶片，破坏叶片表面的角质层。
（5）二次接种：将带孢离体叶片与罗布麻健康叶片触擦，一片带孢离体叶片触擦一片健康的叶片；一次接种至少触擦30个叶片。
（6）保湿：将二次接种后的罗布麻叶放在保湿玻璃罩内，用保鲜膜封口，保湿60小时，期间每10小时光暗交替变换一次，光照强度在10000～12000LUX。
接种7天开始产孢，10天后产孢量最大，但是接种率较低，病叶率为5%～10%，孢子堆数量较少，一般有1～5个。
（7）初次扩繁：取二次接种成功的病叶，按照步骤（5）所描述接种方法，按一个病叶触擦4个健康叶片，继续触擦健康叶片背部，然后在保湿玻璃罩内封口保湿60小时。一次扩繁后接种率较高，为90%～100%，但是孢子堆数量少。
（8）二次扩繁：待接种12天后，即用手指蘸无菌水直接搓压初次扩繁叶片上的夏孢子堆，并向初次扩繁叶片和健康叶片各部位涂抹，使孢子均匀分布，继续保湿50小时。二次扩繁能够增大产孢量。根据实验要求进行3～4次扩繁后保持发病20天。
（9）菌种收集：将二次扩繁后的罗布麻叶片平放并略微向下倾斜20°，然后用手背轻拍病叶或茎干，使孢子抖落在平铺的硫酸纸上，最后折叠，并用手指轻弹，让孢子沿折叠槽收集入塑料离心管或类似容器中，保存在-22℃冰箱中。
（10）制作孢子悬浮液：按500 ml无菌水加入1.5g的新鲜夏孢子的比例，同时加入0.08ml吐温-20作为展布剂，震荡均匀后得孢子悬浮液。
（11）大量扩繁：取罗布麻健康叶片并用食指蘸取少量石英砂，用拇指和食指轻轻摩擦叶片，破坏叶片角质层，然后在喷壶中装入无菌水，冲洗叶片。在喷壶中装入配置好的孢子悬浮液，往叶片背面喷洒至有水滴出现为止。最后将植株放入圆盘，底盘装入自来水，罩上有机玻璃罩后用保鲜膜封口，再用昆虫针在封口扎15个小洞。保证罩内温度在26℃，空气相对湿度在85%。接种罗布麻栅锈菌叶片大量产生夏孢子，叶片被孢子对覆盖面积超过60%以上时，扩繁即完成。
实施例3：
（1）离体叶片接种前消毒：用浓度为72%的酒精浸泡滤纸（直径9cm）2分钟后晾干，铺在培养皿中，采摘罗布麻活体叶片，用浓度为0.4%的次氯酸钠溶液消毒4分钟，再用无菌水冲洗3次作为离体叶片。
（2）离体叶片培养：将冲洗好的离体叶片平铺在滤纸表面，用滴管向滤纸滴上无菌水，至有水膜产生为止。
（3）离体叶片接种：采集新鲜自然发病的罗布麻锈病病叶，铺在标本纸或卫生纸压紧带回室内，用接种针蘸取少量凡士林，挑取病叶夏孢子堆中的夏孢子，涂抹在离体叶片上，一个叶片涂抹8次，然后在培养皿皿口均匀涂抹一层凡士林，盖好并压紧培养皿盖，在25℃，光暗交替环境下培养12天得带孢离体叶片，之后将带孢的离体叶片夹在吸水纸中保存在0～5℃环境中，所述的光暗交替为每12小时交替一次，光照强度在11000LUX。
（4）活体接菌前处理：用喷壶均匀的向罗布麻叶片背部喷无菌水，至有水滴产生为止，同时用沾有无菌水的手指搓压叶片，或用手指蘸取少量的石英砂搓擦叶片，破坏叶片表面的角质层。
（5）二次接种：将带孢离体叶片与罗布麻健康叶片触擦，一片带孢离体叶片触擦一片健康的叶片；一次接种至少触擦40个叶片。
