CN114214276A - 一种现货型人脐带源间充质干细胞及其制备方法与应用 - Google Patents

一种现货型人脐带源间充质干细胞及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种现货型人脐带源间充质干细胞及其制备方法与应用。所述制备方法包括如下步骤：培养离体的脐带组织块，得到P0代细胞；将P0代细胞传代两次，得到P2代细胞并将其冻存；将冻存的P2代细胞复苏，传代两次，得到P4代细胞并将其冻存；将冻存的P4代细胞复苏，传代一次，得到P5代细胞并将其依次经过消化、洗涤和重悬后，得到所述人脐带源间充质干细胞。本发明还采取冷冻保存的方式，开发得到人脐带源间充质干细胞冻存制剂，该冻存制剂便于储存，复苏后可直接进行静脉给药，无需换液，避免了配药时可能造成的污染风险，更利于临床使用。且冻存制剂保质期长，货架期内可完成针对制剂功能和安全的多项检测。

Description

一种现货型人脐带源间充质干细胞及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种现货型人脐带源间充质干细胞及其制备方法与应用。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal stem cell，MSC)是一群来源于中胚层的多能成体干细胞，具有自我更新多向分化、促进组织器官修复和免疫调控等潜能。MSC可从骨髓、脐带、胎盘、脂肪、骨骼、牙髓和子宫内膜等多个组织中分离培养，MSC样细胞也可由胚胎干细胞或多能干细胞分化而来。MSC具有低免疫原性，因不表达CD40、CD80、CD86等共刺激分子和主要组织相容性复合体Ⅱ类分子，所以引起免疫排斥反应的可能性较小。同时因其对免疫细胞的调节效应不受主要组织相容性复合体分子的限制，对自体和异体的免疫细胞都可发挥免疫调节效应。MSC还具有炎症趋化特性，通过感知炎性信号(细胞因子、趋化因子受体和整合素等)而迁移至炎症部位，依赖细胞间直接接触和(或)旁分泌效应而发挥作用，如MSC可通过细胞间直接接触或分泌细胞因子的方式对异常激活的T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞等的增殖、分化和抗体产生等发挥调控效应，多项临床研究证明MSC输注后会显著降低患者体内促炎细胞因子，IFN-γ、IL-2、IL-12和IL-17A的分泌，MSC促进分泌的IL-10和TGF-β可以抑制异常活化的Th1细胞，恢复Th1/Th2平衡，抑制T细胞过度增殖，并通过NKG2D通路抑制细胞毒性CD8+T淋巴细胞的活性。MSC还能以LPS依赖性方式通过其自身分泌的IL-10和TGF-β细胞因子的协同作用将巨噬细胞从促炎M1表型重新极化为抗炎M2表型。研究证实经MSC治疗后患者的白细胞计数和中性粒细胞计数降至正常水平，CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞的计数也增加至正常水平。
现有的传统技术，通常选用含有胎牛血清的培养基对干细胞进行培养，同时冻存液常选用90％胎牛血清+10％DMSO的配方，复苏培养后重悬于添加人血清白蛋白的生理盐水中用于注射，无法长期保存。同时细胞产量与生物学活性的维持都存在一定的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种人脐带源间充质干细胞及其冻存制剂的制备方法与应用。
为了实现上述目的，本发明首先提供了一种人脐带源间充质干细胞的制备方法。
本发明提供的人脐带源间充质干细胞的制备方法包括如下步骤：
(1)培养离体的脐带组织块，待从所述脐带组织块爬出的间充质干细胞的细胞融合度为40％-60％时，得到P0代间充质干细胞；
(2)完成步骤(1)后，将所述P0代间充质干细胞进行传代培养，培养至细胞融合度为60％-80％时，得到P1代间充质干细胞；
(3)完成步骤(2)后，将所述P1代间充质干细胞进行传代培养，培养至细胞融合度为60％-80％时，得到P2代间充质干细胞；
(4)完成步骤(3)后，将所述P2代间充质干细胞进行细胞冻存，得到冻存的P2代种子库细胞；
(5)完成步骤(4)后，将所述冻存的P2代种子库细胞复苏并进行传代培养，培养至细胞融合度为60％-80％时，得到P3代间充质干细胞；
(6)完成步骤(5)后，将所述P3代间充质干细胞进行传代培养，培养至细胞融合度为60％-80％时，得到P4代间充质干细胞；
(7)完成步骤(6)后，将所述P4代间充质干细胞进行细胞冻存，得到冻存的P4代工作库细胞；
(8)完成步骤(7)后，将所述冻存的P4代工作库细胞复苏并进行传代培养，培养至细胞融合度为60％-80％时，得到P5代间充质干细胞；
(9)完成步骤(8)后，将所述P5代间充质干细胞依次经过消化、洗涤和重悬后，得到所述人脐带源间充质干细胞。
上述人脐带源间充质干细胞的制备方法中，所述步骤(1)前还包括如下步骤：取离体的脐带进行消毒，得到消毒后脐带；然后将所述消毒后脐带清洗后剪成1-2cm小段，得到脐带小段；再将脐带小段清洗后剪成1-2mm3组织块。
所述步骤(1)中，采用胎牛血清完全培养基培养离体的脐带组织块。所述培养的方法具体可包括如下步骤：向含有脐带组织块的细胞培养瓶中加入胎牛血清完全培养基，倒置于5％CO2、37℃条件下培养；培养4小时后将细胞培养瓶正置于5％CO2、饱和湿度、37℃条件下继续培养；培养24小时后向细胞培养瓶中补加胎牛血清完全培养基，置于5％CO2、饱和湿度、37℃条件下继续培养；脐带组织块贴块培养7天后，吸弃培养液，向细胞培养瓶中加入胎牛血清完全培养基，置于5％CO2、饱和湿度、37℃条件下继续培养。
所述步骤(2)中，采用胎牛血清完全培养基进行传代培养。所述传代培养(P0至P1)的方法具体可包括如下步骤：吸弃全部培养基，向细胞培养瓶中加入氯化钠注射液(0.9％)洗涤一次，然后加入TrypLE进行消化，待细胞完全悬浮后再加入氯化钠注射液(0.9％)终止消化，并将细胞悬液移至离心管中；用氯化钠注射液(0.9％)清洗各细胞培养瓶，将清洗得到的细胞悬液一并移入离心管中；将离心管离心(300g离心8分钟)，吸弃上清，用平衡至室温的胎牛血清完全培养基重悬细胞，混匀后取细胞悬液用于计数，计算收获的P0代细胞总数；按照18,000-20,000个细胞/cm2的密度接种于细胞培养瓶中，每瓶补加胎牛血清完全培养基至标准体积，做好标记后置于5％CO2、饱和湿度、37℃条件下继续培养。
所述步骤(3)中，采用胎牛血清完全培养基进行传代培养。所述传代培养(P1至P2)的方法具体可包括如下步骤：吸弃全部培养基，向细胞培养瓶中加入氯化钠注射液(0.9％)洗涤一次，然后加入TrypLE进行消化，待细胞完全悬浮后再加入氯化钠注射液(0.9％)终止消化，并将细胞悬液移至离心管中；用氯化钠注射液(0.9％)清洗各细胞培养瓶，将清洗得到的细胞悬液一并移入离心管中；将离心管离心(300g离心8分钟)，吸弃上清，用平衡至室温的胎牛血清完全培养基重悬细胞，混匀后取细胞悬液用于计数，计算收获的P1代细胞总数；按照18,000-20,000个细胞/cm2的密度接种于细胞培养瓶中，每瓶补加胎牛血清完全培养基至标准体积，做好标记后置于5％CO2、饱和湿度、37℃条件下继续培养。
所述步骤(4)中，所述细胞冻存的方法具体可包括如下步骤：吸弃全部培养液，向细胞培养瓶中加入氯化钠注射液(0.9％)洗涤一次，然后加入TrypLE进行消化，待细胞完全悬浮后再加入氯化钠注射液(0.9％)终止消化，并将细胞悬液移至离心管中；用氯化钠注射液(0.9％)清洗各培养瓶，将清洗得到的细胞悬液一并移入离心管中；将离心管离心(300g离心8分钟)，吸弃上清，用冻存液甲重悬细胞，混匀后取细胞悬液进行计数，计算收获的P2代细胞总数；根据计数结果补加所需体积的冻存液甲制成细胞悬液，使细胞浓度为3E6个细胞/mL，并将细胞悬液加入冻存管中，放入4℃预冷的梯度降温盒中，置于-80℃低温冰箱，冷冻，1个月内转入液氮存储罐。进一步的，所述冻存液甲由胎牛血清和二甲基亚砜组成。更进一步的，所述胎牛血清和所述二甲基亚砜的体积比为9:1。
所述步骤(5)中，所述复苏的方法具体可包括如下步骤：将装有P2代种子库细胞的冻存管放入37℃水浴锅中，1-3分钟开始随机抽查融化情况，直到冻存的细胞完全融化；然后将冻存管中细胞悬液移至装有无血清完全培养基的离心管中，混匀后离心(300g离心5分钟)，吸弃上清，用平衡至室温的无血清完全培养基重悬细胞。采用无血清完全培养基进行传代培养。所述传代培养(P2至P3)的方法具体可包括如下步骤：按照8,000-9,000个细胞/cm2的密度接种于细胞培养瓶中，每瓶补加无血清完全培养基至标准体积，做好标记后置于5％CO2、饱和湿度、37℃条件下继续培养。
