CN116396869A - 一株羊肚菌的驯化菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株羊肚菌的驯化菌株及其应用，涉及生物技术领域。该驯化菌株为羊肚菌(Morchellasp.)WY1；该驯化菌株于2023年3月10日，保藏在广东省微生物菌种保藏中心；保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏编号为：GDMCCNo：63253。本发明以来自灵璧县的湖光村的野生羊肚菌为亲本，进行了扩繁制种，栽培出菇，连续多年田间选育驯化得到了一株优良菌株，命名为WY1。菌株WY1，相对于原始菌株的产量得到有效提升，并且在不同的地区栽培，产量稳定。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一株羊肚菌的驯化菌株及其应用。
背景技术
羊肚菌(Morchella esculenta(L.)Pers.)是羊肚菌科、羊肚菌属真菌，菌盖近球形、卵形至椭圆形，高可达10厘米，顶端钝圆，表面有似羊肚状的凹坑。凹坑不定蛋壳色至淡黄褐色，棱纹色较浅，柄近圆柱形，近白色，中空，圆筒形，孢子长椭圆形，无色，侧丝顶端膨大，体轻，质酥脆。
明代李时珍著《本草纲目》中记述有羊肚菌子实体入药，羊肚菌性平，味甘寒，无毒，益肠胃，助消化，化痰理气，补肾，补脑，提神等功效。现代医学研究表明，羊肚菌有“四抗”，“两降”，“一调节”的药用功效。即有抗射线、抗肿瘤、抗氧化、抗疲劳作用，降血压、降血脂功能，和调节免疫力的功效，此外，还发现有多种矿物质和微量元素，如：锌、硒、VB1、VB2等。
羊肚菌作为一种名贵、高端的食用菌，含有19种氨基酸，其中有8种人体必须氨基酸，羊肚菌多糖和蛋白质含量分别高达20％以上。因此备受不同文化民族欢迎。又由于羊肚菌含有特殊的风味氨基酸，使得羊肚菌美味可口，是世界高端美味佳肴的一种不可或缺的重要食材，在美食界被誉为‘厨房珍宝’，深受世界各国消费者青睐。
因此，中外各国的科学家和食用菌专家对羊肚菌的人工栽培投入了大量的时间和精力进行探索和研究，欧美各国自1883年至今近140年的时间里虽有过室外和室内栽培成功的案例，但重复性差，不能大规模栽培。我国研究羊肚菌人工栽培是从上世纪80年代开始，直到1994年四川绵阳食用菌研究所朱斗锡宣布室外人工栽培羊肚菌成功并获得国家专利，但产量的稳定性差，2000年四川林科院科研人员在栽培中采用外营养添加技术在花钵中长出了一枚完整的子实体，这是羊肚菌人工栽培一个划时代的转折点，后经不断验证和完善到今天形成了较成熟的栽培技术。
目前生产中使用的羊肚菌品种多而杂，菌种退化现象严重，多数品种不能适应当地气候，因此选育适合人工大面积栽培、品质好、产量高且稳定的羊肚菌新品种有着十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一株羊肚菌的驯化菌株及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的驯化菌株产量高，并且在不同的地区栽培，产量稳定。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一株羊肚菌的驯化菌株，所述驯化菌株为羊肚菌(Morchella sp.)WY1；所述驯化菌株于2023年3月10日，保藏在广东省微生物菌种保藏中心；保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏编号为：GDMCC No：63253。
本发明还提供上述的驯化菌株在制备食品或保健品中的应用。
本发明还提供一种食品，包括上述的驯化菌株或其提取物。
本发明还提供一种保健品，包括上述的驯化菌株或其提取物。