（6）保湿：将二次接种后的罗布麻叶放在保湿玻璃罩内，用保鲜膜封口，保湿50小时，期间每10小时光暗交替变换一次，光照强度在10000～12000LUX。
接种10天后产孢量最大，但是接种率较低，病叶率为5%～10%，孢子堆数量较少，一般有1～5个。
（7）初次扩繁：取二次接种成功的病叶，按照步骤（5）所描述接种方法，按一个病叶触擦3个健康叶片，继续触擦健康叶片背部，然后在保湿玻璃罩内封口保湿48小时。一次扩繁后接种率较高，为90%～100%，但是孢子堆数量少。
（8）二次扩繁：待接种10天后，即用手指蘸无菌水直接搓压初次扩繁叶片上的夏孢子堆，并向初次扩繁叶片和健康叶片各部位涂抹，使孢子均匀分布，继续保湿60小时。二次扩繁能够增大产孢量。根据实验要求进行4次扩繁后保持发病20天。
（9）菌种收集：将二次扩繁后的罗布麻叶片平放并略微向下倾斜15°，然后用手背轻拍病叶或茎干，使孢子抖落在平铺的硫酸纸上，最后折叠，并用手指轻弹，让孢子沿折叠槽收集入塑料离心管或类似容器中，保存在-18℃冰箱中。
（10）制作孢子悬浮液：按500 ml无菌水加入0.8g的新鲜夏孢子的比例，同时加入0.08ml吐温-20作为展布剂，震荡均匀后得孢子悬浮液。
（11）大量扩繁：取罗布麻健康叶片并用食指蘸取少量石英砂，用拇指和食指轻轻摩擦叶片，破坏叶片角质层，然后在喷壶中装入无菌水，冲洗叶片。在喷壶中装入配置好的孢子悬浮液，往叶片背面喷洒至有水滴出现为止。最后将植株放入圆盘，底盘装入自来水，罩上有机玻璃罩后用保鲜膜封口，再用昆虫针在封口扎20个小洞。保证罩内温度在28℃，空气相对湿度在90%之间。接种罗布麻栅锈菌叶片大量产生夏孢子，叶片被孢子对覆盖面积超过50%以上时，扩繁即完成。
实施例3：
（1）离体叶片接种前消毒：用浓度为70%的酒精浸泡滤纸（直径9cm）2分钟后晾干，铺在培养皿中，采摘罗布麻活体叶片，用浓度为0.4%的次氯酸钠溶液消毒5分钟，再用无菌水冲洗4次作为离体叶片。
（2）离体叶片培养：将冲洗好的离体叶片平铺在滤纸表面，用滴管向滤纸滴上无菌水，至有水膜产生为止。
（3）离体叶片接种：采集新鲜自然发病的罗布麻锈病病叶，铺在标本纸或卫生纸压紧带回室内，用接种针蘸取少量凡士林，挑取病叶夏孢子堆中的夏孢子，涂抹在离体叶片上，一个叶片涂抹10次，然后在培养皿皿口均匀涂抹一层凡士林，盖好并压紧培养皿盖，在25℃，光暗交替环境下培养12天得带孢离体叶片，之后将带孢的离体叶片夹在吸水纸中保存在2℃环境中，所述的光暗交替为每14小时交替一次，光照强度在12000LUX。
（4）活体接菌前处理：用喷壶均匀的向罗布麻叶片背部喷无菌水，至有水滴产生为止，同时用沾有无菌水的手指搓压叶片，或用手指蘸取少量的石英砂搓擦叶片，破坏叶片表面的角质层。
（5）二次接种：将带孢离体叶片与罗布麻健康叶片触擦，一片带孢离体叶片触擦一片健康的叶片；一次接种至少触擦50个叶片。
（6）保湿：将二次接种后的罗布麻叶放在保湿玻璃罩内，用保鲜膜封口，保湿48～60小时，期间每12小时光暗交替变换一次，光照强度在12000LUX。
接种10天后产孢量最大，但是接种率较低，病叶率为5%～10%，孢子堆数量较少，一般有1～5个。