所述步骤(6)中，采用无血清完全培养基进行传代培养。所述传代培养(P3至P4)的方法具体可包括如下步骤：吸弃全部培养基，向细胞培养瓶中加入氯化钠注射液(0.9％)洗涤一次，然后加入TrypLE进行消化，待细胞完全悬浮后再加入氯化钠注射液(0.9％)终止消化，并将细胞悬液移至离心管中；用氯化钠注射液(0.9％)清洗各细胞培养瓶，将清洗得到的细胞悬液一并移入离心管中；将离心管离心(300g离心8分钟)，吸弃上清，用平衡至室温的无血清完全培养基重悬细胞，混匀后取细胞悬液用于计数，计算收获的P3代细胞总数；按照6,000-8,000个细胞/cm2的密度接种于细胞培养瓶中，每瓶补加无血清完全培养基至标准体积，做好标记后置于5％CO2、饱和湿度、37℃条件下继续培养。
所述步骤(7)中，所述细胞冻存的方法具体可包括如下步骤：吸弃全部培养液，向细胞培养瓶中加入氯化钠注射液(0.9％)洗涤一次，然后加入TrypLE进行消化，待细胞完全悬浮后再加入氯化钠注射液(0.9％)终止消化，并将细胞悬液移至离心管中；用氯化钠注射液(0.9％)清洗各培养瓶，将清洗得到的细胞悬液一并移入离心管中；将离心管离心(300g离心8分钟)，吸弃上清，用冻存液乙重悬细胞，使细胞密度为8E6个细胞/mL；再将细胞悬液加入冻存管中，放入4℃预冷的梯度降温盒中，置于-80℃低温冰箱，冷冻，1个月内转入液氮存储罐。进一步的，所述冻存液乙由无血清培养基基础、二甲基亚砜和人血白蛋白溶液(0.2g/mL)组成。更进一步的，所述无血清培养基基础、所述二甲基亚砜和所述人血白蛋白溶液(0.2g/mL)的体积比为7:2:1。
所述步骤(8)中，所述复苏的方法具体可包括如下步骤：将装有P4代工作库细胞的冻存管放入37℃水浴锅中，1-3分钟开始随机抽查融化情况，直到冻存的细胞完全融化；然后将冻存管中细胞悬液移至装有无血清完全培养基的离心管中，混匀后离心(300g离心5分钟)，吸弃上清，用平衡至室温的无血清完全培养基重悬细胞。采用无血清完全培养基进行传代培养。所述传代培养(P4至P5)的方法具体可包括如下步骤：按8,000-11,000个细胞/cm2的密度接种于细胞培养瓶中，每瓶补加无血清完全培养基至标准体积，做好标记后置于5％CO2、饱和湿度、37℃条件下继续培养。
所述步骤(9)具体可包括如下步骤：吸弃全部培养液，向细胞培养瓶中加入氯化钠注射液(0.9％)洗涤一次，然后加入TrypLE进行消化，待细胞完全悬浮后再加入氯化钠注射液(0.9％)终止消化，并将细胞悬液移至离心管中；用氯化钠注射液(0.9％)清洗各培养瓶，将清洗得到的细胞悬液一并移入离心管中；将离心管离心(300g离心8分钟)，吸弃上清，用含0.1％人血白蛋白的氯化钠注射液(0.9％)洗涤细胞，离心(300g离心8分钟)；重复离心洗涤步骤；至第三次洗涤时，用含0.1％人血白蛋白的氯化钠注射液(0.9％)重悬细胞，得到人脐带源间充质干细胞原液，该原液中含有所述人脐带源间充质干细胞。
上述方法中，所述胎牛血清完全培养基由DMEM/F12基础培养基和胎牛血清组成，所述DMEM/F12基础培养基和所述胎牛血清的体积比为9:1。
所述无血清完全培养基由间充质干细胞无血清培养基基础和间充质干细胞无血清培养基添加剂组成。所述间充质干细胞无血清培养基基础和所述间充质干细胞无血清培养基添加剂的体积比为100:1。
为了实现上述目的，本发明又提供了按照上述方法制备得到的人脐带源间充质干细胞。
为了实现上述目的，本发明还提供了上述人脐带源间充质干细胞在制备人脐带源间充质干细胞冻存制剂中的应用。
为了实现上述目的，本发明还提供了一种人脐带源间充质干细胞冻存制剂。
本发明提供的人脐带源间充质干细胞冻存制剂包括上述人脐带源间充质干细胞和细胞冷冻保护剂。
进一步的，所述细胞冷冻保护剂由复方电解质溶液、二甲基亚砜、右旋糖酐40氯化钠注射液和人血白蛋白溶液(0.2g/mL)组成。
所述人脐带源间充质干细胞在所述冻存制剂中的浓度可为2.5×106-1×107个细胞/mL，具体可为2.5×106个细胞/mL、5×106个细胞/mL、1×107个细胞/mL。
更进一步的，所述复方电解质溶液、所述二甲基亚砜、所述右旋糖酐40氯化钠注射液和所述人血白蛋白溶液(0.2g/mL)的体积比可为(70-80)：(5-10)：(5-10)：(5-10)或70：(5-10)：(5-10)：(5-10)或80：(5-10)：(5-10)：(5-10)或(70-80)：5：(5-10)：(5-10)或(70-80)：10：(5-10)：(5-10)或(70-80)：(5-10)：5：(5-10)或(70-80)：(5-10)：10：(5-10)或(70-80)：(5-10)：(5-10)：5或(70-80)：(5-10)：(5-10)：10。
在本发明的具体实施例中，所述复方电解质溶液、所述二甲基亚砜、所述右旋糖酐40氯化钠注射液和所述人血白蛋白溶液(0.2g/mL)的体积比为80：5：10：5或70：10：10：10或80：5：5：10或80：10：5：5。
为了实现上述目的，本发明还提供了上述人脐带源间充质干细胞冻存制剂的制备方法。
本发明提供的人脐带源间充质干细胞冻存制剂的制备方法包括如下步骤：用细胞冷冻保护剂重悬上述人脐带源间充质干细胞，然后将获得的细胞悬液进行降温处理，得到所述人脐带源间充质干细胞冻存制剂。
进一步的，所述降温处理的程序具体如下：
步骤1：起始温度至4℃；
步骤2：1℃/min降至-5℃；
步骤3：20℃/min直到腔体温度-40℃；
步骤4：10℃/min直到腔体温度-20℃；
步骤5：2℃/min直到样品降至-40℃；
步骤6：10℃/min直到样品降至-80℃；
步骤7：结束。
为了实现上述目的，本发明还提供了上述人脐带源间充质干细胞或上述人脐带源间充质干细胞冻存制剂或按照上述方法制备得到的人脐带源间充质干细胞冻存制剂的新用途。
本发明提供了上述人脐带源间充质干细胞或上述人脐带源间充质干细胞冻存制剂或按照上述方法制备得到的人脐带源间充质干细胞冻存制剂在如下N1)-N10)任一种中的应用：
N1)制备预防和/或治疗新型冠状病毒所致疾病的产品；
N2)制备预防和/或治疗特发性肺间质纤维化的产品；
N3)制备预防和/或治疗急性肺损伤的产品；
N4)制备预防和/或治疗肝纤维化的产品；
N5)制备预防和/或治疗克罗恩病的产品；
N6)预防和/或治疗新型冠状病毒所致疾病；
N7)预防和/或治疗特发性肺间质纤维化；
N8)预防和/或治疗急性肺损伤；
N9)预防和/或治疗肝纤维化；
N10)预防和/或治疗克罗恩病。
为了实现上述目的，本发明还提供了一种产品，所述产品的活性成分为上述人脐带源间充质干细胞或上述人脐带源间充质干细胞冻存制剂或按照上述方法制备得到的人脐带源间充质干细胞冻存制剂；所述产品的功能为如下M1)-M5)中任一种：
M1)预防和/或治疗新型冠状病毒所致疾病；
M2)预防和/或治疗特发性肺间质纤维化；
M3)预防和/或治疗急性肺损伤；
M4)预防和/或治疗肝纤维化；
M5)预防和/或治疗克罗恩病。
为了实现上述目的，本发明最后提供了一种治疗新型冠状病毒所致疾病或特发性肺间质纤维化或急性肺损伤或肝纤维化或克罗恩病的方法。
本发明提供的治疗新型冠状病毒所致疾病或特发性肺间质纤维化或急性肺损伤或肝纤维化或克罗恩病的方法包括如下步骤：向新型冠状病毒所致疾病患者或特发性肺间质纤维化患者或急性肺损伤患者或肝纤维化患者或克罗恩病患者施用上述人脐带源间充质干细胞或上述人脐带源间充质干细胞冻存制剂或按照上述方法制备得到的人脐带源间充质干细胞冻存制剂，使所述患者得到治疗。
上述任一所述应用或产品中，所述产品可为药物。
上述任一所述应用或产品方法中，所述新型冠状病毒为SARS-CoV-2。
所述新型冠状病毒所致疾病包括新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。
与现有技术相比，本发明间充质干细胞制备过程中工作库和制剂制备阶段，采用无血清培养基细胞培养工艺，避免了动物源性原材料可能带来的外源病毒污染问题，同时无血清培养基中的成分和含量相对明确，避免了血清批间差异对产品质量造成的影响，进一步提高了干细胞制剂的安全性和稳定性。另外，为了保证临床使用上的及时性、可获得性、安全性、有效性，本发明采取冷冻保存的方式，将制剂开发成预先制备成“即用型(off-the-shelf)”产品的冻存制剂形式。与新鲜制剂相比，冻存制剂更便于储存，并且复苏后可直接进行静脉给药，无需换液，避免了配药时可能造成的污染风险，更利于临床使用。且冻存制剂保质期长，货架期内可完成针对制剂功能和安全的多项检测，安全性风险更低，可有效提高临床获益。
附图说明
图1为人脐带源间充质干细胞形态图。
图2为人脐带源间充质干细胞分化染色图。自上而下分别为成骨诱导分化21天后，茜素红-S染色为阳性；成脂诱导分化14天后，油红-O染色为阳性；成软骨组织诱导分化21天后，石蜡切片后阿尔新蓝染色为阳性。
图3为细胞复苏后活率。
图4为人脐带源间充质干细胞IDO基因mRNA表达水平图。
图5为人脐带源间充质干细胞CCL2基因mRNA表达水平图。
图6为人脐带源间充质干细胞CXCL10基因mRNA表达水平图。