本发明还提供一株上述的驯化菌株在羊肚菌农业种植中的应用。
进一步地，按重量份计，所述驯化菌株的栽培培养基包括：小麦65份、麦麸5份、麦秆15份、稻壳10份、生石灰1份、石膏1份和净土3份。
本发明公开了以下技术效果：
本发明以来自灵璧县的湖光村的野生羊肚菌为亲本，进行了分离、纯化、扩繁制种，栽培出菇，连续多年田间选育驯化得到了一株优良菌株，命名为WY1。菌株WY1，相对于原始菌株的产量得到有效提升，并且在不同的地区栽培，产量稳定。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为“皖羊肚菌1号”亲本的野外图片；
图2为“皖羊肚菌1号”亲本的组织分离平板实验过程图；
图3为“皖羊肚菌1号”亲本的纯化平板图
图4为“皖羊肚菌1号”亲本的试管母种；
图5为“皖羊肚菌1号”亲本的试种出菇图；
图6为“皖羊肚菌1号”菌丝显微图(放大40倍)；
图7为“皖羊肚菌1号”母种(A)和平板(B)纯化图；
图8为“皖羊肚菌1号”原种；
图9为羊肚菌沟播图；
图10为放置营养袋的图；
图11为泾县桃花潭村“皖羊肚菌1号”亲本异地出菇情况图；
图12为岳西县品种比较试验出菇情况；
图13为宣城市泾县桃花潭区域试验出菇情况；
图14为灵璧县湖光村生产试验出菇情况。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例中，羊肚菌产量均为鲜菇重量，鲜菇含水率为85％。
实施例1菌株选育与保藏
1.菌株选育
1.1选育时间：2013年-2020年。
1.2选育方法：对采自灵璧县的野生羊肚菌进行人工驯化。
1.3亲本及其来源
亲本是来自灵璧县湖光村的野生羊肚菌。亲本于2013年春采集(见图1)。
1.4选育过程
1.4.1纯菌株的获得
1.4.1.1培养基配方
马铃薯葡萄糖培养基(PDA)：马铃薯去皮200g，葡萄糖20g，KH2PO42.0g，MgSO40.5g，VB120mg，琼脂15g，水1000mL，pH值自然。
1.4.1.2制培养皿平板和斜面试管
将马铃薯切成丁加1000mL水，煮沸20min，停止加热，待凉到40℃左右，用4层纱布过滤马铃薯汁到2000mL烧杯中，按配方称量试剂加入烧杯中，搅匀，补水到1000mL。将混合液分别倒入500mL三角瓶，每瓶150mL，用分量器将混合液注入每支试管10mL，将注入混合液的三角瓶和试管以及用报纸卷好的平板同时置于121℃，0.15Mpa条件下高压灭菌20min。待冷却到50-60℃时，取出三角瓶、平板于超净工作台内。放入之前，超净工作台开紫光灯30min消毒灭菌，关掉时放入。穿好工作服，手用75％酒精消毒，在工作台内趁热将三角瓶的培养基倒入平板培养皿(9.0×1.8cm)10mL左右，用手水平晃动一下，让培养基分布均匀，冷却备用。趁热在无菌室内放试管斜面，冷却后备用。
1.4.1.3组织分离
将采集来的成熟饱满的野生羊肚菌带回实验室阴干后，进行组织分离培养。采集时连菌脚完整采取，用小纸袋逐个包装。在实验室进行组织分离前，无菌间和超净工作台紫光灯灭菌30min，穿好工作服，进入实验室，手用75％酒精消毒，工具在酒精灯上过火消毒。将采集来的野生阴干羊肚菌带土的菌脚剪去，然后在工作台内用75％酒精棉球擦拭菌柄和菌盖，用剪刀剪开羊肚菌，用手术刀轻切菌柄和菌盖交汇处组织。将切下的组织放于平板的中央(见图2)。
1.4.1.4获得纯菌株
将从每个点经组织培养获得的菌丝，取菌丝萌发旺盛、无污染的菌丝尖部5mm置于平板纯化，(见图3)将纯化的粗壮、旺盛的菌丝尖部切取5mm置于斜面试管中，贴于试管培养基中部的正对面。在20℃的恒温培养箱中培养，7d后菌丝长满试管，获得纯菌株。(见图5)
1.5出菇试验