（7）初次扩繁：取二次接种成功的病叶，按照步骤（5）所描述接种方法，按一个病叶触擦4个健康叶片，继续触擦健康叶片背部，然后在保湿玻璃罩内封口保湿55小时。一次扩繁后接种率较高，为90%～100%，但是孢子堆数量少。
（8）二次扩繁：待接种10天后，即用手指蘸无菌水直接搓压初次扩繁叶片上的夏孢子堆，并向初次扩繁叶片和健康叶片各部位涂抹，使孢子均匀分布，继续保湿60小时。二次扩繁能够增大产孢量。根据实验要求进行3次扩繁后保持发病18天。
（9）菌种收集：将二次扩繁后的罗布麻叶片平放并略微向下倾斜15°，然后用手背轻拍病叶或茎干，使孢子抖落在平铺的硫酸纸上，最后折叠，并用手指轻弹，让孢子沿折叠槽收集入塑料离心管或类似容器中，保存在-20℃冰箱中。
（10）制作孢子悬浮液：按500 ml无菌水加入0.5g的新鲜夏孢子的比例，同时加入0.1ml吐温-20作为展布剂，震荡均匀后得孢子悬浮液。
（11）大量扩繁：取罗布麻健康叶片并用食指蘸取少量石英砂，用拇指和食指轻轻摩擦叶片，破坏叶片角质层，然后在喷壶中装入无菌水，冲洗叶片。在喷壶中装入配置好的孢子悬浮液，往叶片背面喷洒至有水滴出现为止。最后将植株放入圆盘，底盘装入自来水，罩上有机玻璃罩后用保鲜膜封口，再用昆虫针在封口扎15个小洞。保证罩内温度在27℃，空气相对湿度在95%。接种罗布麻栅锈菌叶片大量产生夏孢子，叶片被孢子对覆盖面积超过50%以上时，扩繁即完成。
实施例4：
（1）离体叶片接种前消毒：用浓度为75%的酒精浸泡滤纸（直径9cm）2分钟后晾干，铺在培养皿中，采摘罗布麻活体叶片，用浓度为0.3%的次氯酸钠溶液消毒5分钟，再用无菌水冲洗5次作为离体叶片。
（2）离体叶片培养：将冲洗好的离体叶片平铺在滤纸表面，用滴管向滤纸滴上无菌水，至有水膜产生为止。
（3）离体叶片接种：采集新鲜自然发病的罗布麻锈病病叶，铺在标本纸或卫生纸压紧带回室内，用接种针蘸取少量凡士林，挑取病叶夏孢子堆中的夏孢子，涂抹在离体叶片上，一个叶片涂抹10次，然后在培养皿皿口均匀涂抹一层凡士林，盖好并压紧培养皿盖，在28℃下，光暗交替环境下培养12天得带孢离体叶片，之后将带孢的离体叶片夹在吸水纸中保存在3℃环境中，所述的光暗交替为每12小时交替一次，光照强度在12000LUX。
（4）活体接菌前处理：用喷壶均匀的向罗布麻叶片背部喷无菌水，至有水滴产生为止，同时用沾有无菌水的手指搓压叶片，或用手指蘸取少量的石英砂搓擦叶片，破坏叶片表面的角质层。
（5）二次接种：将带孢离体叶片与罗布麻健康叶片触擦，一片带孢离体叶片触擦一片健康的叶片；一次接种至少触擦50个叶片。
（6）保湿：将二次接种后的罗布麻叶放在保湿玻璃罩内，用保鲜膜封口，保湿50小时，期间每10小时光暗交替变换一次，光照强度在12000LUX。
接种10天后产孢量最大，但是接种率较低，病叶率为5%～10%，孢子堆数量较少，一般有1～5个。
（7）初次扩繁：取二次接种成功的病叶，按照步骤（5）所描述接种方法，按一个病叶触擦3个健康叶片，继续触擦健康叶片背部，然后在保湿玻璃罩内封口保湿48小时。一次扩繁后接种率较高，为90%～100%，但是孢子堆数量少。