图7为供试品对BLM致肺纤维化模型大鼠肺组织病理变化的影响。注：HE染色，100×。a.正常对照组，肺脏右上叶显微镜下未见明显病变；b.模型对照组，肺脏右上叶可见肺泡炎细胞浸润(明显)、间质/肺泡纤维化(明显)；c.C1低剂量组，肺脏右上叶可见肺泡炎细胞浸润(中度)、间质/肺泡纤维化(中度)；d.C1中剂量组，肺脏右上叶可见肺泡炎细胞浸润(轻度)、间质/肺泡纤维化(中度)；e.C1高剂量组，肺脏右上叶显微镜可见肺泡炎细胞浸润(轻度)、间质/肺泡纤维化(轻度)。
图8为供试品对ALI模型大鼠肺组织病理的影响。注：HE染色，40×。a.正常对照组，右肺未见明显异常改变。b.模型对照组，右肺间质/肺泡炎细胞浸润和支气管相关淋巴组织增生。c.C1低剂量组，右肺间质/肺泡炎细胞浸润和支气管相关淋巴组织增生。d.C1中剂量组，右肺间质/肺泡炎细胞浸润和支气管相关淋巴组织增生。e.C1高剂量组，右肺间质/肺泡炎细胞浸润和支气管相关淋巴组织增生。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
胎牛血清完全培养基配方：10％胎牛血清(Biological Industries(BI)，货号：04-001-1ACS)+90％DMEM/F12基础培养基(Biological Industries(BI)，货号：04-172-1ACS)。
无血清完全培养基配方：每500mL间充质干细胞无血清培养基基础(友康生物，货号：NC0103)中加入5mL间充质干细胞无血清培养基添加剂(友康生物，货号：NC0103.S)。
成软骨诱导分化完全培养基：Biological Industries(BI)，货号：05-220-1B。
成骨诱导培养基：Biological Industries(BI)，货号05-440-1B。
成脂诱导培养基：Biological Industries(BI)，货号05-330-1B。
TrypLE：Thermo Fisher(GIBCO)，货号：12563-029。
Mouse IgG1-FITC：BD生物科学，货号：555748。
CD19-FITC：BD生物科学，货号：555412。
CD34-FITC：BD生物科学，货号：555821。
Mouse IgG1-PE：BD生物科学，货号：554680。
CD11b-PE：BD生物科学，货号555388。
CD73-PE：BD生物科学，货号：550257。
CD90-PE：BD生物科学，货号：555596。
CD45-PE：BD生物科学，货号：555483。
CD105-PE：BD生物科学，货号：560839。
HLA-DR-PE：BD生物科学，货号：555812。
复方电解质注射液：上海百特医疗用品有限公司，货号：国药准字H20000475。
二甲基亚砜(DMSO)：湖南九典制药有限公司，货号：湘食药辅准字F20090010。
右旋糖酐40氯化钠注射液：石家庄四药有限公司，货号：国药准字H13022493。
人血白蛋白溶液(0.2g/mL)：瑞士杰特贝林生物制品有限公司。
IFN-γ：近岸生物，货号：C014。
0.9％氯化钠注射液：石家庄四药有限公司，货号：国药准字H13023201。
实施例1、人脐带源间充质干细胞的制备及鉴定
(一)人脐带源间充质干细胞的制备
一、人脐带源间充质干细胞分离
1、取足月、无先天性疾病的新生儿的离体脐带(新生儿产妇无肝炎、梅毒、艾滋病等传染性疾病，产妇及家属对脐带用于试验研究均知情同意将离体的脐带)放入装有50mL75％乙醇的烧杯中，消毒10s。然后用30mL 0.9％氯化钠注射液(石家庄四药有限公司，国药准字H13023201)冲洗三次。
2、完成步骤1后，在肾形盘中加入50mL 0.9％氯化钠注射液，然后将脐带放入肾形盘中去除表面血污，再用手术剪将脐带剪成1-2cm小段，进一步排血，弃去废液。
3、完成步骤2后，将脐带小段放入盛有30mL 0.9％氯化钠注射液的烧杯中，反复冲洗三次，然后在洁净条件下，将清洗后的脐带小段置于干燥的玻璃烧杯中，用手术剪将脐带剪成约1-2mm3小块，并均匀接种于T75细胞培养瓶中。
4、完成步骤3后，向T75细胞培养瓶中加入4mL胎牛血清完全培养基，倒置于5％CO2，37℃培养箱内。4小时后，将培养瓶正置于5％CO2，饱和湿度，37℃培养箱继续培养。24小时后，每个T75培养瓶中补加11mL胎牛血清完全培养基，置于5％CO2，饱和湿度，37℃培养箱继续培养。脐带组织块贴块培养7天后，吸弃培养液，每个T75培养瓶中加入15mL胎牛血清完全培养基，置于5％CO2，饱和湿度，37℃培养箱继续培养。培养期间，间充质干细胞从脐带组织块中爬出。
二、种子库建立(P0-P2)
1、当脐带组织块贴块培养后9-13天，整瓶细胞融合度达到40％-60％时，得到P0代间充质干细胞，然后进行P0-P1的传代培养，具体方法如下：吸弃全部培养基，每个T75培养瓶中加入5mL 0.9％氯化钠注射液洗涤一次，然后加入2.5mL TrypLE，消化2分钟左右，待细胞完全悬浮后再加入5mL 0.9％氯化钠注射液终止消化，并将细胞悬液移至离心管中。用5mL0.9％氯化钠注射液清洗各培养瓶，将清洗得到的细胞悬液一并移入离心管中。将离心管300g离心8分钟，离心后吸弃上清，用平衡至室温的胎牛血清完全培养基重悬细胞，混匀后取细胞悬液用于计数，计算收获的P0代细胞总数。按照18,000-20,000个细胞/cm2的密度接种于培养瓶中。每瓶补加胎牛血清完全培养基至标准体积(T75：15mL；T175：35mL)，做好标记后置于5％CO2，饱和湿度，37℃培养箱继续培养。
2、完成步骤1后，当接种后48-72小时，整瓶细胞融合度达到60％-80％时，得到P1代间充质干细胞，然后进行P1-P2的传代培养。具体方法如下：吸弃全部培养液，每瓶加入0.9％氯化钠注射液(T75：5mL；T175：10mL)洗涤一次，然后加入TrypLE(T75：2.5mL；T175：5mL)消化2分钟左右，待细胞完全悬浮后再加入0.9％氯化钠注射液(T75：5mL；T175：10mL)终止消化，并将细胞悬液移至250mL离心管中。用0.9％氯化钠注射液(T75：5mL；T175：10mL)清洗各培养瓶，将清洗得到的细胞悬液一并移入离心管中。将离心管300g离心8分钟，离心后吸弃上清，用平衡至室温的胎牛血清完全培养基重悬细胞，混匀后取细胞悬液用于计数，计算收获的P1代细胞总数。按照18,000-20,000个细胞/cm2的密度接种于培养瓶中，每瓶补加胎牛血清完全培养基至标准体积(T175：35mL；T525：105mL)，做好标记后置于5％CO2，饱和湿度，37℃培养箱继续培养。
3、完成步骤2后，当接种后48-72小时，整瓶细胞融合度达到60％-80％时，得到P2代间充质干细胞，然后进行P2代种子库细胞的冻存。具体方法如下：吸弃全部培养液，每瓶加入0.9％氯化钠注射液(T175：10mL；T525：30mL)洗涤一次，然后加入TrypLE(T175：5mL；T525：15mL)消化2分钟左右，待细胞完全悬浮后再加入0.9％氯化钠注射液(T175：10mL；T525：30mL)终止消化，并将细胞悬液移至250mL离心管中。用0.9％氯化钠注射液(T175：10mL；T525：30mL)清洗各培养瓶，将清洗得到的细胞悬液一并移入离心管中。将离心管300g离心8分钟。离心后吸弃上清，用冻存液(胎牛血清：DMSO＝9:1(体积比))重悬细胞，混匀后取细胞悬液进行计数，计算收获的P2代细胞总数。根据计数结果补加所需体积的冻存液制成细胞悬液，调整细胞浓度为3E6个细胞/mL左右，将细胞悬液加入冻存管中，1.5mL/管。放入4℃预冷的梯度降温盒中，置于-80℃低温冰箱，冷冻。1个月内转入液氮存储罐。
三、工作库建立(P2-P4)
1、取冷冻保存的P2代细胞进行复苏。具体方法如下：将装有P2代细胞的冻存管放入37℃水浴锅中，1-3分钟开始随机抽查融化情况，直到冻存的细胞完全融化。
2、完成步骤1后，将冻存管中细胞悬液移至装有无血清完全培养基的离心管中，混匀后300g离心5分钟，离心结束后吸弃上清，用平衡至室温的无血清完全培养基重悬细胞。
3、完成步骤2后，进行P2-P3的传代培养。具体方法如下：按照8,000-9,000个细胞/cm2的密度接种于培养瓶中，每瓶补加无血清完全培养基至标准体积(T175：35mL；T525：105mL)，做好标记后置于5％CO2，饱和湿度，37℃培养箱继续培养。
4、完成步骤3后，当接种后48-72小时，细胞融合度达到60％-80％时，得到P3代间充质干细胞，然后进行P3-P4的传代培养。具体方法如下：吸弃全部培养液，每瓶加入0.9％氯化钠注射液(T175：10mL；T525：30mL)洗涤一次，然后加入TrypLE(T175：5mL；T525：15mL)消化2分钟左右，待细胞完全悬浮后再加入0.9％氯化钠注射液(T175：10mL；T525：30mL)终止消化，并将细胞悬液移至250mL离心管中。用0.9％氯化钠注射液(T175：10mL；T525：30mL)清洗各培养瓶，将清洗得到的细胞悬液一并移入离心管中。将离心管300g离心8分钟，离心后吸弃上清，用平衡至室温的无血清完全培养基重悬细胞，混匀后取细胞悬液用于计数，计算收获的P3代细胞总数。按照6,000-8,000个细胞/cm2的密度接种于培养瓶中，每瓶补加无血清完全培养基至标准体积(T525：105mL；T875：175mL)，做好标记后置于5％CO2，饱和湿度，37℃培养箱继续培养。