将获得的亲本菌株制成原种和栽培种，2013年11月10日做栽培出菇试验，试验地点，岳西县温泉镇斯桥村，面积120m2，2014年春出菇(见图5)，产鲜菇38.4kg。
1.6确定目标菌株
根据2014年的出菇试验结果，把来自灵璧县的野生羊肚菌菌株为目标菌株，并命名为“皖羊肚菌1号”。“皖羊肚菌1号”试管菌株在显微镜下观察呈现网状结构，有分叉且有明显的菌核形成(见图6)。2015年春在灵璧继续采集野生羊肚菌制试管母种，低温保存到下半年制栽培种。
1.6.1异地试种
“皖羊肚菌1号”亲本是从灵璧县湖光村采集的，虽然在大别山岳西县栽培出菇，为验证适应性，继续异地栽培，试验点选在皖南泾县桃花潭村。2015年11月15日栽培4个棚，1亩田。
1.6.1.1制原种
a.拌料灭菌：原种培养基配方：以质量分数计，小麦65％，麦麸5％，麦秆15％，稻壳10％，生石灰1％，石膏1％，净土3％。拌料后的含水量55％左右。将麦秆粉碎成1-2cm长，与干净的稻壳、麦麸加1％的生石灰拌匀，加水55％拌匀，用塑料膜盖严，堆酵24h后，翻堆再堆酵48h备用。堆酵的同时，将小麦用1％的生石灰水浸泡，充分膨胀后与堆酵料均匀混合，含水量55％，及时装袋灭菌。常压灭菌在排尽冷空气后保持48h。灭菌结束待堆包冷至30℃时，将料袋运至接种室，
b.接种、发菌制原种：接种前将接种室和接种箱充分灭菌，在接种箱内将“皖羊肚菌1号”试管母种(见图7)接于灭菌袋中，一支试管接5瓶原种。将接好菌种的瓶置于发菌室内发菌，发菌室避光、通风，温度20℃，湿度40。27d左右菌丝满袋(见图8)。
1.6.1.2制栽培种
栽培种的配方，灭菌与制原种配方、灭菌相同，接种时，夹取10g左右的原种接于袋中，接种后置于发菌间养菌，发菌室避光、通风，温度20℃，湿度40。26d左右菌丝满瓶。
1.6.1.3整地、搭棚、播种
2015年10月21日，在收割完的2亩稻田里，选择晴天，用旋耕机将稻田旋两遍，每亩均匀撒生石灰80斤，再旋一遍，在无雨时搭好棚架，盖好塑料膜，利用阳光暴晒土壤杀菌，将6米宽的大棚起3条沟，沟宽35cm，沟深15cm，形成4块地。由于稻田形状不规整，搭了4个棚，棚内实际面积858平。11月15日，地温18℃(地温降到20℃以下适宜栽培)，盖好遮阳网(遮阳率80％)，事先将栽培种在消过毒的桶内轻揉散开。每块地开4条3cm深左右的浅沟，将菌种撒在沟内(见图9)，盖上土，播种量175-200kg/667m2。播完后洒水至土壤湿透，3d菌丝长出地面。地面干燥及时补水。
1.6.1.4放置营养袋
营养袋的配方与原种的配方基本相同，只是生石灰变为2％，净土变为2％，制法一样，6丝聚乙烯营养袋大小：15*34cm，在11月27日，菌丝满地，在营养袋上顺袋划3条口子，划扣间隔1cm，划口正对地面菌丝(见图10)。每亩均匀放置1800个营养袋。11月28日将打好孔的黑色地膜盖上，用土在地两边隔1m左右轻压。
1.6.1.5催菇、出菇、采摘
2016年1月19日营养袋营养基本耗尽。同时地面菌霜开始消失，2月10日地面菌霜完全消失。2月11日，地沟灌水催菇，地沟灌水至地面，土壤充分吸水饱和，然后退水。2月23日有大量原基出现，3月1日出现幼菇，3月15日羊肚菌子实体成熟(见图11)。用专用小刀在羊肚菌基部割取放于箩筐中。4个大棚鲜菇产量208kg，异地试种达到了理想的效果。
1.7品种比较试验
2017年11月12日将“皖羊肚菌1号”与引进的品种进行比较试验，引进的品种分别是四川绵阳食用菌研究所“六妹09”和四川农科院“川羊肚菌1号”，本地品种CK。试验地点：岳西县温泉镇斯桥村，每个品种三个重复(图12)，每个重复100m2。
表1“皖羊肚菌1号”品种比较试验性状调查表
注：注：++++表示菌丝生长旺盛；+++表示菌丝生长较旺盛；++表示菌丝生长一般。
表2“皖羊肚菌1号”品种比较试验产量统计表