（8）二次扩繁：待接种10天后，即用手指蘸无菌水直接搓压初次扩繁叶片上的夏孢子堆，并向初次扩繁叶片和健康叶片各部位涂抹，使孢子均匀分布，继续保湿60小时。二次扩繁能够增大产孢量。根据实验要求进行3次扩繁后保持发病18天。
（9）菌种收集：将二次扩繁后的罗布麻叶片平放并略微向下倾斜16°，然后用手背轻拍病叶或茎干，使孢子抖落在平铺的硫酸纸上，最后折叠，并用手指轻弹，让孢子沿折叠槽收集入塑料离心管或类似容器中，保存在-22℃冰箱中。
（10）制作孢子悬浮液：按500 ml无菌水加入0.8g的新鲜夏孢子的比例，同时加入0.1ml吐温-20作为展布剂，震荡均匀后得孢子悬浮液。
（11）大量扩繁：取罗布麻健康叶片并用食指蘸取少量石英砂，用拇指和食指轻轻摩擦叶片，破坏叶片角质层，然后在喷壶中装入无菌水，冲洗叶片。在喷壶中装入配置好的孢子悬浮液，往叶片背面喷洒至有水滴出现为止。最后将植株放入圆盘，底盘装入自来水，罩上有机玻璃罩后用保鲜膜封口，再用昆虫针在封口扎12个小洞。保证罩内温度在26℃，空气相对湿度在85%之间。接种罗布麻栅锈菌叶片大量产生夏孢子，叶片被孢子对覆盖面积超过50%以上时，扩繁即完成。
实施例5：
（1）离体叶片接种前消毒：用浓度为72%的酒精浸泡滤纸（直径9cm）2分钟后晾干，铺在培养皿中，采摘罗布麻活体叶片，用浓度为0.5%的次氯酸钠溶液消毒4分钟，再用无菌水冲洗4次作为离体叶片。
（2）离体叶片培养：将冲洗好的离体叶片平铺在滤纸表面，用滴管向滤纸滴上无菌水，至有水膜产生为止。
（3）离体叶片接种：采集新鲜自然发病的罗布麻锈病病叶，铺在标本纸或卫生纸压紧带回室内，用接种针蘸取少量凡士林，挑取病叶夏孢子堆中的夏孢子，涂抹在离体叶片上，一个叶片涂抹8次，然后在培养皿皿口均匀涂抹一层凡士林，盖好并压紧培养皿盖，在26℃，光暗交替环境下培养14天得带孢离体叶片，之后将带孢的离体叶片夹在吸水纸中保存在3℃环境中，所述的光暗交替为每14小时交替一次，光照强度在11000LUX。
（4）活体接菌前处理：用喷壶均匀的向罗布麻叶片背部喷无菌水，至有水滴产生为止，同时用沾有无菌水的手指搓压叶片，或用手指蘸取少量的石英砂搓擦叶片，破坏叶片表面的角质层。
（5）二次接种：将带孢离体叶片与罗布麻健康叶片触擦，一片带孢离体叶片触擦一片健康的叶片；一次接种至少触擦20～50个叶片。
（6）保湿：将二次接种后的罗布麻叶放在保湿玻璃罩内，用保鲜膜封口，保湿60小时，期间每12小时光暗交替变换一次，光照强度在10000LUX。
接种10天后产孢量最大，但是接种率较低，病叶率为5%～10%，孢子堆数量较少，一般有1～5个。
（7）初次扩繁：取二次接种成功的病叶，按照步骤（5）所描述接种方法，按一个病叶触擦2个健康叶片，继续触擦健康叶片背部，然后在保湿玻璃罩内封口保湿60小时。一次扩繁后接种率较高，为90%～100%，但是孢子堆数量少。
（8）二次扩繁：待接种10天后，即用手指蘸无菌水直接搓压初次扩繁叶片上的夏孢子堆，并向初次扩繁叶片和健康叶片各部位涂抹，使孢子均匀分布，继续保湿60小时。二次扩繁能够增大产孢量。根据实验要求进行3次扩繁后保持发病16天。