5、完成步骤4后，当接种后48-72小时，细胞融合度达到60％-80％时，得到P4代间充质干细胞，然后进行P4代工作库细胞的冻存。具体方法如下：吸弃全部培养液，每瓶加入0.9％氯化钠注射液(T175：10mL；T525：30mL)洗涤一次，然后加入TrypLE(T175：5mL；T525：15mL)消化2分钟左右，待细胞完全悬浮后再加入0.9％氯化钠注射液(T175：10mL；T525：30mL)终止消化，并将细胞悬液移至250mL离心管中。用0.9％氯化钠注射液(T175：10mL；T525：30mL)清洗各培养瓶，将清洗得到的细胞悬液一并移入离心管中。将离心管300g离心8分钟，离心后吸弃上清，用冻存液(无血清培养基基础：DMSO：人血白蛋白溶液(0.2g/mL)＝7:2:1(体积比))重悬细胞，混匀后取细胞悬液用于计数，计算收获的P4代细胞总数。根据计数结果补加所需体积的冻存液制成细胞悬液，调整细胞浓度为8E6个细胞/mL，将细胞悬液加入冻存管中，1.5mL/管。放入4℃预冷的梯度降温盒中，置于-80℃低温冰箱，冷冻。1个月内转入液氮存储罐。
四、细胞原液制备(P4-P5)
1、取冷冻保存的P4代细胞进行复苏，具体方法如下：将装有P4代细胞的冻存管放入37℃水浴锅中，1-3分钟开始随机抽查融化情况，直到冻存的细胞完全融化。
2、完成步骤1后，将冻存管中细胞悬液移至装有无血清完全培养基的离心管中，混匀后300g离心5分钟，离心结束后吸弃上清，用平衡至室温的无血清完全培养基重悬细胞。
3、完成步骤2后，进行P4-P5的传代培养。具体方法如下：按8,000-11,000个细胞/cm2的密度接种于培养瓶中，每瓶补加无血清完全培养基至标准体积(T525：105mL)，做好标记后置于5％CO2，饱和湿度，37℃培养箱继续培养。
4、完成步骤3后，当接种后48-72小时，细胞融合度达到60％-80％时(细胞形态如图1所示)，得到P5代间充质干细胞，然后进行原液的制备。具体方法如下：吸弃所有培养瓶中的培养液。每个培养瓶中加入0.9％氯化钠注射液(T525：30mL)洗涤一次，然后加入TrypLE(T525：15mL)消化2分钟左右，待细胞完全悬浮后再加入0.9％氯化钠注射液(T525：30mL)终止消化，并将细胞悬液移至250mL离心管中。用0.9％氯化钠注射液(T525：30mL)清洗各培养瓶，将清洗得到的细胞悬液一并移入离心管中，300g离心8分钟。离心后吸弃上清，用含0.1％人血白蛋白的0.9％氯化钠注射液洗涤细胞，300g离心8分钟。重复离心洗涤步骤。至第三次洗涤时，用含0.1％人血白蛋白的0.9％氯化钠注射液重悬细胞，即得到人脐带源间充质干细胞原液。
按照上述方法，分别以3个不同来源的脐带(编号分别为Y200001、Y200003、Y210001)为原料，分别制备得到干细胞原液。编号Y200001和Y200003的脐带来源于湖北省人民医院，编号为Y210001的脐带来源于华中科技大学同济医学院附属同济医院。
(二)原液中人脐带源间充质干细胞鉴定
一、原液中人脐带源间充质干细胞分化鉴定
1、以3个不同脐带来源(编号分别为Y200001、Y200003、Y210001)的干细胞原液为例，在15mL离心管中加入1mL浓度为1-2E6/mL的细胞，300g离心5min。然后加入1mL成软骨诱导分化完全培养基重悬细胞，室温下200g离心5min，将其放置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每隔3天更换成软骨诱导分化完全培养基。持续诱导21天后，对软骨球进行4％多聚甲醛固定和石蜡包埋切片，最后进行阿尔新蓝染色。
2、完成步骤1后，将细胞以8000个细胞/mL密度接种于孔板中，37℃、5％CO2培养箱培养，分成如下两组进行处理：
成骨诱导组：当细胞融合率达到80％时，吸弃培养基，添加成骨诱导培养基，每3天换一次新鲜成骨诱导培养基，培养21天，用茜素红-S染色。
成脂诱导组：当细胞融合率达到100％时，吸弃培养基，添加成脂诱导培养基，每2天换一次新鲜成脂诱导培养基。培养14天，用油红O染色。
结果如图2所示。结果显示：本发明方法制备的人脐带源间充质干细胞具备良好的分化性能，符合干细胞特征。
二、原液中人脐带源间充质干细胞表面标志物鉴定
以3个不同脐带来源(编号分别为Y200001、Y200003、Y210001)的干细胞原液为例，分别调整细胞浓度为2×106/mL。取流式管，分别依次加入Mouse IgG1-FITC、CD19-FITC、CD34-FITC、Mouse IgG1-PE、CD11b-PE、CD73-PE、CD90-PE、CD45-PE、CD105-PE、HLA-DR-PE。抗体加入量均为5μL，分别加入待检的细胞悬液100μL，震荡混匀，室温避光孵育20min。每管加入2mL 1×PBS洗涤，1200rpm离心5min。弃上清，加入200μL 1×PBS重悬，混匀后使用BDFACSCalibur流式细胞仪上机检测，每份样品检测10,000个细胞。
结果如表1所示。结果显示：本发明方法制备的间充质干细胞表面表达CD73、CD90和CD105均大于95％，呈阳性，CD34、CD45、CD11b、CD19和HLA-DR均小于2％，呈阴性，经冻存后细胞表面标志物无变化，符合干细胞表面标志物特征。
表1、原液中间充质干细胞表面标志物检测
脐带来源 Y200001 Y200003 Y210001
CD19 0.69％ 0.26％ 0.79％
CD34 0.34％ 0.11％ 0.79％
CD11b 0.15％ 0.19％ 0.84％
CD73 99.81％ 99.95％ 99.07％
CD90 99.81％ 99.81％ 99.99％
CD45 0.07％ 0.23％ 0.88％
CD105 98.45％ 98.81％ 99.12％
HLA-DR 0.10％ 0.14％ 0.35％
实施例2、人脐带源间充质干细胞冻存制剂的制备及其性能检测
一、人脐带源间充质干细胞冻存制剂的制备
1、将实施例1制备的间充质干细胞原液300g离心8分钟，离心后吸弃全部上清液，收集细胞沉淀。然后分别用表2中的细胞冷冻保护剂(冷冻液)以及细胞密度分组重悬细胞沉淀。
表2、细胞冷冻保护剂以及细胞密度
Figure BDA0003449811240000101
Figure BDA0003449811240000111
2、完成步骤1后，将各组充分混匀的细胞悬液抽入50mL注射器，注入到冻存袋中，每袋灌装12mL。装袋后排空冻存袋内的空气，在管道近冷冻袋0.5cm处进行热合。将冻存袋放入冻存夹内，并装入程序降温仪(赛默飞世尔科技(中国)有限公司，型号：7453)内的冻存支架上。打开液氮罐的阀门，在电脑上设置并确认如下降温程序：
步骤1：起始温度至4℃；
步骤2：1℃/min降至-5℃；
步骤3：20℃/min直到腔体温度-40℃；
步骤4：10℃/min直到腔体温度-20℃；
步骤5：2℃/min直到样品降至-40℃；
步骤6：10℃/min直到样品降至-80℃；
步骤7：结束。
运行程序，进行降温。
3、完成步骤2后，将冻存夹转移至液氮罐转移罐中保存。
二、人脐带源间充质干细胞冻存制剂的细胞活率检测
以3个不同脐带来源(编号分别为Y200001、Y200003、Y210001)的干细胞原液为例，将它们分别按照步骤一所列不同冻存液和密度制备成12组间充质干细胞冻存制剂，冻存一周后取出在37℃中进行复苏，将制剂中细胞均匀混合，取20μL的样品与20μL的AO/PI荧光染料混合均匀，吸取20μL加到Countstar计数板中，使用荧光计数仪进行分析。
结果如图3所示。结果显示：12组制剂活率无显著差别，平均值均高于80％。说明本发明中4种冻存液按照冻存密度为2.5×106个细胞/mL至1×107个细胞/mL制备的细胞制剂复苏后细胞活率良好。
三、不同人脐带源间充质干细胞冻存制剂的表面标志物鉴定
以3个不同脐带来源(编号分别为Y200001、Y200003、Y210001)的干细胞原液为例，将它们分别按照步骤一所列不同冻存液按照5E6/mL密度制备间充质干细胞冻存制剂。冻存细胞复苏后，分别调整细胞浓度至2×106/mL。取流式管，分别依次加入Mouse IgG1-FITC、CD19-FITC、CD34-FITC、Mouse IgG1-PE、CD11b-PE、CD73-PE、CD90-PE、CD45-PE、CD105-PE、HLA-DR-PE。抗体加入量均为5μL，分别加入待检的细胞悬液100μL，震荡混匀，室温避光孵育20min。每管加入2mL 1×PBS洗涤，1200rpm离心5min。弃上清，加入200μL1×PBS重悬，混匀后使用BD FACSCalibur流式细胞仪上机检测，每份样品检测10,000个细胞。