注：产量均为鲜菇重量，鲜菇含水率为85％；产量增幅为皖羊肚菌1号相对于其他品种的产量增幅。
由表1试验结果表明，“皖羊肚菌1号”菌株菌丝浓密，生长速度快，成熟的子实体深褐色，菌柄中等，菌盖粗且高。与对照及其它参试菌株差异显著。表2的产量平均提高10.5％。2018年3月“皖羊肚菌1号”出鲜菇换算成亩产232.8kg/667m2。
1.8区域试验
2018年11月9日，以四川引进品种六妹09为对照(CK)，对选育出的优良菌种“皖羊肚菌1号”开展了多点区域试验，每个点三个重复，种植1亩。结果表明，“皖羊肚菌1号”菌丝生长速度快，菌丝浓密，生育期均提前，菌盖高而粗壮(见表3)，平均亩产232kg/667m2(见图13)，比对照平均增产10.9％。具有良好的丰产性和稳定性(见表4)。
表3“皖羊肚菌1号”区域试验结果性状调查表
注：++++表示菌丝生长旺盛
表4“皖羊肚菌1号”区域试验结果产量统计表
注：产量均为鲜菇重量，鲜菇含水率为85％。
1.9生产试验
2019年11月15日在试验品种适宜栽培地区布点开展生产试验(见图14)，每个点种植3亩大棚，三个重复，结果见表5-6。栽培管理水平略高于当地生产水平，营养袋增至2000袋/667m2。
表5“皖羊肚菌1号”生产试验性状调查表
注：++++表示菌丝生长旺盛
表6“皖羊肚菌1号”生产试验产量统计表
注：产量均为鲜菇重量，鲜菇含水率为85％。
由表5可知“皖羊肚菌1号”菌丝浓密，生长速度快，菌盖高而粗，生长期均提前，菌柄短而中粗。2020年春采摘鲜菇，表6生产试验结果可知，“皖羊肚菌1号”生产试验增产点比率100％，换算成亩产，平均237.3kg/667m2，比对照平均增产10.1％，符合新品种鉴定要求。
2.选育总结
2.1品种评述
“皖羊肚菌1号”是安徽本土野生羊肚菌分离、驯化出来的菌株，其菌丝浓密，生长速度快，成熟的子实体菌盖深褐色、圆锥形，表面有不规则棱和囊，中空。菌柄白色，底端略粗，中空。子实体单生、粗壮，产量高且稳定。生育期112d左右。
2.2新品种与亲本特征特性的比较，见表7。
表7参试品种试验结果与亲本特征特性比较表
注：生物学效率(％)＝鲜菇总产量/栽培培养基干重×100％。
3.适宜区域及栽培技术要点
3.1适宜区域
“皖羊肚菌1号”适应性强，子实体耐温性5-22℃，适宜温度8-16℃。在安徽境内均可设施大棚栽培。
3.2栽培技术要点
3.2.1备料：将麦秆晒干打碎，去掉霉烂麦秆。按以下质量分数配方拌料：小麦65％，麦麸5％，麦秆15％，稻壳10％，石灰1％，石膏1％，净土3％。在与小麦混拌前，辅料加水起堆发酵。将粉碎的麦秆与干净的稻壳、麦麸、1％的生石灰加水拌匀起堆，含水率55％。用塑料膜盖严，堆酵24h后，翻堆再堆酵48h备用。堆酵的同时，将小麦用1％的生石灰水浸泡，充分膨胀后与堆酵料均匀混合。拌料后的含水量55％左右。
3.2.2装瓶、灭菌：将上述拌料装于750mL玻璃瓶中，框装层架常压灭菌，起火要猛。常压蒸汽灭菌时升温要快，最好在2-4小时内使堆包内的温度达到100℃，然后保持36小时，冷却备用。
3.2.3制原种：接种前将接种室和接种箱充分灭菌，接种人员穿消毒服，手和接种工具用75％酒精消毒，然后工具过酒精灯火焰消毒。在接种箱内将“皖羊肚菌1号”试管母种接于灭菌瓶中，一支试管接5瓶原种。将接好种的瓶子置于发菌室内发菌，发菌室避光、通风，温度20℃，湿度40。27d左右菌丝满瓶。
3.2.4制栽培种：栽培种的配方，拌料与原种配方、拌料相同，栽培种用聚乙烯塑料袋，带盖套环扣紧，塑料袋规格大小没有固定标准。常压码堆灭菌，起火要猛。常压蒸汽灭菌时升温要快，最好在2-4小时内使堆包内的温度达到100℃，然后保持40小时左右，再利用余热闷闭8小时以上。