（9）菌种收集：将二次扩繁后的罗布麻叶片平放并略微向下倾斜15°，然后用手背轻拍病叶或茎干，使孢子抖落在平铺的硫酸纸上，最后折叠，并用手指轻弹，让孢子沿折叠槽收集入塑料离心管或类似容器中，保存在-21℃冰箱中。
（10）制作孢子悬浮液：按500 ml无菌水加入0.8g的新鲜夏孢子的比例，同时加入0.08ml吐温-20作为展布剂，震荡均匀后得孢子悬浮液。
（11）大量扩繁：取罗布麻健康叶片并用食指蘸取少量石英砂，用拇指和食指轻轻摩擦叶片，破坏叶片角质层，然后在喷壶中装入无菌水，冲洗叶片。在喷壶中装入配置好的孢子悬浮液，往叶片背面喷洒至有水滴出现为止。最后将植株放入圆盘，底盘装入自来水，罩上有机玻璃罩后用保鲜膜封口，再用昆虫针在封口扎20个小洞。保证罩内温度在25℃，空气相对湿度在90%之间。接种罗布麻栅锈菌叶片大量产生夏孢子，叶片被孢子对覆盖面积超过50%以上，扩繁完成。
实施例6：
（1）离体叶片接种前消毒：用浓度为75%的酒精浸泡滤纸（直径9cm）2分钟后晾干，铺在培养皿中，采摘罗布麻活体叶片，用浓度为0.5%的次氯酸钠溶液消毒3分钟，再用无菌水冲洗3次作为离体叶片。
（2）离体叶片培养：将冲洗好的离体叶片平铺在滤纸表面，用滴管向滤纸滴上无菌水，至有水膜产生为止。
（3）离体叶片接种：采集新鲜自然发病的罗布麻锈病病叶，铺在标本纸或卫生纸压紧带回室内，用接种针蘸取少量凡士林，挑取病叶夏孢子堆中的夏孢子，涂抹在离体叶片上，一个叶片涂抹12次，然后在培养皿皿口均匀涂抹一层凡士林，盖好并压紧培养皿盖，在25℃，光暗交替环境下培养12天得带孢离体叶片，之后将带孢的离体叶片夹在吸水纸中保存在4℃环境中，所述的光暗交替为每12小时交替一次，光照强度在12000LUX。
（4）活体接菌前处理：用喷壶均匀的向罗布麻叶片背部喷无菌水，至有水滴产生为止，同时用沾有无菌水的手指搓压叶片，或用手指蘸取少量的石英砂搓擦叶片，破坏叶片表面的角质层。
（5）二次接种：将带孢离体叶片与罗布麻健康叶片触擦，一片带孢离体叶片触擦一片健康的叶片；一次接种至少触擦30个叶片。
（6）保湿：将二次接种后的罗布麻叶放在保湿玻璃罩内，用保鲜膜封口，保湿56小时，期间每12小时光暗交替变换一次，光照强度在10000～12000LUX。
接种10天后产孢量最大，但是接种率较低，病叶率为5%～10%，孢子堆数量较少，一般有1～5个。
（7）初次扩繁：取二次接种成功的病叶，按照步骤（5）所描述接种方法，按一个病叶触擦3个健康叶片，继续触擦健康叶片背部，然后在保湿玻璃罩内封口保湿60小时。一次扩繁后接种率较高，为90%～100%，但是孢子堆数量少。
（8）二次扩繁：待接种10天后，即用手指蘸无菌水直接搓压初次扩繁叶片上的夏孢子堆，并向初次扩繁叶片和健康叶片各部位涂抹，使孢子均匀分布，继续保湿50小时。二次扩繁能够增大产孢量。根据实验要求进行4次扩繁后保持发病15天。
（9）菌种收集：将二次扩繁后的罗布麻叶片平放并略微向下倾斜15°，然后用手背轻拍病叶或茎干，使孢子抖落在平铺的硫酸纸上，最后折叠，并用手指轻弹，让孢子沿折叠槽收集入塑料离心管或类似容器中，保存在-18℃冰箱中。
（10）制作孢子悬浮液：按500 ml无菌水加入1g的新鲜夏孢子的比例，同时加入0.1ml吐温-20作为展布剂，震荡均匀后得孢子悬浮液。