结果如表3-表5所示。结果显示：本发明方法制备的冻存制剂干细胞表面表达CD73、CD90和CD105均大于95％，呈阳性；CD34、CD45、CD11b、CD19和HLA-DR均小于2％，呈阴性。经冻存后细胞表面标志物无变化，符合干细胞表面标志物特征。
表3、Y200001来源脐带制备的间充质干细胞冻存制剂经冻存后细胞表面标志物检测
Figure BDA0003449811240000112
Figure BDA0003449811240000121
表4、Y200003来源脐带制备的间充质干细胞冻存制剂经冻存后细胞表面标志物检测
Figure BDA0003449811240000122
表5、Y210001来源脐带制备的间充质干细胞冻存制剂经冻存后细胞表面标志物检测
Figure BDA0003449811240000123
四、不同人脐带源间充质干细胞冻存制剂的旁分泌能力鉴定
以3个不同脐带来源(编号分别为Y200001、Y200003、Y210001)的干细胞原液为例，将它们分别按照步骤一所列不同冻存液按照5E6/mL密度制备间充质干细胞冻存制剂。冻存细胞复苏后20000/cm2接种于孔板中，置于5％CO2、37℃的培养箱中培养。培养48小时后，离心，收集上清，使用ELISA试剂盒分别检测上清中IL-6、HGF、MMP1、MMP2含量。
结果如表6所示。结果显示：本发明方法制备的不同间充质干细胞冻存制剂具有分泌IL-6、HGF、MMP1和MMP2的能力，从而进行免疫调节。
表6、不同间充质干细胞冻存制剂具有分泌IL-6、HGF、MMP1和MMP2的能力
Figure BDA0003449811240000131
五、不同人脐带源间充质干细胞冻存制剂活性因子mRNA表达水平
以3个不同脐带来源(编号分别为Y200001、Y200003、Y210001)的干细胞原液为例，将它们分别按照步骤一所列不同冻存液按照5E6/mL密度制备间充质干细胞冻存制剂。冻存细胞复苏后20000/cm2接种于孔板中，分别在无血清完全培养基(正常培养组)和加入IFN-γ(终浓度15ng/mL)的无血清完全培养基(炎性刺激组)中进行培养。培养24h后，使用RNA提取试剂盒(TaKaRa，货号：9767)提取总RNA，然后将获得的总RNA使用逆转录试剂盒(赛默飞世尔，货号K1621)逆转录为cDNA，再以获得的cDNA为模板进行QPCR。引物序列分别如下：
CXCL10-F：5’-GGTGAGAAGAGATGTCTGAATCC-3’；
CXCL10-R：5’-GTCCATCCTTGGAAGCACTGCA-3’；
CCL2-F：5’-GCTGTAAGGACATCGCCTACCA-3’；
CCL2-R：5’-AGAATCACCAGCAGCAAGTGTCC-3’；
IDO-F：5’-GCCTGATCTCATAGAGTCTGGC-3’；
IDO-R：5’-TGCATCCCAGAACTAGACGTGC-3’。
QPCR体系如下：上游引物0.4μL；下游引物0.4μL；Premix Ex Taq聚合酶10μL；cDNA2μL；双蒸水7.2μL。
QPCR程序如下：
1)95℃30秒，1个循环；
2)95℃5秒，60℃30秒，40个循环；
3)95℃5秒，60℃1分钟，95℃，1个循环；
4)50℃30秒1个循环。
结果如图4-图6所示。结果显示：炎性环境能诱导MSCs中的功能因子CCL2、CXCL10和IDO1的mRNA表达水平显著上调。说明通过本发明方法制备的间充质干细胞冻存制剂具有良好的免疫调节和促进损伤修复功能。
六、人脐带源间充质干细胞冻存制剂的安全性检测
1、实验材料
供试品C1：按照步骤一中的方法制备得到的间充质干细胞冻存制剂，细胞冷冻保护剂为C1，细胞浓度为1.25×107cells/mL。
供试品溶媒：细胞冷冻保护剂C1。
供试动物：6-7周龄SPF级CD-1小鼠40只，雌雄各半，由浙江维通利华实验动物技术有限公司提供，饲养于昭衍(苏州)新药研究中心有限公司SPF级动物房，适应性喂养1周后，用于安全性检测实验。
2、实验方法
将小鼠按体重随机分为2组，每组给药剂量具体见表7。分组后所有动物单次尾静脉注射给予0.4mL相应供试品C1或供试品溶媒，给药后笼旁观察急性毒性反应至少4小时，随后每周进行体重、摄食量测定，给药后第14天进行解剖及大体观察，异常组织进行组织病理学检查。
表7、实验分组及给药剂量
Figure BDA0003449811240000141
3、实验结果
实验期间，所有动物未见死亡或濒死。供试品C1组1只雄性动物于给药后2-9d可见尾巴远端呈紫红色，考虑为给药中的机械损伤所致，与供试品无关；2只雄性动物于给药后7-14d可见尾巴结痂；3只雄性动物于给药后7-14d可见阴囊结痂，由于以上动物为同笼饲养，且结痂症状出现的时间一致，可能是动物打架所致，与供试品无关。
实验期间，与溶媒对照组相比，供试品C1组雄性动物第一周的体重增长量可见降低(P＜0.05，vs溶媒对照组)，该异常于第二周恢复。具体见表8和表9。
表8、各组雄性小鼠体重及体重增长情况(g，n＝10，Mean±SD)
Figure BDA0003449811240000142
注：*与溶媒对照组比较P＜0.05。
表9、各组雌性小鼠体重及体重增长情况(g，n＝10，Mean±SD)
Figure BDA0003449811240000143
Figure BDA0003449811240000151
实验期间，与溶媒对照组相比，供试品C1组雌、雄动物W1的摄食量较溶媒对照组降低，可能与供试品相关，该异常于第二周恢复。此外，雄性动物W2的摄食量也可见小幅度降低，故考虑不具有毒理学意义。结果具体见表10。
表10、各组小鼠摄食量(g/只/天，n＝10，Mean±SD)
Figure BDA0003449811240000152
注：*与溶媒对照组比较P＜0.05。
所有动物于给药期结束安乐死(D15)，未见供试品相关的大体病变，故未进行组织保留和显微镜观察。
综上所述，人脐带源间充质干细胞冻存制剂(供试品C1)以5.0×106cells/只单次静脉注射给予CD-1小鼠，未见动物死亡，未见供试品相关的毒性反应。在本实验条件下小鼠对供试品C1的最大耐受剂量为5.0×106cells/只。
实施例3、人脐带源间充质干细胞冻存制剂在治疗新型冠状病毒肺炎(COVID-19)中的应用
1、实验材料
供试品C1：按照实施例2步骤一中的方法制备得到的间充质干细胞冻存制剂，细胞冷冻保护剂为C1，细胞浓度分别为1×105cells/mL、1×106cells/mL、1×107cells/mL。
供试品溶媒：细胞冷冻保护剂C1。
供试动物：7～8周龄SPF级雌性hACE2-KI/NIFDC人源化小鼠(hACE2小鼠)9只，由中国食品药品检定研究院提供，饲养于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所P4正压IVC饲养间。
2、实验方法
将供试动物根据体重分层随机分成3组，分别为模型对照组、C1低剂量组和C1高剂量组，每组3只，具体分组情况见表11。
表11、动物分组及剂量设计
Figure BDA0003449811240000153
于分组后二氧化碳浅麻醉所有动物，按照50μL/只滴鼻给予5×105PFU的SARS-CoV-2(HRB26)(SARS-CoV-2(HRB26)记载于文献“Wang J,Shuai L,Wang C,et al.Mouse-adapted SARS-CoV-2replicates efficiently in the upper and lower respiratorytract of BALB/c and C57BL/6J mice[J].Protein&cell,2020,11(10):776-782.”中)，染毒当天为0dpi。分别于1dpi和4dpi进行给药处理，各给药组按表11尾静脉注射给予相应剂量的供试品C1，模型对照组给予等量的供试品溶媒。
给药期间每天观察动物的一般情况。每天1次测量动物体重。于5dpi安乐死所有动物，取部分肺脏进行肺脏病毒载量测定(RT-qPCR)。剩余肺脏(需带部分支气管)固定于4％多聚甲醛中，并通过HE染色方法进行病理学观察。
3、实验结果
攻毒前后各组动物未出现死亡，未见供试品C1相关的不良反应。
供试品C1低、高剂量组体重变化与模型组一致，均于2dpi出现降低趋势；部分时间点给药组体重与模型对照组具有差异，考虑可能与攻毒前各组体重存在差异有关，供试品C1对模型小鼠状态、体重和体重增重无明显影响(表12)。
表12、供试品对COVID-19小鼠体重增长的影响(n＝3，Mean±SD)
Figure BDA0003449811240000161
注：与模型对照组比较**P<0.01，*P<0.05。
与模型对照组比较，供试品C1低、高剂量组肺脏病毒载量未见统计学差异(P>0.05)，但低剂量组发现1只(2F02)未检测出肺脏病毒载量，高剂量组发现2只(3F02和3F03)肺脏病毒载量下降约(1～2log10(copies/g))(表13)，提示供试品C1可能对COVID-19模型小鼠的肺脏病毒载量具有一定降低作用。