将冷却的灭菌料袋运至接种间前将接种场地打扫干净，生石灰消毒，接种人员穿消毒服，手和接种工具用75％酒精消毒，然后工具过酒精灯火焰消毒。在接种箱内打开已灭菌料袋的盖子，将原种用长把铁勺取15g左右从袋口接入，扣好盖子。将接好菌种的袋子运到发菌场所发菌。发菌场所要求地面生石灰消毒，通风、避光。菌袋用框装层架摆放发菌，室内温度20℃，空气相对湿度40，注意通风、避光。常检查，发现污染的菌袋及时捡出处理。大约30天左右菌丝长满菌袋。
3.2.5整地、搭棚：在10月中下旬将地块旋耕好，每亩均匀撒生石灰80-120斤，再用旋耕机旋匀，阳光暴晒7-10d。用6米宽的棚架搭好大棚，盖上塑料膜，两边安上卷轴。再盖上85％遮阳率的遮阳网。棚内整成4块地。3条沟，沟深15cm，沟宽40cm。大棚长度不宜超过40米。
3.2.6播种：准备好盆或桶，用75％酒精内壁消毒，无毒纸巾擦干，将栽培种去袋于桶(盆)内轻柔，麦粒散开。同时在每块地上均匀开4条3cm左右深的沟，将麦粒菌种均匀撒在沟内，覆盖上土，整个大棚播完种后，洒上定菌水，土壤潮湿即可。大棚内安装两个温、湿度计，离地面30cm，一个放棚中间，一个放距离棚门口5m处。
3.2.7制营养袋：营养袋主料配方与栽培种配方相同，只是生石灰变成2％即可。灭菌后备用。
3.2.8大棚管理：播种后不急于盖地膜，棚内温度每天日中在20度左右时，不能盖地膜，每天卷上两边膜和开门通风，每天观察地面湿度情况，适时补水。3天后菌丝长出地面，10-15天地面覆盖菌霜，此时放置营养袋，将营养袋顺袋方向划三道口，三道口须接触地面菌丝，每亩均匀放置1800个营养袋。当平均气温下降到10℃以下时，确保土壤湿润时盖上黑色地膜，地膜上均匀打洞，利于透气。营养袋放置30d左右时浇一次大水，待地面菌霜消失，气温回升时揭开地膜，注意地面变化，看到大量原基形成时，浇水催菇，喷灌或在沟里灌满水漫过厢面，然后退去水，静等出菇。出菇期间，每天开棚通风，保持棚内湿度80-95。
3.2.9病虫害防治：按照“预防为主，综合防治”的方针，坚持“农业防治，物理防治，生物防治为主，化学防治为辅”的治理原则，对羊肚菌病、虫、杂菌采取综合防治措施，确保羊肚菌品质安全优质。物理防治：地面出现绿霉、白霉等杂菌时人工去掉或撒上生石灰。菇蚊等可在夜间用灯光下放盆，盆里放糖水或羊肚菌浸出液，滴几滴敌敌畏。在大棚周围撒一圈生石灰。
3.2.10采收、储藏：待羊肚菌长到8成熟(即菌囊张开，菌顶未转焦黑之前)及时采收，采收时菌脚不能带泥，按大小分级。天晴时可阳光晒干，天阴时要及时烘干。干羊肚菌分级用食品袋装好，放在阴凉干燥处待售。采第一潮菇后，在厢面洒一次水，刺激第二潮出菇。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (6)
1.一株羊肚菌的驯化菌株，其特征在于，所述驯化菌株为羊肚菌(Morchellasp.)WY1；所述驯化菌株于2023年3月10日，保藏在广东省微生物菌种保藏中心；保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏编号为：GDMCCNo：63253。
2.一株如权利要求1所述的驯化菌株在制备食品或保健品中的应用。
3.一种食品，其特征在于，包括如权利要求1所述的驯化菌株或其提取物。
4.一种保健品，其特征在于，包括如权利要求1所述的驯化菌株或其提取物。
5.一株如权利要求1所述的驯化菌株在羊肚菌农业种植中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，按重量份计，所述驯化菌株的栽培培养基包括：小麦65份、麦麸5份、麦秆15份、稻壳10份、生石灰1份、石膏1份和净土3份。
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