（11）大量扩繁：取罗布麻健康叶片并用食指蘸取少量石英砂，用拇指和食指轻轻摩擦叶片，破坏叶片角质层，然后在喷壶中装入无菌水，冲洗叶片。在喷壶中装入配置好的孢子悬浮液，往叶片背面喷洒至有水滴出现为止。最后将植株放入圆盘，底盘装入自来水，罩上有机玻璃罩后用保鲜膜封口，再用昆虫针在封口扎15个小洞。保证罩内温度在25℃，空气相对湿度在90%之间。接种罗布麻栅锈菌叶片大量产生夏孢子，叶片被孢子对覆盖面积超过50%以上时，扩繁即完成。
Claims (1)
1.一种罗布麻栅锈菌的扩繁方法，其特征在于通过以下技术步骤实现的：
离体叶片接种前消毒：用浓度为70～75%的酒精浸泡滤纸2分钟后晾干，铺在培养皿中，采摘罗布麻活体叶片，用浓度为0.3～0.5%的次氯酸钠溶液消毒3～5分钟，再用无菌水冲洗3～5次作为离体叶片；
离体叶片培养：将冲洗好的离体叶片平铺在滤纸表面，用滴管向滤纸滴上无菌水，至有水膜产生为止；
离体叶片接种：采集新鲜自然发病的罗布麻锈病病叶，铺在标本纸或卫生纸压紧带回室内，用接种针蘸取少量凡士林，挑取病叶夏孢子堆中的夏孢子，涂抹在离体叶片上，一个叶片涂抹8～12次，然后放在培养皿中并密封皿口，在20～28℃下，光暗交替环境培养6～14天得带孢离体叶片，之后将带孢离体叶片夹在吸水纸中保存在0～5℃环境中，所述的光暗交替为每10～14小时光暗交替一次；
活体接种前处理：用喷壶均匀的向罗布麻健康叶片背部喷无菌水，至有水滴产生为止，破坏叶片表面的角质层；
二次接种：将带孢离体叶片与罗布麻健康叶片触擦，一片带孢离体叶片触擦一片罗布麻健康叶片；一次接种至少触擦20～50个叶片；
保湿：将二次接种后的罗布麻健康叶片放在保湿玻璃罩内，用保鲜膜封口，保湿48～60小时，期间每10～14小时光暗交替变换一次，光照强度在10000～12000LUX；
初次扩繁：取二次接种成功的病叶，按照二次接种步骤所描述接种方法，按一个病叶触擦2～4个健康叶片，继续触擦健康叶片背部，然后在保湿玻璃罩内封口保湿48～60小时；
二次扩繁：用手指蘸无菌水直接搓压初次扩繁叶片上的夏孢子堆，并向初次扩繁叶片和健康叶片各部位涂抹，使孢子均匀分布，继续保湿48～60小时得二次扩繁叶片；
菌种收集：将二次扩繁后的罗布麻叶片平放并略微向下倾斜15～20°，然后用手背轻拍叶片，使孢子抖落在平铺的硫酸纸上，最后将孢子收集入塑料离心管或类似容器中，保存在-18～-22℃环境中；
制作孢子悬浮液：按500 ml无菌水加入0.5～1.5g的新鲜夏孢子的比例，同时加入0.05～0.1ml吐温-20作为展布剂，震荡均匀后得孢子悬浮液；
大量扩繁：取罗布麻健康叶片并轻轻摩擦叶片，破坏叶片角质层，然后用无菌水冲洗叶片，将配置好的孢子悬浮液喷洒在叶片背面至有水滴出现为止，最后将叶片放入容器中，封口处保留10～15个昆虫针大小的小洞，容器内温度保持在20～28℃，空气相对湿度在85～95%之间，接种的罗布麻栅锈菌叶片开始大量产生夏孢子，当叶片被孢子堆覆盖面积超过50%以上时，扩繁完成。
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