表13、供试品对COVID-19小鼠肺组织病毒载量的影响(n＝3，Mean±SD)
Figure BDA0003449811240000162
小血管周围炎性浸润：模型对照组小血管周围炎性浸润为轻-中度；供试品C1低剂量组炎性浸润程度具有改善趋势，为轻微-轻中；供试品C1高剂量组炎性浸润明显改善，为阴性-轻度；提示供试品C1可剂量依赖性改善肺脏小血管周围炎性浸润(表14)。
细支气管周围炎性浸润：模型对照组细支气管周围炎性浸润为轻-中度；供试品C1低剂量组炎性浸润具有改善趋势，为阴性-轻度；供试品C1高剂量组炎性浸润明显改善，为阴性-轻度；提示供试品C1可剂量依赖改善肺脏细支气管周围炎性浸润(表14)。
支气管上皮细胞变性：模型对照组细支气管上皮细胞变性为轻微-轻度；供试品C1低剂量组上皮细胞变性明显改善，为阴性-轻度；供试品C1高剂量组为轻微-轻度；提示供试品C1对肺脏细支气管上皮细胞变性具有明显的改善作用(表14)。
表14、供试品C1对COVID-19小鼠肺组织病理的影响
Figure BDA0003449811240000171
综上所述，供试品C1对COVID-19小鼠肺脏病毒载量和肺组织病理均有一定改善，其中对小血管和细支气管周围炎性浸润改善最显著，起效剂量为1×105cells/只。
实施例4、人脐带源间充质干细胞冻存制剂在治疗特发性肺间质纤维化中的应用
1、实验材料
供试品C1：按照实施例2步骤一中的方法制备得到的间充质干细胞冻存制剂，细胞冷冻保护剂为C1，细胞浓度分别为1×106cells/mL、3×106cells/mL、1×107cells/mL。
供试品溶媒：细胞冷冻保护剂C1。
供试动物：7～10周龄SPF级雄性SD大鼠82只，由浙江维通利华实验动物技术有限公司提供，饲养于昭衍(苏州)新药研究中心有限公司SPF级动物房。
2、实验方法
将供试动物根据体重分为正常对照组(10只)，模型组(72只)，于分组后第1天(D1)和第3天(D3)，模型组气道内雾化给予博莱霉素(BLM)2.5mg/kg(D1)、1mg/kg(D3)建立肺纤维化(PF)模型，正常对照组给予氯化钠注射液。第二次造模后，模型组动物根据体重再次随机分为模型对照组、C1低剂量组、C1中剂量组、C1高剂量组，每组10只，具体分组情况见表15。
表15、动物分组及剂量设计
Figure BDA0003449811240000172
Figure BDA0003449811240000181
C1低剂量组、C1中剂量组、C1高剂量组分别于D4、D7、D10尾静脉给予不同剂量的受试物(具体剂量见表15)，正常对照组和模型对照组分别于D4、D7、D10尾静脉给予供试品溶媒(细胞冷冻保护剂C1)。
D28动物麻醉后，采用肺功能分析系统进行肺顺应性(Cdyn)、气道阻力(RL)、用力肺活量(FVC)等指标检测。随后取全肺组织称重，计算肺脏指数。肺组织称重后，取左肺组织用于羟脯氨酸(HYP)、MMP-2、TIMP-1含量检测。剩余右肺组织及支气管固定后用于组织病理学检查。
3、实验结果
BLM造模后，模型对照组大鼠肺脏重量、肺脏指数均显著升高(P<0.01)，供试品各剂量组均可降低PF模型大鼠肺脏指数(P<0.01)(表16)。
表16、供试品对BLM致PF模型大鼠肺脏指数的影响(n＝10，Mean±SD)
组别 药物剂量 体重(g) 肺脏重量(g) 肺脏指数(％)
正常对照组 -- 453.30±36.69** 1.99±0.33** 0.437±0.056**
模型对照组 -- 290.90±22.18 3.52±0.47 1.209±0.129
C1低剂量组 1×10<sup>6</sup>cells/kg 367.40±59.87** 3.24±0.40 0.907±0.204**
C1中剂量组 3×10<sup>6</sup>cells/kg 404.60±55.33** 3.07±0.38 0.765±0.073**
C1高剂量组 1×10<sup>7</sup>cells/kg 372.60±48.99** 3.15±0.55 0.854±0.160**
注：与模型对照组比较**P<0.01。
模型对照组大鼠Cdyn、FVC较正常对照组明显降低，且RL显著升高。C1各剂量组均可显著提高模型大鼠FVC，其中低剂量组对Cdyn、RL，高剂量组对Cdyn也具有显著改善；提示供试品C1可改善纤维化导致的肺功能受损(表17)。
表17、供试品对BLM致PF模型大鼠肺功能的影响(n＝10，Mean±SD)
组别 药物剂量 Cdyn(mL/cmH<sub>2</sub>O) RL(cmH<sub>2</sub>O) FVC(mL)
正常对照组 -- 0.25±0.06** 0.24±0.06** 12.81±1.61**
模型对照组 -- 0.14±0.03 0.45±0.09 5.48±1.18
C1低剂量组 1×10<sup>6</sup>cells/kg 0.22±0.06** 0.30±0.08** 8.52±1.93**
C1中剂量组 3×10<sup>6</sup>cells/kg 0.19±0.07<sup>p＝0</sup>.07 0.39±0.20 7.86±2.15**
C1高剂量组 1×10<sup>7</sup>cells/kg 0.22±0.10* 0.35±0.18 8.87±2.90**
注：与模型对照组比较**P<0.01，*P<0.05。
模型对照组肺组织HYP、MMP-2、TIMP-1较正常对照组显著升高。C1各组均可显著降低HYP和TIMP-1，低、中剂量组对MMP-2过表达亦有显著抑制，提示供试品C1可抑制促纤维化因子表达，改善胶原沉积，发挥抗PF作用(表18)。
表18、供试品C1对BLM致PF模型大鼠纤维化相关指标的影响(n＝10，Mean±SD)
Figure BDA0003449811240000182
Figure BDA0003449811240000191
注：与模型对照组比较**P<0.01，*P<0.05。
病理：BLM造模后，模型对照组动物肺泡发生中度至重度多灶性炎细胞浸润，肺脏间质/肺泡中度至重度多灶性纤维化，同时伴有不同程度的多灶性肺泡腔扩张、巨噬细胞聚集、出血/淤血、纤维素性渗出。C1可剂量依赖性改善肺间质/气管/血管周围/肺泡炎性浸润及纤维化，其中高剂量组最显著(表19，图7)。
表19、供试品对BLM致PF模型大鼠肺组织病理的影响(n＝10)
Figure BDA0003449811240000192
注：“-”没有病变，“+”轻微；“++”轻度；“+++”中度“++++”明显；“+++++”严重。
综上所述，供试品C1可通过抑制促纤维化因子表达，改善肺组织胶原沉积，对BLM导致的肺功能损伤、肺部炎症和纤维化均具有显著改善，提示供试品C1具有较好的抗肺间质纤维化效果，大鼠有效剂量为1×106cells/kg。
实施例5、人脐带源间充质干细胞冻存制剂在治疗急性肺损伤中的应用
1、实验材料
供试品C1：按照实施例2步骤一中的方法制备得到的间充质干细胞冻存制剂，细胞冷冻保护剂为C1，细胞浓度分别为1×106cells/mL、3×106cells/mL、1×107cells/mL。
供试品溶媒：细胞冷冻保护剂C1。
供试动物：6～8周龄SPF级雄性SD大鼠70只，由浙江维通利华实验动物技术有限公司提供，饲养于昭衍(苏州)新药研究中心有限公司SPF级动物房。
2、实验方法
将检疫合格的70只雄性大鼠按体重随机分为5组，具体见表20。
表20、动物分组及剂量设计
Figure BDA0003449811240000193
于分组后第1天(D1)和第3天(D3)，模型对照组和C1各剂量组动物均按1mL/kg的给药容积气道内雾化给予脂多糖(LPS)5mg/kg(D1)、0.8mg/kg(D3)建立急性肺损伤(ALI)模型，正常对照组给予氯化钠注射液。D1、D3给予LPS 4～6h后按表20尾静脉给予不同剂量受试物，正常对照组、模型对照组给予等量的供试品溶媒。
D4大鼠麻醉后取动脉血0.2mL进行血气分析。随后收集肺泡灌洗液2mL，离心后用1mL PBS重悬沉底，用全自动血球分析仪进行白细胞及分类计数。取动物右肺中叶组织并称重，然后置于60℃烘箱72h再次称重，计算湿/干重比值。剩余右肺组织及支气管置于10％中性缓冲福尔马林溶液固定后进行病理学检测。
试验数据均以“平均数±标准差”表示，采用统计学软件SPSS 13.0和/或GraphPadPrism5对数据进行处理，以P<0.05为差异有统计学意义。
3、实验方法
C1可剂量依赖性降低ALI大鼠肺湿干重比，C1中、高剂量组与模型对照组比较具有显著差异；提示供试品C1可降低肺脏含水量，改善肺水肿(表21)。
表21、供试品C1对LPS致ALI模型大鼠肺含水量的影响(n＝10，Mean±SD)
组别 药物剂量 肺脏湿干比
正常对照组 -- 4.33±0.19**
模型对照组 -- 5.17±0.22
C1低剂量组 1×10<sup>6</sup>cells/kg 4.95±0.29<sup>P＝0.07</sup>
C1中剂量组 3×10<sup>6</sup>cells/kg 4.91±0.19*
C1高剂量组 1×10<sup>7</sup>cells/kg 4.64±0.18**
注：与模型对照组比较**P<0.01，*P<0.05。
C1各组均可显著增加模型对照组大鼠PCO2，低剂量组PO2和sO2、中剂量组PO2较模型对照组亦显著升高；提示供试品C1对ALI大鼠急性呼吸窘迫综合征(ARDS)具有改善(表22)。
表22、供试品对LPS致ALI模型大鼠动脉血气分析结果的影响(n＝10，Mean±SD)
组别 PO<sub>2</sub> sO<sub>2</sub> PCO<sub>2</sub> pH
正常对照组 98.44±11.47** 97.11±1.05* 45.78±7.99** 7.38±0.06**
模型对照组 77.10±8.12 95.70±1.57 33.32±6.52 7.45±0.04
C1低剂量组 93.00±10.90** 97.30±1.16* 39.71±4.33* 7.44±0.03
C1中剂量组 88.40±10.62* 96.60±1.43 42.18±4.33** 7.43±0.03
C1高剂量组 86.40±13.13<sup>P＝0</sup>.07 96.10±2.02 43.66±5.39** 7.42±0.03
注：与模型对照组比较**P<0.01,*P<0.05。
C1各剂量组对ALI大鼠BALF中总蛋白含量、白细胞及分类计数的异常升高均有显著降低，提示供试品C1对肺部炎症具有明显的的改善作用(表23)。
表23、供试品对ALI模型大鼠BALF中总蛋白、白细胞分类计数的影响(n＝10，Mean±SD)
Figure BDA0003449811240000201
注：与模型对照组比较**P<0.01，*P<0.05。
病理：模型动物可见间质/肺泡炎细胞浸润、支气管相关淋巴组织增生和肺泡出血，C1各剂量组对LPS致ALI模型大鼠肺组织炎性浸润和淋巴组织增生的病变程度均有改善，提示供试品C1对肺炎有一定治疗作用(表24，图8)。
表24、供试品对ALI模型大鼠肺组织病理的影响(n＝10)
Figure BDA0003449811240000211
注：病变程度“-”表示正常；“+”表示轻微；“++”表示轻度；“+++”表示中度。
综上所述，供试品C1对LPS导致的肺部炎症、肺水肿及呼吸窘迫均具有显著改善，提示供试品C1具有良好的抗ALI效果，大鼠有效剂量为1×106cells/kg。
实施例6、人脐带源间充质干细胞冻存制剂在治疗肝纤维化中的应用
1、实验材料
供试品：按照实施例2步骤一中的方法制备得到的间充质干细胞冻存制剂，细胞冷冻保护剂为C1，细胞浓度分别为1×106cells/mL、5×106cells/mL、1.5×107cells/mL。
供试品溶媒：细胞冷冻保护剂C1。
供试动物：6～8周龄SPF级雄性SD大鼠20只，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，饲养于和泽生物科技有限公司动物房。
2、实验方法
将检疫合格的大鼠每周2次腹腔注射CCL4，连续8周建立肝纤维模型。造模后随机分为4组，具体见表25。
表25、实验分组及剂量设计
Figure BDA0003449811240000212
分组后，按表25单次尾静脉注射给予相应剂量的C1，模型对照组给予等PBS。1周后所有大鼠腹腔注射给予一次造模剂量的CCL4。在治疗后第2周采血，分离血清，检测转氨酶及肝纤四项，随后处死动物取肝脏称重，计算肝脏指数，并采用HE染色和Masson染色进行肝组织病理学检测。
3、实验结果
供试品C1对肝纤维化模型大鼠肝脏重量和肝脏系数具有一定的降低趋势，但与模型对照组比较未见统计学差异(表26)。
表26、供试品对肝纤维化模型大鼠肝脏系数的影响(n＝5，Mean±SD)
组别 药物剂量 肝脏重量(g) 肝脏系数(％)
模型对照组 -- 20.36±4.41 3.82±0.44
C1低剂量组 1×10<sup>6</sup>cells/只 17.74±2.85 3.33±0.42
C1中剂量组 5×10<sup>6</sup>cells/只 18.63±3.89 3.70±0.60
C1高剂量组 1.5×10<sup>7</sup>cells/只 19.60±2.71 3.42±0.25
C1各剂量组对模型大鼠AST具有一定改善，其中C1中剂量组血清AST水平较模型对照显著降低，但对ALT未见明显改善(表27)。
表27、供试品对肝纤维化模型大鼠肝功能的影响(n＝5，Mean±SD)
组别 剂量 ALT AST
模型对照组 -- 47.42±7.60 126.14±12.59
C1低剂量组 1×10<sup>6</sup>cells/只 46.30±9.43 102.24±24.54<sup>p＝0.08</sup>
C1中剂量组 5×10<sup>6</sup>cells/只 38.70±9.95 81.43±25.92*
C1高剂量组 1.5×10<sup>7</sup>cells/只 41.68±13.82 113.20±18.24
注：与模型对照组比较*P<0.05。
C1各剂量组对肝纤四项指标均具有一定的改善，其中C1低、高剂量组可显著降低模型大鼠HA、CIV含量，中剂量组可显著降低PCIII含量(表28)。
表28、供试品对肝纤维化大鼠肝纤四项的影响(n＝5，Mean±SD)
组别 剂量(cells/只) HA(ng/mL) LN(ng/mL) PCIII(ng/mL) CIV(ng/mL)
模型对照 -- 182.70±54.47 28.22±12.26 27.30±8.78 7.74±1.81
C1低剂量 1×10<sup>6</sup> 89.77±13.11** 40.81±10.24 15.74±19.41 4.02±2.59*
C1中剂量 5×10<sup>6</sup> 113.89±46.14 33.91±12.82 11.18±5.99* 5.50±2.87
C1高剂量 1.5×10<sup>7</sup> 108.36±34.57* 31.08±16.33 15.40±14.04 2.65±1.53**
注：与模型对照组比较**P<0.01，*P<0.05。
病理：模型对照大鼠肝脏结构紊乱，且有轻度脂肪变性和胶原纤维沉积增粗；C1低剂量组胶原消退不明显，中、高剂量组肝脏结构和胶原沉积均有明显改善。
综上所述，供试品C1对CCL4导致的肝功能异常和肝纤维化具有一定的改善作用，大鼠有效剂量为5×106cells/只。
实施例7、人脐带源间充质干细胞冻存制剂在治疗克罗恩病中的应用
1、实验材料
供试品C1：按照实施例2步骤一中的方法制备得到的间充质干细胞冻存制剂，细胞冷冻保护剂为C1，细胞浓度分别为1×106cells/mL、2×106cells/mL、1×107cells/mL、2×107cells/mL。
供试品溶媒：细胞冷冻保护剂C1。
供试动物：6～8周龄SPF级雄性SD大鼠46只，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，饲养于北京昭衍新药研究中心股份有限公司SPF级动物房。
2、实验方法
将检疫合格后大鼠按体重随机分为6组，具体分组情况见表29。
表29、动物分组及剂量设计
组别 动物数(只) 剂量(cells/只) 浓度(cells/mL) 给药容量(mL/只) 给药方式
正常对照组 6 0 0 1 --
模型对照组 8 0 0 1 --
C1腹腔低剂量 8 1×10<sup>6</sup> 1×10<sup>6</sup> 1 腹腔注射
C1腹腔高剂量 8 1×10<sup>7</sup> 1×10<sup>7</sup> 1 腹腔注射
C1静脉低剂量 8 1×10<sup>6</sup> 2×10<sup>6</sup> 0.5 尾静脉注射
C1静脉高剂量 8 1×10<sup>7</sup> 2×10<sup>7</sup> 0.5 尾静脉注射
分组后大鼠结肠给予二硝基苯磺酸(DNBS，3.0mL/kg)建立克罗恩病模型，造模后次日(D1)和第五天(D5)按表29给予相应剂量的受试物，正常对照组、模型对照组给予等量的供试品溶媒。
DNBS造模后每天称量体重，并观察记录大便性状、肉眼血便情况，按表30评定疾病活动指数(DAI)。DAI＝(体重降低计分+大便性状计分+便血计分)/3。D6安乐死所有动物，收集结肠并测量长度和溃疡面积，随后固定结肠组织用于组织病理学检查。
表30、临床症状评分标准
评分 体重降低 大便性状 便血
0 ≤0 正常 便潜血阴性
1 >0～≤5％ 轻度稀便 便潜血阳性
2 >5％～≤10％ 稀便 便潜血强阳性
3 >10％～≤20％ 水样便 轻度便血
4 >20％ 严重腹泻 重度便血
造模后动物体重增加速度明显降低，与正常对照组比，其他各组体重在D1～D6均显著降低，其他各组之间无统计学差异(表31)。
表31、供试品C1对克罗恩病模型大鼠体重的影响(n＝6-8，Mean±SD)
组别 分组前 D1 D2 D3 D4 D5 D6
正常对照组 238.17±11.7 264.2±9.6 277.3±9.5 286.5±10.0 298.3±12.0 306.5±12.2 316.8±14.0
模型对照组 238.1±9.0 231.0±9.0 225.1±8.5 233.9±10.3 242.1±15.1 248.1±19.7 255.4±24.8
C1腹腔低剂量组 239.1±9.7 228.3±10.3 226.8±10.7 231.4±16.2 237.8±24.0 242.8±24.7 248.0±31.9
C1腹腔高剂量组 235.3±8.3 228.1±9.9 221.9±16.7 224.0±18.6 231.5±16.4 241.0±9.9 252.2±22.0
C1静脉低剂量组 235.4±9.3 227.6±8.2 221.6±5.3 224.3±5.8 230.6±10.1 240.4±22.4 253.4±20.3
C1静脉高剂量组 240.8±10.6 234.5±10.1 229.5±11.5 238.3±13.0 248.8±17.7 251.1±24.8 259.6±27.2
注：与模型对照组比较**P<0.01，*P<0.05。
造模后各组DAI评分明显增加，随后逐渐降低，至D5、D6腹腔注射高剂量组、静脉注射低剂量组对DAI评分有明显的降低趋势，D5腹腔注射高剂量组较模型对照组降低58.00％，D6静脉注射低剂量组较模型对照组降33.33％(表32)。
表32、供试品对克罗恩病模型大鼠DAI评分的影响(n＝6-8，Mean±SD)
组别 D1 D2 D3 D4 D5 D6
正常对照 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00
模型对照 1.88±0.44 1.96±0.49 1.79±0.62 1.04±0.77 1.00±0.56 0.75±0.66
C1腹腔低 2.58±0.35 2.08±0.58 2.08±0.50 1.17±0.64 1.42±0.97 0.62±0.49
C1腹腔高 2.46±0.43 2.00±0.89 2.00±0.89 1.29±1.03 0.42±0.66 0.50±0.59
C1静脉低 2.00±0.25 2.04±0.28 1.92±0.53 1.04±0.74 0.87±0.85 0.33±0.44
C1静脉高 1.88±0.25 2.04±0.28 1.83±0.43 1.13±0.75 0.92±0.92 0.50±0.40
与正常对照组比较，各组结肠长度均显著降低，溃疡面积增加，C1腹腔注射高剂量组对溃疡面积具有改善趋势，但对结肠长度未见明显改善(表33)。
表33、供试品C1对克罗恩病模型大鼠结肠长度和溃疡面积影响(n＝6-8，Mean±SD)
Figure BDA0003449811240000231
Figure BDA0003449811240000241
D6安乐死动物大体剖检可见模型对照组及C1各组结肠不同面积黑变，模型对照组发生率为7/8；C1腹腔低剂量组发生率为5/8；C1腹腔高剂量组发生率为2/6；C1静脉低剂量组发生率为3/7；C1静脉高剂量组发生率为3/7；各给药组对肉眼溃疡发生率均有一定降低。
镜下可见模型对照组、C1各给药组的结肠黏膜溃疡形成，主要表现为黏膜上皮坏死脱落，肠壁全层(黏膜、黏膜下层、肌层、外膜)中性粒细胞渗出，肉芽组织形成；还可见黏膜出血以及隐窝脓肿，供试品C1未见明显改善。
综上所述，腹腔注射供试品C1(107个/只，2次/周)和尾静脉注射供试品C1(106个/只，2次/周)对造模引起的结肠损伤有一定缓解趋势。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.一种人脐带源间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：
(1)培养离体的脐带组织块，待从所述脐带组织块爬出的间充质干细胞的细胞融合度为40％-60％时，得到P0代间充质干细胞；
(2)完成步骤(1)后，将所述P0代间充质干细胞进行传代培养，培养至细胞融合度为60％-80％时，得到P1代间充质干细胞；
(3)完成步骤(2)后，将所述P1代间充质干细胞进行传代培养，培养至细胞融合度为60％-80％时，得到P2代间充质干细胞；
(4)完成步骤(3)后，将所述P2代间充质干细胞进行细胞冻存，得到冻存的P2代种子库细胞；
(5)完成步骤(4)后，将所述冻存的P2代种子库细胞复苏并进行传代培养，培养至细胞融合度为60％-80％时，得到P3代间充质干细胞；
(6)完成步骤(5)后，将所述P3代间充质干细胞进行传代培养，培养至细胞融合度为60％-80％时，得到P4代间充质干细胞；
(7)完成步骤(6)后，将所述P4代间充质干细胞进行细胞冻存，得到冻存的P4代工作库细胞；
(8)完成步骤(7)后，将所述冻存的P4代工作库细胞复苏并进行传代培养，培养至细胞融合度为60％-80％时，得到P5代间充质干细胞；
(9)完成步骤(8)后，将所述P5代间充质干细胞依次经过消化、洗涤和重悬后，得到所述人脐带源间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)中均采用胎牛血清完全培养基进行细胞培养；
或，所述步骤(5)、步骤(6)、步骤(8)中均采用无血清完全培养基进行细胞培养；
或，所述步骤(4)中，所述细胞冻存的方法为用冻存液甲重悬细胞，得到细胞悬液；所述细胞悬液的浓度为3×106个细胞/mL；
或，所述冻存液甲由胎牛血清和二甲基亚砜组成；
或，所述胎牛血清和所述二甲基亚砜的体积比为9:1；
或，所述步骤(7)中，所述细胞冻存的方法为用冻存液乙重悬细胞，得到细胞悬液；所述细胞悬液的浓度为8×106个细胞/mL；
或，所述冻存液乙由无血清培养基基础、二甲基亚砜和人血白蛋白溶液组成；
或，所述无血清培养基基础、所述二甲基亚砜和所述人血白蛋白溶液的体积比为7:2:1。
3.按照权利要求1或2所述方法制备得到的人脐带源间充质干细胞。
4.权利要求3所述的人脐带源间充质干细胞在制备人脐带源间充质干细胞冻存制剂中的应用。
5.一种人脐带源间充质干细胞冻存制剂，其包括权利要求3所述的人脐带源间充质干细胞和细胞冷冻保护剂。
6.根据权利要求5所述的人脐带源间充质干细胞冻存制剂，其特征在于：所述细胞冷冻保护剂由复方电解质溶液、二甲基亚砜、右旋糖酐40氯化钠注射液和人血白蛋白溶液组成；
或，所述复方电解质溶液、所述二甲基亚砜、所述右旋糖酐40氯化钠注射液和所述人血白蛋白溶液的体积比为(70-80)：(5-10)：(5-10)：(5-10)；
或，所述人脐带源间充质干细胞在所述人脐带源间充质干细胞冻存制剂中的浓度为2.5×106-1×107个细胞/mL。
7.权利要求5或6所述的人脐带源间充质干细胞冻存制剂的制备方法，包括如下步骤：用细胞冷冻保护剂重悬权利要求3所述的人脐带源间充质干细胞，然后将获得的细胞悬液进行降温处理，得到所述人脐带源间充质干细胞冻存制剂。
8.权利要求3所述的人脐带源间充质干细胞或权利要求5或6所述的人脐带源间充质干细胞冻存制剂或按照权利要求7所述方法制备得到的人脐带源间充质干细胞冻存制剂在如下N1)-N10)任一种中的应用：
N1)制备预防和/或治疗新型冠状病毒所致疾病的产品；
N2)制备预防和/或治疗特发性肺间质纤维化的产品；
N3)制备预防和/或治疗急性肺损伤的产品；
N4)制备预防和/或治疗肝纤维化的产品；
N5)制备预防和/或治疗克罗恩病的产品；
N6)预防和/或治疗新型冠状病毒所致疾病；
N7)预防和/或治疗特发性肺间质纤维化；
N8)预防和/或治疗急性肺损伤；
N9)预防和/或治疗肝纤维化；
N10)预防和/或治疗克罗恩病。
9.一种产品，其活性成分为权利要求3所述的人脐带源间充质干细胞或权利要求5或6所述的人脐带源间充质干细胞冻存制剂或按照权利要求7所述方法制备得到的人脐带源间充质干细胞冻存制剂；所述产品的功能为M1)-M5)中任一种：
M1)预防和/或治疗新型冠状病毒所致疾病；
M2)预防和/或治疗特发性肺间质纤维化；
M3)预防和/或治疗急性肺损伤；
M4)预防和/或治疗肝纤维化；
M5)预防和/或治疗克罗恩病。
10.一种治疗新型冠状病毒所致疾病或特发性肺间质纤维化或急性肺损伤或肝纤维化或克罗恩病的方法，包括如下步骤：向新型冠状病毒所致疾病患者或特发性肺间质纤维化患者或急性肺损伤患者或肝纤维化患者或克罗恩病患者施用权利要求3所述的人脐带源间充质干细胞或权利要求5或6所述的人脐带源间充质干细胞冻存制剂或按照权利要求7所述方法制备得到的人脐带源间充质干细胞冻存制剂，使所述患者得到治疗。
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